Nội dung bài viết với mục tiêu xác định đột biến gen COL1A1 ở bệnh nhân và bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn. Nghiên cứu tiến hành 07 bệnh nhân tạo xương bất toàn và bố mẹ bệnh nhân được lựa chọn nghiên cứu, kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp được sử dụng để phát hiện đột biến.
Trang 1ĐỘT BIẾN GEN COL1A1 TRÊN BỆNH NHÂN TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN
Bùi Thị Hồng Châu*, Trần Vân Khánh*, Hồ Cẩm Tú*, Trần Huy Thịnh * Tạ Thành Văn*
TÓM TẮT
Mở đầu: Tạo xương bất toàn là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, 85% gây nên do đột biến gen tổng hợp collagen týp 1 (COL1A1) Bố hoặc mẹ mắc bệnh có khả năng truyền bệnh cho con 50%
Mục tiêu: Xác định đột biến gen COL1A1 ở bệnh nhân và bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn
Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 07 bệnh nhân tạo xương bất toàn và bố mẹ bệnh nhân được lựa chọn
nghiên cứu Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp được sử dụng để phát hiện đột biến
Kết quả: 5/7 bệnh nhân tạo xương bất toàn được phát hiện là có đột biến gen COL1A1, trong đó 2 trường hợp là di truyền từ bố và 2 trường hợp là di truyền từ mẹ, 1 trường hợp là đột biến mới phát sinh
Kết luận: Phát hiện đột biến gen trên bố, mẹ bệnh nhân đóng vai trò quan trọng trong công tác tư vấn di
truyền
Từ khóa: Bệnh tạo xương bất toàn, COL1A1, đột biến
ABSTRACT
MUTATIONAL SPECTRUM OF COL1A1 GENE IN PATIENTS WITH OSTEOGENESIS
IMPERFECTA
Bui Thi Hong Chau, Tran Van Khanh, Ho Cam Tu, Tran Huy Thinh, Ta Thanh Van
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - No 1 - 2013: 20 - 24
Background: Osteogenesis imperfecta, an autosomal dominant disease, is caused by mutation on gene coded
for collagen type 1 (COL1A1) Parent with this genetic disease deliver 50 % of the ability of osteogenesis imperfecta for their children
Objective: Identification of COL1A1 gene mutation in OI patients and their parent
Method: 7 osteogenesis imperfecta patients and their parents were selected for this study Direct sequencing
was used to detect the mutation
Results: The results showed that 5/7 patients were found to have the mutation in COL1A1 gene; including
two cases are inherited from the father and the two cases are inherited from the mother, one case was found as de novo mutation
Conclusion: Identify the mutations in COL1A1 gene is important for genetic counseling
Keywords: Osteogenesis imperfecta, COL1A1, mutation
MỞ ĐẦU
Tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imferfecta
– OI) là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể
thường, chủ yếu do đột biến gen tổng hợp
collagen týp 1 (COL1A1) Nguy cơ mắc bệnh ở
nam và nữ là như nhau Khi người bố hoặc
người mẹ bị bệnh, nguy cơ sinh con bị bệnh là
50% và không bị bệnh là 50% Chẩn đoán bệnh
OI không phức tạp ở những trường hợp có tiền
sử gia đình rõ hoặc biểu hiện bệnh nặng, có tiền
sử gãy xương Với những trường hợp không có tiền sử gia đình hoặc gãy xương không có kết hợp với những bất thường ngoài xương thì chẩn
* Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội
Tác giả liên lạc: TS Trần Vân Khánh ĐT: 0915958661 Email: vankhanh73md@yahoo.com
Trang 2đoán tương đối khó khăn, ngoài những tiêu
chuẩn chẩn đoán về mặt lâm sàng, cần kết hợp
thêm với xét nghiệm số lượng và cấu trúc phân
tử collagen týp 1 qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ
da bệnh nhân và kết hợp phân tích gen(9,2)
Kết quả phân tích gen là tiền đề quan trọng
giúp chẩn đoán trước sinh đối với các đối tượng
có nguy cơ cao sinh con bị bệnh để đưa ra những
tư vấn di truyền giúp ngăn ngừa và giảm tỉ lệ
mắc bệnh(6, 3) Nghiên cứu này được thực hiện tại
Trung Tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường
Đại học Y Hà Nội với mục đích xác định đột biến
gen COL1A1 ở bệnh nhân và bố mẹ bệnh nhân
tạo xương bất toàn
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- 07 bệnh nhân được chẩn đoán bệnh OI tại
Khoa Nội tiết- Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh
viện Nhi Trung ương dựa vào triệu chứng lâm
sàng và cận lâm sàng điển hình
- Các cặp bố mẹ của các bệnh nhân trên
Phương pháp nghiên cứu
Lấy mẫu bệnh phẩm
Bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch
chống đông trong EDTA, đảm bảo vô trùng
Tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn
phần chống đông EDTA bằng dung dịch
phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1)
Nồng độ và độ tinh sạch DNA được đo trên
máy Nanodrop 1000
Kỹ thuật PCR
Những mẫu DNA đạt giá trị OD 280/260 ≥
1,8 được sử dụng để khuếch đại với các cặp
mồi đặc hiệu Chu kỳ nhiệt: 94oC/5phút -
(94oC/1phút - 59oC/1phút - 72oC/ 2phút) x 35
chu kỳ - 72oC/5phút Sản phẩm PCR được bảo
quản ở 4oC
ABI-PRISM Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự trên GenBank (National center for biotechnology information, NCBI) để phát hiện đột biến
KẾT QUẢ Kết quả PCR
Sau khi thu được DNA có nồng độ và độ tinh sạch cao, kỹ thuật PCR được tiến hành để khuyếch đại gen COL1A1
Hình 1: Hình ảnh PCR đoạn gen được khuyếch đại từ
exon 39 - 41 của gen COL1A1 C mẫu đối chứng, 1-7 mẫu bệnh nhân MK: Marker 100 bp
Sản phẩm PCR được tiến hành giải trình tự gen trực tiếp để xác định đột biến, kết quả cho thấy 5/7 bệnh nhân được phát hiện có đột biến điểm trên gen COL1A1 Bố, mẹ của bệnh nhân cũng được tiến hành xác định đột biến để tìm nguyên nhân gây bệnh của người con có phải là
di truyền do bố mẹ hay không
Trường hợp 1
Phân tích gen COL1A1 của bố mẹ bệnh nhân
số 20 cho thấy người bố bệnh nhân bị đột biến dị
hợp tử 7599-31C>T tại intron 31, người mẹ bệnh
nhân không có đột biến Như vậy bệnh nhân số
20 có đột biến 7599-31C>T dị hợp tử tại intron 31
là do nhận 1 alen đột biến từ người bố (Hình 2) Tương tự, kết quả phân tích gen COL1A1 ở trường hợp 2, gia đình bệnh nhân số 43 cho thấy người bố bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử 3479+33T>C tại intron 33, người mẹ bệnh nhân
Trang 343 có đột biến 3479+33T>C tại intron 33 dị hợp tử là do nhận 1 alen đột biến từ người bố (Hình 3)
Hình 2: Đột biến 7599-31C>T tại intron 31 trên gen COL1A1 của bố mẹ bệnh nhân số 20 Mũi tên thẳng
đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi
I
II 1 1
2
Nam bị bệnh
Nữ bị bệnh
Nữ bình thường
Hình 3 : Phả hệ gia đình mã số 20 (mũi tên: BN mã
số 20)
Trường hợp 3
Phân tích gen COL1A1 ở gia đình bệnh nhân
số 8 cho thấy người bố bệnh nhân không có đột
biến, người mẹ bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử
thay thế G thành T tại vị trí 2183 làm cho bộ ba
tại vị trí 686 mã hóa Glycin chuyển thành Valin
(p.Gly686Val) Bệnh nhân số 8 và người em trai
có đột biến dị hợp tử là do nhận 1 alen đột biến
từ người mẹ (Hình 4)
Tương tự, kết quả phân tích gen COL1A1 ở gia đình bệnh nhân số 23 cho thấy người mẹ bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử thay thế G thành
A tại vị trí 2587 làm cho bộ ba tại vị trí 821 mã hóa Glycin chuyển thành Serin (p.Gly821Ser),
người bố bệnh nhân không có đột biến Bệnh
nhân số 23 có đột biến là do nhận 1 alen đột biến
từ người mẹ
Kết quả phân tích gen COL1A1 ở gia đình bệnh nhân bệnh nhân mã số 03, exon 6 có sự thay đổi nucleotid C653A (thay đổi Serin vị trí
176 thành Tyrosin) và C654G (không làm thay đổi acid amin) đều ở dạng dị hợp tử Khi cả hai đột biến này xảy ra đồng thời sẽ biến đổi codon TCC (mã hoá cho Serin) thành mã kết thúc TAG (p.S176Stop) Người mẹ và người bố bệnh nhân không tìm thấy đột biến gen (Hình 5)
Bệnh nhân mã số 20
Mẹ bệnh nhân mã số 20 c.7599-31C>T
c.7599-31C c.7599-31C>T
Bố bệnh nhân mã số 20
Trang 4Hình 4: Hình ảnh đột biến c.2183 G>T p.Gly686Val trên gen COL1A1 của các thành viên gia đình bệnh nhân
8 Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi
Hình 5: Phả hệ gia đình mã số 8 (mũi tên: BN mã số 8)
BÀN LUẬN
OI là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể
thường do đột biến gen tổng hợp collagen týp 1
Như vậy, chỉ cần một alen mang gen đột biến là
người mang gen này đã mắc bệnh hoặc chỉ cần
người bố hoặc người mẹ bị bệnh thì 50% khả
năng sinh con mắc bệnh OI(8)
di truyền từ người mẹ Chỉ có duy nhất 1 trường hợp do đột biến mới phát sinh, người mẹ và người bố đều bình thường
Có khoảng 250 đột biến được tìm thấy ở trên gen COL1A1 chủ yếu là dạng thay đổi một nucleotid, phá vỡ cấu trúc bộ ba Gly-X-Y dẫn đến sự mất đi tính bền vững của protein Những dạng đột biến khác như mất, lặp đoạn hoặc bổ
I
II
1
1
2
Nam bị bệnh Nữ bình thường Nữ bị bệnh Nam bình thường
Mẹ bệnh nhân
Bố bệnh nhân
c 2183G>T p.Gly686Val
c 2183G
Em trai bệnh nhân
c 2183G>T p.Gly686Val
Bệnh nhân mã số 8
c 2183G>T p.Gly686Val
Trang 5gây rối loạn cấy trúc collagen I Vùng này trải dài
từ exon 6 đến exon 49 của gen COL1A1 Như
vậy không chỉ các đột biến trong exon mà các
đột biến nằm trong vùng intron đều ảnh hưởng
đến cấu trúc chuỗi xoắn bậc ba Thực tế đã
chứng minh, 18% đột biến intron ở chuỗi DNA
của gen COL1A1 được công bố gây bệnh OI
(Osteogenesis Imperfecta Variant Database)
Hiện nay có 217 đột biến tại vùng intron của gen
COL1A1 được công bố tại ngân hàng dữ liệu
Osteogenesis Imperfecta Variant Database Đột
biến 7599-31C>T dị hợp tử tại intron 24 xuất hiện
ở bệnh nhân mã số 20 và người bố của bệnh
nhân Đột biến này cách đầu 5’ của exon 25
khoảng 31 nucleotid có thể gây nhiễu vị trí cắt
nối giữa exon 24 và 25 Tương tự ở bệnh nhân
mã số 43, người bố của bệnh nhân xuất hiện đột
biến dị hợp tử tại intron 7, cách đầu 3’ của exon 7
một khoảng 33 nucleotid, 3479+33T>C Đột biến
này có thể gây ảnh hưởng quá trình cắt nối giữa
exon số 7 và 8
Trường hợp bệnh nhân mã số 08, đột biến
thay thế G vị trí 2183 trên mRNA của gen
COL1A1 (NM_000088.3) thành T làm thay đổi
acid amin Glycin vị trí 686 thành Valin, cũng tìm
thấy ở người mẹ và người em trai của bệnh nhân
(đều bị bệnh OI) Đột biến này đã được công bố
hai lần tại ngân hàng dữ liệu Osteogenesis
Imperfecta Variant Database và được khẳng
định là đột biến gây bệnh OI(7,5) Một trường hợp
khác, đột biến p.Gly821Ser ở bệnh nhân mã số 23
cũng được công bố 13 lần ở châu Âu, châu Á và
châu Mỹ với tỷ lệ khoảng 11% trong tổng số đột
biến tìm thấy trên gen COL1A1
Trường hợp bệnh nhân mã số 03, xuất hiện
hai đỉnh trùng nhau ở hai vị trí 653, 654
(NM_000088.3, NCBI) đã tạo ra mã kết thúc
(nonsense mutation) Tuy nhiên, khi phân tích
trên bố, mẹ bệnh nhân tại vị trí này không thấy
có đột biến chứng tỏ bệnh nhân không nhận
được alen đột biến từ người mẹ hoặc từ người
bố nên đây là đột biến mới phát sinh(7,1)
KẾT LUẬN
Đã phát hiện được 5/7 bệnh nhân có đột biến gen COL1A1 trong đó 2 trường hợp là di truyền
từ bố và 2 trường hợp là di truyền từ mẹ, 1 trường hợp là đột biến mới phát sinh
Chú thích: Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu
Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội trên cơ sở của đề tài cấp Bộ: “Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đột biến gen (COL1A1, COL1A2) gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta: OI) ở trẻ em Việt Nam” - Chủ nhiệm đề tài: TS.TRẦN VÂN KHÁNH - Với sự tài trợ kinh phí từ Ngân sách Sự Nghiệp Khoa Học cấp Bộ Y tế đã được duyệt năm 2011.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bùi Thị Hồng Châu, Trần Vân Khánh, Hồ Cẩm Tú, Trần Huy Thịnh, Vũ Chí Dũng, Tạ Thành Văn (2012), “Một trường hợp đột biến tạo mã kết thúc trên gen COL1A1 ở bệnh nhân tạo xương bất toàn”, Tạp chí nghiên cứu Y học 78, (1), tr 10-3
2 Buisson O, Senat MV, Laurenceau N, Ville Y (2006), “Prenatal diagnosis of type II osteogenesis imperfecta, describing a new mutation in the COL1A1 gene”, Prenat Diagn., 26, pp 394
3 Frank Rauch, Francis H Glorieux (2004), “Osteogenesis
Imperfecta”, The Lancet, 363
4 Hồ Cẩm Tú, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Bùi Thị Hồng Châu, Lê Hoài Chương, Tạ Thành Văn (2012), “Phát hiện đột biến gen COL1A1 ở bệnh nhi tạo xương bất toàn”, Tạp chí nghiên cứu Y học 78, (1), tr 5-10
of osteogenesis imperfecta in obstetrical practice”, Ginekol Pol.,
72, pp 456-465
6 Leśniewicz R , Galicka A , Anchim T , Skotnicki M , Wołczyński S ,
osteogenesis imperfecta in obstetrical practice”, Ginekol Pol.,
72, pp 456-65
causing osteogenesis imperfecta in a Chinese family”, Mol Vis.,
13, pp 360-5
8 Pollitt R , McMahon R , Nunn J , Bamford R , Afifi A , Bishop N ,
in patients diagnosed with osteogenesis imperfecta type I-IV”,
Hum Mutat., 27, pp 716
9 Trần Vân Khánh (2011), “Bệnh tạo xương bất toàn”, Bệnh học
phân tử, Nhà xuất bản y học, tr 208-16
Ngày nhận bài: 10/12/2012 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 06/01/2013 Ngày bài báo được đăng: 31/01/2013