Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng các flavonoid có trong Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin và acid clorogenic bằng phương pháp UHPLC-MS. Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC FLAVONOID
VÀ ACID CLOROGENIC TRONG NỮ LANG (VALERIANA HARDWICKII)
BẰNG UHPLC-MS
Huỳnh Lời * , Nguyễn Thùy Vi * , Trần Hùng **
TÓM TẮT
Mở đầu: Nữ lang (Valeriana hardwickii Wall Caprifoliaceae) đã được dùng từ lâu trong y học cổ
truyền để điều trị mất ngủ, chống co giật, chống mệt mỏi và rối loạn chu kỳ kinh nguyệt Ngoài ra, dược liệu này còn dùng ngoài để điều trị côn trùng đốt và các bệnh ngoài da Cho tới nay, các công trình nghiên cứu về Nữ lang chủ yếu là phân tích các thành phần bay hơi Ngoài ra, các thành phần khác được phân lập
như các iridoid, flavonoid, triterpen Về định tính, định lượng, chưa có nhiều tài liệu công bố
Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng các flavonoid có trong
Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin và acid clorogenic bằng phương pháp UHPLC-MS Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam
Nguyên liệu và phương pháp: Nguyên liệu là cây Nữ lang (V hardwickii) thu hái mọc hoang tại
Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt vào tháng 4/2015 Nguyên liệu được định danh bằng cách so sánh về mô tả hình thái thực vật với các thông tin trên các tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015 Hệ dung môi và điều kiện MS được tối ưu hóa Phương pháp được đánh giá với tính tương thích hệ thống, tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ theo hướng dẫn của ICH
Kết quả: Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a formic 0,1% trong acetonitril (B),
gradient từ 90% A đến 5% A, thời gian phân tích 14 phút, tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột là
30 o C và thể tích tiêm mẫu là 3 ml Điều kiện phân tích khối phổ được thiết lập với thông số capillary voltage
ở 0,8 kV; cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao quản được duy trì ở 350 ºC Tốc độ khí khử dung môi (desolvation gas) là 300 L/h Phổ khối của các chất phân tích được ghi nhận ở chế độ ion dương (positive) Sắc kí đồ của các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 100-1000) và SIR (single ion recording) Chế độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z 739,69; và linarin ở m/z 593,54 Tính tương thích hệ thống đạt với thông số thời gian lưu và diện tích đỉnh các pic nhỏ hơn 2% Tính tuyến tính với R 2 ~ 0,999 và khoảng tuyến tính các hợp chất
có nồng độ 0,7-120 mg/ml Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5% Tỷ lệ phục hồi 99-106% Giới hạn phát hiện là của a clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, linarin lần lượt là 0,029; 0,0010; 0,00020; 0,015 mg/ml Acid clorogenic có trong các bộ phận của V hardwickii bao gồm lá là 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong
lá V hardwickii bao gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% và linarin là 1,95% Acid clorogenic
trong rễ và lá của V officinalis cũng được định lượng với hàm lượng lần lượt là 5,3% và 1,45%
Kết luận: Phương pháp UHPLC-MS đã được xây dựng và được đánh giá theo hướng dẫn của ICH
Các điều kiện phân tích đã được thiết lập bao gồm các điều kiện về phổ khối, tính tương thích hệ thống tính
* Trung Tâm Khoa Học Công Nghệ Dược Sài Gòn (SAPHARCEN), Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
**Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Hùng ĐT: 02838295641 Email: tranhung@uphcm.edu.vn
Trang 2tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng Hàm lượng các hợp chất đã được định lượng bao gồm acid clorogenic,
rhoifolin, neobudofficid, và linarin trong V hardwickii và acid clorogenic trong V officinalis
Từ khóa: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS
ABSTRACT
QUANTITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS AND CHLOROGENIC ACID IN VALERIANA
HARDWICKII BY UHPLC-MS
Huynh Loi, Nguyen Thuy Vi, Tran Hung
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 12 – 23
Background and objectives: V hardwickii, “Nữ lang in Vietnamese”, are used in Vietnam as a
traditional medicine with anti-convulsant, sedative, anti-fatigue, and anti-dysmenorrheal properties The topical uses of aerial parts are the treatment of insect bites and various skin diseases Volatile compounds were reported Flavonoids, iridoids, terpenoids are also isolated from Valeriana hardwickii The aim of this study was to develop the UHPLC-MS method for quantitative analysis of flavonoids including linarin, neobudofficide, rhoifolin and chlorogenic acid from Valeriana hardwickii
Material and method: Nữ lang (Valeriana hardwickii) was collected in Cổng Trời (Bidoup - núi Bà),
Đà Lạt in April 2015 V officinalis was colleced in Botanic Garden of Vetmeduni – Vienna in April 2015 The mobile phase and MS conditon were optimized The analytical method was validated for system suitability, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) according to International Council on Harmonization (ICH) Guidelines
Results: The method was developed using mobile phase including formic acid 0.1% (A) – formic acid
0.1% in acetonitril (B), gradient from 90% A to 5% A, 14 min run time, 0.7 ml/min flow rate, 30oC column temperature, 3 ml injection volume MS condition were set as 0.8 kV capillary voltage; 15 eV cone voltage, 350 ºC capillary temperature, 300 L/h desolvation gas, ESI+-MS mode, full scan at m/z 100-1000, SIR (single ion recording) mode Chromatogram was recorded at m/z 355.31 for chlorogenic acid; at m/z 579.52 for rhoifolin; at m/z 739.69 for neobudofficid; and at 593.54 for linarin System is suitable for analysis with RSD of retension time and peak area below 2% The method was found to be linear within the ranges of 0.7-120 mg/ml and R2 ~ 0,999 The precision was determined with RSD < 5% The LOD was 0.029; 0.0010; 0.00020; and 0.015 mg/ml for chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin respectively The recovery ranged 99-106% The content of chlorogenic acid is 1.76%, 8.23% and 1.68% in leaves, stems and roots, respectively The content of flavonoids in leaves including rhoifolin, neobudofficid, and linarin is 0.86%, 0.19% and 1.95%, respectively Acid clorogenic from the roots and leaves of V officinalis was also determined with the content of 5.3% and 1.45%, respectively
Conclusions: The UHPLC-MS method was successfully developed and validated The MS condition
was optimized System suitability, linearity, range, precision, recovery was determined The content of chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin in Valeriana hardwickii was also determined Chlorogenic acid in V officinalis was successful quantitative
Key words: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chi Valeriana trước đây thuộc họ
Valerianaceae (họ Nữ lang) và hiện nay được
Ở châu Á, chi Valeriana có các loài V
pseudofficinalis, V fauriei, V jatamansi, V hardwickii, Nardostachys jatamansi (2,3,18,19) Ở
Trang 3nước ta có 2 loài: V hardwickii (Nữ lang) và V
jatamansi (Sì to)(22) Thành phần hóa học chi
Valeriana yếu chứa tinh dầu, iridoid
(valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid
phenol, lignan, alkaloid Ngoài ra còn có
amino acid (arginin, GABA, glutamin,
tyrosin), acid béo, cholin và các chất vô cơ
khác(10) Trên thế giới V hardwickii mọc ở Ấn
Indonesia Ở nuớc ta, Nữ lang (V hardwickii)
mọc ở Ô Quý Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm
Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng Văn,
Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh),
Kon Tum (Đắk Tô: Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà
Lạt)(8) Cho đến nay, nghiên cứu hoá học trên
loài V hardwickii không nhiều Năm 1989, Đỗ
Ngọc Thanh và cộng sự đã phân lập được 2
thành phần từ V hardwickii ký hiệu là N1, N2
chính trong tinh dầu V hardwickii var
arnottiana là valeracetat và hàm lượng tinh dầu
Hymalaya thành phần chính là methyl
linoleate(16) Tinh dầu trong Valeriana hardwickii
ở Việt nam có thành phần chủ yếu là bornyl
acetat(13) Về phân lập, có 2 công trình nghiên
cứu trên cây này Epoxysesquithujen được
phân lập trong tinh dầu V hardwickii var
hardwickii (6) Các chất sitosterol, daucosterol,
syzalterin, 6-methylapigenin,
neodiosmin, rhoifolin, valeclorin, isovaleroxy
valtrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic,
bornyl ferulat, bornyl caffeat cũng được phân
lập từ V hardwickii(5,12) Cho đến nay, ít có công
trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của V
hardwickii Cao chiết thân rễ V hardwickii gây
ra sự ức chế phụ thuộc nồng độ sự co thắt tự
phát hay sự co thắt gây bởi kali trên ruột chay
thỏ, do đó thể hiện tác dụng chống co thắt(1)
Các cao chiết từ V hardwickii bao gồm cao
nước, cao ethanol 45% và cao DCM có tác
isovaleroxy valtrat hydrin được phân lập
từ V hardwickii không có độc tính trên
dòng tế bào này(14) Theo y học cổ truyền,
Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác động vào 2 kinh: tâm, can Cây có tác dụng ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thông
thuốc thần kinh tim, chống co thắt; cả cây dùng làm thuốc chữa phong thấp, đau dạ dày, điều kinh, sốt ở trẻ em(23) Ở Ấn Độ,
thân rễ của V hardwickii được dùng như thân rễ V officinalis để chữa hysteria, động
kinh, chứng múa giật, chứng loạn thần kinh, chấn thương thời chiến, chứng loạn thần kinh chức năng Thân rễ cũng dùng để làm hương liệu Ở Trung Quốc, toàn cây và thân rễ được dùng trị thần kinh suy nhược
và mất ngủ; có nơi dùng trị kinh nguyệt không đều, đòn ngã tổn thương và phong thấp đau xương(22) Ở Pakistan, Miến Điện
và Srilanka, V hardwickii được sử dụng để
làm gia vị cũng như làm thuốc Nữ lang được dùng làm thuốc toát mồ hôi, phòng bệnh phát lại có định kỳ, chất kích thích, thuốc bổ não, thuốc chống động kinh, thuốc tẩy giun, thuốc an thần, lợi tiểu, thuốc kích thích tình dục, thuốc điều kinh, chống co
thắt, trị tiêu chảy(1) Nữ lang V hardwickii
được dùng với liều 10 g hãm với 100 ml nước sôi, để nguội uống trong ngày hoặc nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4 g/ ngày, có thể thái nhỏ dược liệu, ngâm cồn 60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g pha loãng, ngoài ra còn dùng dạng cao mềm, ngày dùng 1-4 g(8) Cho đến nay, công trình nghiên cứu về phân tích định lượng các
thành phần trong Valeriana hardwickii chưa
đuợc công bố Công trình nghiên cứu này là lần đầu tiên công bố về định lượng các
flavonoid, acid clorogenic trong V hardwickii
bằng UHPLC-MS
Trang 4NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Nguyên liệu là cây Nữ lang (V hardwickii)
thu hái mọc hoang tại Cổng Trời (vùng
Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt Nguyên
liệu được định danh bằng cách so sánh về
mô tả hình thái thực vật với các thông tin
trên các tài liệu tham khảo thực vật học
được thu hái 4/2015 và được lưu tại Bộ môn
Dược liệu, Khoa dược, Đại học Y Dược TP
Hồ Chí Minh số lưu mẫu 01-BMDL
Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại
vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna,
Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015
Mẫu được lưu tại Viện thực vật ứng dụng và
Pharmacognosy) thuộc trường Vetmeduni với
số lưu IAB2012-VAL01
Dung môi, hóa chất
Acid formic, acetonitril được cung cấp bời
Merck (Đức) Acid clorogenic được cung cấp
bởi Merck (Đức), rhoifolin, neobudofficid và
linarin là các hợp chất đối chiếu phân lập
trong nghiên cứu trước đây(12), độ tinh khiết
HPLC lần lượt là 97,2%, 99,2% và 98,4%
Trang thiết bị nghiên cứu
H-class với đầu dò MS QDa (REF186006511), cột
Empower 3
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu
Khảo sát lần lượt các dung môi là MeOH
với nồng độ khác nhau, điều kiện nhiệt độ,
thời gian chiết và số lần chiết sao cho các điều
kiện chiết cho hiệu suất chiết cao nhất
Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải
Khảo sát trên hai dung môi là acid formic
0,1% trong MeOH và acid formic 0,1% trong
acetonitril ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân đối của đỉnh đạt yêu cầu định lượng
Các điều kiện sắc ký được khảo sát trên hai
kỹ thuật rửa giải đẳng dòng (isocratic) và chương trình dung môi (gradient) để chọn điều kiện sắc ký có sự phân tách các pic
Khảo sát điều kiện MS
Điều kiện MS được điều chỉnh bằng thủ công sao cho ion hóa tốt nhất Các thông số được thăm dò bao gồm điện thế cone (cone voltage), điện thế mao quả (capillary voltage), nhiệt độ của mao quản, phương thức chọn ion (positive hay negative)
Khảo sát tính tương thích hệ thống
Tiến hành: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối
chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu; diện tích pic cần định lượng phải ≤ 2%; hệ số bất đối
định lượng Rs ≥ 1,5(4,7)
Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu,
mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu
Sắc ký đồ mẫu trắng không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ của mẫu đối chiếu Khi thêm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic được chuẩn hóa so với mẫu thử ban đầu
Tính tuyến tính
Pha các hợp chất cần định lượng trong MeOH để có dung dịch với nồng độ tăng dần Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Kết quả được đánh giá bằng cách tính đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu, phương trình ŷ= ax
Trang 5Yêu cầu: có sự tương quan tuyến tính giữa
diện tích pic (hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn
hóa) với nồng độ chất đối chiếu ở khoảng
nồng độ khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,995
Độ lặp lại
Thực hiện định lượng trên 6 dịch chiết
mẫu thử khác nhau Độ lặp lại được đánh giá
dựa vào RSD của hàm lượng các chất phân
tích có trong bột lá Nữ lang Mỗi mẫu định
lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình(7)
Độ đúng
Độ đúng là tỷ lệ phục hồi giữa nồng độ
chất đối chiếu tìm thấy so với lượng chất đối
chiếu thêm vào Thêm vào mẫu thử dược liệu
một lượng chất đối chiếu 10%, 20%, 30% so với
hàm lượng chất phân tích có trong mẫu thử,
tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ
thực hiện trên 3 mẫu
Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi trong khoảng 90 –
107%(11)
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Hai giới hạn này được tính trên tỷ lệ tín hiệu (S) với tín hiệu nhiễu đường nền (N) LOD và LOQ được tính toán theo tỷ lệ S/N=3/1 và 10/1 theo thứ tự dựa theo kết quả thực nghiệm
Áp dụng quy trình định lượng
Sau khi xây dựng quy trình định lượng, quy trình được áp dụng để định lượng các thành phần có trong thân và rễ của Nữ lang
(V hardwickii) và trong rễ và lá của V
officinalis
KẾT QUẢ
Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu
Khảo sát dung môi chiết
Dung môi chiết đuợc khảo sát với phần trăm MeOH khác nhau Kết quả cho thấy MeOH 40% cho hiệu suất chiết cao nhất, vì vậy dung môi MeOH 40% dùng để chiết các thành phần định lượng từ lá Nữ lang
Bảng 1: Diện tích đỉnh các polyphenol và dung môi chiết trong khảo sát quy trình định lượng
Acid clorogenic 3061530 2721360 3401700 3571785 3061530 3231615 Rhoifoolin 210245 194555 209199 173635 215475 171899 Neobudofficid 16917 18646 18590 15244 16359 18962 Linarin 454553 341823 363642 338187 316369 356369
Khảo sát số lần chiết
Kết quả khảo sát số lần chiết cho thấy chiết
2 lần được chọn để chiết các hợp chất cần định
lượng trong lá Nữ lang
Bảng 2: Diện tích đỉnh các polyphenol và số lần
chiết trong khảo sát qui trình định lượng
Tỷ lệ % chiết lần 2
Tỷ lệ % chiết lần 3
Acid
clorogenic 3402031 187110 34020 5,16 0,94
Rhoifoolin 2092002 125520 29288 5,59 1,30
Neobudofficid 18605 1302 205 6,48 1,02
Linarin 364110 14564 10923 3,74 2,80
Khảo sát thời gian chiết
Thời gian chiết 30 phút được chọn để chiết vì cho diện tích đỉnh cao hơn so với chiết 15 phút và cũng gần tương đương với chiết 45 phút
Bảng 3: Diện tích đỉnh các polyphenol và thời gian
chiết trong khảo sát quy trình định lượng
Acid clorogenic
3401120 3571176 3407922 Rhoifoolin 2092110 2133952 2194202 Neobudofficid 18701 18906 18988 Linarin 365210 373244 376166
Trang 6Khảo sát nhiệt độ chiết
và 50oC Kết quả cho thấy nhiệt độ 40oC cho
hiệu quả chiết cao hơn 30oC và cũng tương
cho quy trình chiết
Bảng 4: Diện tích đỉnh các polyphenol và nhiệt độ
chiết trong khảo sát quy trình định lượng
Acid clorogenic 3401800 3571890 3575292
Rhoifoolin 2092528 2094621 2098806
Neobudofficid 18705 19078.84 19452.93
Linarin 365283 381355.5 383181.9
Sau khi khảo sát dung môi chiết, số lần
chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết Quy
trình chiết được thiết lập như sau:
Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá Nữ
lang cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp,
thêm 10 ml MeOH 40%, siêu âm (mức năng
lượng 100%) ở nhiệt độ 40 oC trong vòng 30
phút, lọc, bã được chiết lần 2 với 10 ml MeOH
40%, gộp dịch lọc, cho dịch lọc thu được vào
bình định mức 25 ml, bổ sung dung môi cho
đủ thể tích, lọc qua màng lọc PTTE 0,22 µm
trước khi phân tích bằng UHPLC
Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải
Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký,
chương trình rửa giải được xây dựng như sau:
Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a formic 0,1% trong acetonitril (B) Chương trình rửa giải gradient thể hiện
ở Bảng 5
Tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ
Bảng 5: Chương trình rửa giải của quy trình
định lượng
0-2 phút 90% A 2-3 phút 90% 78% A 3-5 phút 78% 75% A 5-7 phút 75% A 7-9 phút 75% 5% A 9-14phút 5% A
Khảo sát điều kiện MS
Điều kiện phân tích khối phổ được thiết lập với thông số capillary voltage ở 0,8 kV; cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao quản được duy trì ở 350oC Tốc độ khí khử dung môi (desolvation gas) là 300 L/h Phổ khối của các chất phân tích được ghi nhận ở chế độ ion dương (positive) Sắc kí đồ của các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế
độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 100-1000) và SIR (single ion recording) Chế
độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z 739,69; và linarin ở m/z 593,54
Khảo sát tính tương thích hệ thống
Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng
(µV × s)
N
Acid clorogenic
(30 mg/ml)
TB 1,989 3787040 7817
RSD% 0,04 0,73 Rhoifolin
(18,75 mg/ml)
TB 5,829 3182400 106680
11,7 1,04 2,86 1,12 RSD% 0,02 0,73
Neobudofficid
3,75 mg/ml)
TB 7,11 728291 160595
14,5 1,10 RSD% 0,07 0,89
Linarin
30 mg/ml)
TB 7,846 7998000 84759
16,1 1,04 2,63 1,13 RSD% 0,05 1,57
Trang 7Hình 1: Sắc ký đồ ở chế độ SIR và các phổ khối của các hợp chất tương ứng
Trang 8Tính đặc hiệu
Hình 2: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng
Trang 9Tính tuyến tính
Bảng 7: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các chất đối chiếu
C (µg/ml) STB
(µV×s) C (µg/ml)
S TB
(µV×s) C (µg/ml)
S TB
(µV×s) C (µg/ml)
S TB
(µV×s)
120 14978010 75 11991988 15 2780080 120 31876180
60 7544520 37,5 6295994 7,5 1425682 60 15998040
30 3787048 18.75 3182499 3,75 728291 30 7999020
15 1893524 9,38 1610227 1,88 367899 15 4031245 7,5 1074029 4,69 829839 0,938 182169 7,5 1908647
Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến
tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh với
R2~0,999 và khoảng tuyến tính các chất phân
tích thể hiện ở Bảng 8
Sau khi xét các hệ số hồi quy, phương trình tuyến tính thể hiện ở Bảng 8
Bảng 8: Phương trình tuyến tính
Acid clorogenic ŷ = 124100x 7,5 - 120 0,9999 Rhoifolin ŷ = 158817x 4,69 – 75 0,9994 Neobudofficid ŷ = 184350x 0,938 – 15 0,9998 Linarin ŷ = 265886x 7,5 - 120 0,9995
Độ lặp lại
Bảng 9: Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định luợng (n=6)
Hàm lượng (%)
(khối lượng/khối lượng)
1,76±0,03 (RSD = 1,61)
0,86±0,02 (RSD = 2,07)
0,19±0,005 (RSD = 2,42)
1,95±0,096 (RSD = 4,95)
Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương
pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5%
Như vậy, phương pháp đạt độ lặp lại
Khảo sát độ đúng
Tất cả các đỉnh cần định lượng đều có tỷ
lệ phục hồi trong giới hạn từ 97 – 105%
Bảng 10: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy
trình định lượng (n=9)
Tên hợp chất Tỷ lệ phục hồi
10% 20% 30% RSD Acid clorogenic 101,1 99,9 104,5 2,3 Rhoifolin 101,5 99,3 103,2 1,9 Neobudofficid 101,3 102,5 98,2 2,0 Linarin 103,4 102,6 97,5 3,2
Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới
hạn định lượng (LOQ)
Hình 3: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát LOD của quy trình định lượng
Trang 10Kết quả khảo sát LOD và LOQ được trình
bày ở Bảng 11 Trong các polyphenol định
lượng, neobudofficid có LOD thấp nhất với
nồng độ 0,0002 mg/ml
Bảng 11: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của quy
trình định lượng
A
clorogenic
(mg/ml)
Rhoifolin (mg/ml)
Neobudofficid (mg/ml)
Linarin (mg/ml)
LOD 0,029 0,0010 0,00020 0,015
LOQ 0,097 0,0033 0,00067 0,050
Hàm lượng các hợp chất phân tích
Bảng 12: Hàm lượng (%) các hợp chất trong lá V
hardwickii
1,76±0,03 0,86±0,02 0,19±0,005 1,95±0,096
Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng% (khối lượng/khối lượng), n=6
Bảng 13: Hàm lượng (%) acid clorogenic trong V
hardwickii và V officinalis
Lá
V
hardwickii
Thân
V
hardwickii
Rễ
V
hardwickii
Lá
V
officinalis
Rễ
V officinalis
1,76±0,03 8,23±0,13 1,68±0,03 5,30±0,09 1,45±0,02
Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng % (khối lượng/khối lượng), n=6
Hình 4: Sắc ký đồ (SIR) của acid clorogenic trong V hardwickii và V officinalis