Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dược phẩm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Trang 1ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN VI SINH VẬT
TRONG DƯỢC PHẨM
Trương Ngọc Lan**, Nguyễn Thanh Thuận*, Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Cát Đông*
TÓM TẮT
Mở đầu: Dược phẩm cần phải đạt các tiêu chuẩn an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người bệnh Một
trong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễm các vi sinh vật Thời gian xác định giới hạn vi sinh vật theo phương pháp truyền thống là từ 5 đến 7 ngày Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm
Mục tiêu: Xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dược
phẩm
Phương pháp: Dựa trên phương pháp PCR, tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu, độ đặc hiệu và độ nhạy
của các cặp cặp mồi chung và mồi đặc hiệu, khảo sát thời gian tăng sinh thích hợp để phát hiện từng loại vi sinh vật Sau đó kiểm tra các thông số tối ưu bằng phản ứng RT-PCR
Kết quả: Xác định được nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg 2+ cho các cặp mồi Các cặp mồi đều đạt độ đặc hiệu để phát hiện vi khuẩn, vi nấm và vi sinh vật chỉ thị và có giới hạn phát hiện tốt Phương pháp RT-PCR rút ngắn thời gian của kiểm tra giới hạn nhiễm vi sinh vật khoảng 5 lần so với phương pháp Dược điển
Kết luận: Phương pháp RT-PCR thích hợp để xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm
Từ khóa: Kỹ thuật PCR, thử giới hạn vi sinh vật, kiểm nghiệm dược phẩm, phương pháp nhanh
ABSTRACT
APPLICATION OF RT-PCR TECHNIQUE FOR DETERMINATION OF MICROBIAL LIMIT TEST OF
PHARMACEUTICALS
Truong Ngoc Lan, Nguyen Thanh Thuan, Vu Thanh Thao, Nguyen Van Thanh, Tran Cat Dong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 202 - 210
Background: Microbial contamination in pharmaceutical products is one of the major causes of health risk to
consumers Vietnamese Pharmacopoeia microbial limit test requires 5 - 7 days RT-PCR detection of microorganisms is a rapid, sensitive, and infallible method
Objectives: To develop a convenient, reproducible and rapid test for microbial limit of pharmaceutical
products
Methods: Base on PCR method, annealing temperature, Mg 2+ concentration, sensitivity and specificity of the universal and specific primers, proliferating time for microorganisms were optimized After that, the optimal conditions were applied to RT-PCR ( Reverse Transcriptase PCR) assay
Results: The annealing temperature, Mg 2+ concentration of primer pairs were determined All primers are specific to detect bacteria, fungi and indicative microorganisms and have good detection limits RT-PCR analysis can be used for microbial limit determination 5 times faster than the standard method
Conclusions: RT-PCR is a suitable method for rapid and reliable detection of microbes pharmaceutical
samples
Keywords: PCR, microbial limit test, pharmaceutical quality control, rapid method
*Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM ** Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Bình Dương
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Dược phẩm là chế phẩm dùng để phòng và
điều trị bệnh, do đó cần phải đạt các tiêu chuẩn
an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người
bệnh Một trong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễm
các vi sinh vật, các vi sinh vật này có thể gây
bệnh trực tiếp hoặc gián tiếp làm hỏng dạng bào
chế, làm cho chế phẩm không chỉ mất đặc điểm
cảm quan mà còn mất tác dụng điều trị Dược
điển Việt Nam quy định các dạng thuốc dùng
đường uống không chứa chất bảo quản phải đạt
các giới hạn về độ nhiễm khuẩn, việc xác định
giới hạn vi sinh vật được thực hiện theo phương
pháp tăng sinh, và nuôi cấy trên môi trường
chọn lọc(1), tuy nhiên thời gian để có kết quả một
mẫu kiểm nghiệm là từ 5 đến 7 ngày, nếu mẫu
không đạt chúng ta phải lặp lại một lần nữa,
chưa kể đến phân lập vi khuẩn gây bệnh
Phương pháp này ngoài tốn kém thời gian, kết
quả còn phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật viên
kiểm nghiệm, thuốc sẽ lưu lại kho lâu hơn, gây
tốn kém, tăng chi phí sản xuất, tăng giá thành
Trong khi hầu hết tuổi thọ các thuốc dùng
đường uống ngắn (12 đến 24 tháng)
Gần đây, các nước tiên tiến trên thế giới đã
bắt đầu áp dụng các phương pháp xác định
nhanh giới hạn vi sinh vật trong quá trình kiểm
tra để xuất xưởng Các phương pháp này có độ
nhạy cao và được chứng minh là tương đương
với các phương pháp truyền thống, với phương
pháp này có thể giúp tự động hóa một phần và
cho kết quả khách quan hơn
Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh
và chính xác, do đó có thể ứng dụng để xác định
số lượng vi sinh vật trên cơ sở mỗi vi sinh vật
mang số bản sao biết trước của khuôn mẫu Hiện
nay, kỹ thuật RT-PCR đã khá phổ biến ở nước ta
và ngày càng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán, xét nghiệm
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật sử dụng gồm các chủng chuẩn của ATCC và các chủng được phân lập và giữ tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh:
Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus
ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, Salmonella typhi, Streptococcus feacalis ATCC 29213, Bacillus subtilis PY 79, Bacillus
cereus, Shigella sp., Klebsiella sp., Candida albicans
ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404 và
Monascus purpureus
Tách chiết ADN, ARN
ADN vi khuẩn được tách chiết bằng phương pháp phenol–chloroform Để phá vỡ tế bào, dùng đệm ly giải BLB (EDTA 50mM, NaCl 0,1M,
pH 7,5) và lysozyme đối với vi khuẩn Gram dương và dùng SDS 10% đối với vi khuẩn Gram
âm ADN nấm men được chiết theo phương pháp của Harju(4), ADN nấm mốc được chiết theo phương pháp của Vanittanakom(2,8)
ARN vi sinh vật được tách chiết và tinh sạch bằng kit SV total RNA isolation system (Promega) khi đo OD600 của dịch nuôi cấy đạt 0,6-1
Phản ứng PCR
Mồi sử dụng trong phản ứng PCR được chọn theo hai hướng: mồi đa năng phát hiện tất
cả vi sinh vật và mồi chuyên biệt phát hiện
nhóm vi sinh vật chỉ thị như: E coli,
Staphylococcus sp., Salmonella sp., P aeruginosa
Trình tự của các mồi được liệt kê trong Bảng 1
Trang 3Các phản ứng PCR được thực hiện riêng rẽ để
tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+
PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25 μl
gồm 1μM/mồi (Sigma Proligo); 1U Taq
polymerase (Promega); 0,25 mM dNTP
(BioLabs); 1X PCR buffer (Promega) Mg2+ được
thăm dò ở các thông số khác nhau từ 1 – 5 mM Chu trình phản ứng là 1 chu kỳ: 95oC trong 5 phút; 35 chu kỳ: 95oC trong 1 phút, thời gian gắn mồi là 1 phút với các nhiệt độ khác nhau cho từng loại mồi, 72oC trong 2 phút và cuối cùng là
1 chu kỳ ở 72oC trong 5 phút
Bảng 1 Mồi sử dụng trong phản ứng PCR
p8FPL-UF AGTTTGATCCTGGCTCAG
Vi khuẩn-16S rADN [8]
p806R-UR GGACTACCAGGGTATCTAAT
798
U340-UF TCCTACGGGAGGCAGCAGT
Vi khuẩn-16S rADN [6]
U806-UR GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT
466
RRF1-UF ATCTAAATCCCTTAACGAGGAACA
Vi nấm-18S rADN [8]
RRH1-UR CCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTT
631
SSU-0817-UF TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA
Vi nấm- 18S rADN [3]
SSU196-UR TCTGGACCTGGTGAGTTTCC
422
E coli-uidA [7]
147
Pseud-oprLR ATGGAAATGCTGAAATTCGGC
P aeruginosa- oprL [5]
Pseud-oprLR CTTCTTCAGCTCGACGCGACG
504
Sal-Malo2-F GTATTGTTGATTAATGAGATCCG
Salmonella- invA [6]
Sal-Malo2-Ra ATATTACGCACGGAAACACGTT
373
STAIb-F GGAATAACGTGACATATTGTA
Sta sp-16S rADN [9]
STAIib-R TTCACTCGGTTTTGCTTGG
300
Phản ứng RT-PCR
Phản ứng PCR ngược (reverse transcriptase
PCR - RT-PCR) được thực hiện với kit
Ready-To-Go RT-PCR Beads (GE Healthcare) và các mồi
như trên ARN được chuyển thành cADN ở
nhiệt độ 42oC trong 15 phút sau đó các chu kỳ
phản ứng tiến hành như đối với PCR
Độ nhạy của phản ứng PCR
Dung dịch ADN đích đã biết được số bản
sao được pha loãng liên tiếp sao cho trong 10 µl
khuôn mẫu có chứa 2x107 bản sao đến 2 bản sao
đối với vi khuẩn và 107 đến 1 bản sao đối với vi
nấm tương ứng với nồng độ ADN đích từ 100
ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg
và 1 fg trên 10 µl để khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR Cách quy đổi số bản sao như sau với nồng độ ADN như sau: 100 fg ADN tương đương với 22 bản sao bộ gen vi khuẩn hoặc 10 bản sao bộ gen vi nấm Các thông số phản ứng như đã được thiết lập ở trên Độ nhạy được xác định là số lượng bản sao của ADN đích thấp nhất vẫn cho sản phẩm khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi tương ứng
Thời gian tăng sinh để phát hiện các vi sinh vật
Khảo sát thời gian tăng sinh cần thiết sẽ giúp làm giàu số lượng vi sinh vật trong mẫu lên đến ngưỡng phát hiện của phương pháp PCR Để
Trang 4khảo sát thời gian tăng sinh phát hiện vi sinh vật
trong các mẫu dược phẩm, tiến hành gây nhiễm
vi khuẩn chỉ thị, nấm men, nấm mốc vào thuốc
tiêm lidocain 2% với lượng vi sinh vật gây
nhiễm lần lượt từ 100 - 105 CFU/ml Sau đó, các
mẫu thuốc tiêm đã được gây nhiễm được tăng
sinh trong các môi trường thích hợp với từng đối
tượng (môi trường TSB đối với vi khuẩn, PDP
đối với nấm mốc và YPD đối với nấm men) Sau
khi tăng sinh, tiến hành chiết ADN ở các mốc
thời gian 6, 9 và 12 giờ (đối với vi khuẩn và nấm
men) và 24, 48 và 60 giờ (đối với nấm mốc) và
thực hiện phản ứng PCR theo điều kiện tối ưu
trên đối với từng loại vi sinh vật
Phát hiện sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel
agarose 1% ở điện thế 120V trong 20 phút, đọc
kết quả bằng phương pháp nhuộm ethidium
bromide Sản phẩm điện di được chụp hình
bằng máy Dolphin (Wealtec Corp.)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chiết tách ADN, ARN
Sản phẩm ADN, ARN chiết được có tỉ lệ
OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2, đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR Khi chiết ADN, ARN của
Aspergilus niger thì không loại được sắc tố đen
trong phần dịch nổi, tuy nhiên, kết quả này không ảnh hưởng khi thực hiện phản ứng PCR
và RT-PCR
Phản ứng PCR
Thực hiện phản ứng PCR với từng cặp mồi với nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ theo tài liệu tham khảo Đối với các cặp mồi có nhiệt độ
và nồng độ Mg2+ phù hợp với tài liệu cho sản phẩm PCR rõ và đúng kích thước chúng tôi không tiến hành khảo sát lại Với các cặp mồi không cho sản phẩm PCR hoặc vạch sản phẩm không rõ chúng tôi tiến hành khảo sát lại nhiệt
độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ tối ưu Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho từng cặp mồi như trong Bảng 2
Bảng 2 Nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg 2+ tối ưu
Vi sinh vật Mồi
Theo tài liệu Thực nghiệm Theo tài liệu Thực nghiệm
(*): tài liệu không đề cập
Tính đặc hiệu của các cặp mồi
Các vi sinh vật gồm: Bacillus subtilis (Bs),
Bacillus cereus (Bc), E coli (Ec), Klebsiella (Kle),
Pseudomonas aeruginosa (Pse), Salmonella sp (Sal),
Shigella (Shi), Staphylococcus aureus (St),
Streptococcus feacalis (Stre), Candida albicans (Ca),
Aspergillus (As), Monascus purpureus (Mo)
Mồi chung để phát hiện vi khuẩn, vi nấm
Cặp mồi p8FPL-UF/p806R-UR cho vạch sản phẩm có kích thước 798 bp, cặp mồi U340-UF/U806-UR cũng có sản phẩm PCR có kích thước 466 bp trên vi khuẩn mà không có sản phẩm PCR trên vi nấm thử nghiệm Cặp mồi
Trang 5SSU-0817-UF/SSU-1196-UR cho vạch sản phẩm
có kích thước 422 bp, tương tự, cặp mồi
RRF1-UF/RRH1-UF cũng có sản phẩm PCR kích
thước 631 bp trên vi nấm mà không xuất hiện
vạch sản phẩm trên vi khuẩn thử nghiệm tính
đặc hiệu Vậy các cặp mồi chung khảo sát là
đặc hiệu để phát hiện vi khuẩn hoặc vi nấm
(Hình 1)
Mồi phát hiện các vi sinh vật chỉ thị
Phản ứng PCR chỉ cho sản phẩm trên vi
khuẩn chỉ thị tương ứng với từng cặp mồi: cặp
mồi Pseud-oprLF/Pseud-oprLR cho vạch sản
phẩm có kích thước 504 bp trên P aeruginosa,
cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-R cho sản phẩm
có kích thước 373 bp trên Salmonella sp,
UAL-754/UAR-900 cho sản phẩm có kích thước 147
bp trên E coli và STAIb-F/STAIib-R cho sản phẩm có kích thước 300 bp trên S aureus và
không cho sản phẩm PCR trên các vi khuẩn, vi nấm chứng âm Như vậy các cặp mồi đã chọn đều đạt yêu cầu về tính đặc hiệu PCR (Hình 2)
M Ca As Mo Ec Bs Stre Kle Ps Sa Shi Sta
422bp
Bs
631bp p
Stre
798bp
Shi
Bc As Sta Str Bc Ca
Sa
Ps Kle
Ec
Bs
M Mo
Shi
Bc Str As Mo Ca Sta
Sh
Sa
Ps Kle
Ec
Bs
M
466bp
Hình 1 Tính đặc hiệu của mồi chung phát hiện vi nấm và vi khuẩn
Trang 6
As
Ca
Sh Stre
M Ec Bs Kl St Ps Sal Mo M St Ec Bs Kl Sal Ps Sh Stre Ca As Mo
M Sta Sal Stre Bs Kl Ec Ps Shi Ca As Mo
M Ec Ps Sta Bs Kl Sal Sh Stre Ca As Mo
UAL754/UAR900
373bp
Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra Pseud-oprLF/Pseud-oprLR
STAIb-F/STAIibR
300bp 147bp
504bp
Hình 2 Độ đặc hiệu trên các vi sinh vật chỉ thị
Độ nhạy của phản ứng PCR
Dãy nồng độ ADN, số bản sao bộ gen vi
khuẩn và vi nấm như Bảng 3
Kết quả PCR cho thấy trên cả hai cặp mồi
chung phát hiện vi khuẩn có giới hạn phát
hiện tương đương nhau là 10fg ADN tương
ứng với 2 bản sao của vi khuẩn Đối với hai
cặp mồi phát hiện vi nấm cặp mồi
SSU-0817-UF/SSU-1196-UR có giới hạn phát hiện là 100fg ADN tương ứng với 10 bản sao của vi nấm, nhạy hơn cặp mồi RRF1-UF/RRH1-UR có giới hạn phát hiện là 1pg ADN tương đương 100 bản sao (Hình 3) Vậy cặp mồi SSU-0817-UF/SSU-1196-UR thích hợp cho các thử
nghiệm về vi nấm trên mẫu dược phẩm
Bảng 3 Nồng độ ADN và số bản sao bộ gen
Trang 7
422bp
631bp
798bp
466bp
Hình 3 Giới hạn phát hiện của mồi chung phát hiện vi khuẩn và vi nấm
3 4
M
1
1
5
6
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
8
9
9
10
300bp
STAIb-F/STAIib-R
147bp
UAL 754/UAR-900
373bp
Sal-Malo2-F/Sal-Malo2 - Ra
504bp
Pseud-oprLF/Pseud-oprLR
3
1 9
Hình 4 Giới hạn phát hiện của các cặp mồi trên các vi sinh vật chỉ thị
Trang 8Cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-F phát hiện
Salmonella có giới hạn phát hiện ở nồng độ ADN
10fg tương đương 2 bản sao, cặp mồi
Pseud-oprLF/Pseud-oprLR phát hiện P aeruginosa có
giới hạn phát hiện là 2pg tương dương với 200
bản sao, cặp mồi UAL 754/UAR900 phát hiện E
coli có giới hạn phát hiện là 20pg tương dương
với 2.103 bản sao và cặp mồi STAIb-F/STAIib-R
phát hiện S aureus có giới hạn phát hiện là 200pg
tương dương với 2.104 bản sao (Hình 3) Như
vậy, các mồi phát hiện Salmonella, P aeruginosa,
vi khuẩn, vi nấm đều cho kết quả tốt, các mồi E
coli, S aureus có giới hạn phát hiện khá cao: 2.103,
2.104 tế bào/phản ứng So với tiêu chuẩn Dược
điển yêu cầu phát hiện được một vi khuẩn trong
mẫu thì các cặp mồi trên không đạt Tuy nhiên,
khi tiến hành thực nghiệm trên mẫu thuốc, việc
chiết được hoàn toàn ADN trong mẫu không thể
đạt được, thông thường chỉ sử dụng một lượng
nhỏ đem tăng sinh trước khi chiết ADN Sau khi
tăng sinh lượng vi sinh vật sẽ đạt ngưỡng giới
hạn của tất cả các cặp mồi
Thời gian tăng sinh để phát hiện vi sinh vật
Kết quả thử nghiệm về thời gian tăng sinh để
phát hiện các vi sinh vật cho thấy: E coli, P
aeruginosa thời gian phát hiện là 6 giờ, lượng vi
khuẩn gây nhiễm là 100 CFU; Salmonella, S aureus
là 9 giờ và lượng vi khuẩn gây nhiễm là 100 Còn với thử nghiệm vô khuẩn: thời gian tăng sinh của vi khuẩn là 9 giờ với lượng gây nhiễm là 100, nấm men thời gian tăng sinh là 12 giờ với lượng gây nhiễm là 100, nấm mốc thời gian tăng sinh là
60 giờ với gây nhiễm là 101
Phản ứng RT-PCR
Dược điển quy định, việc kiểm nghiệm chỉ tiêu vi sinh của các mẫu dược phẩm dựa trên các
vi sinh vật sống, do đó các thử nghiệm phát hiện dựa trên phương pháp RT-PCR, nghĩa là tiến hành trên các vi sinh vật sống vì ARN chỉ tồn tại trong các tế bào sống Tuy nhiên sử dụng ARN không ổn định, vì số lượng bản sao của ARN trong tế bào luôn thay đổi tùy vào từng giai đoạn của tế bào
798bp
M 1
466bp
631bp 422bp
147bp
Ps Sal
M Sta
300bp 373bp 504bp
Hình 5 Phản ứng RT-PCR trên mồi chung và mồi đặc hiệu
1, 2: ARN của vi khuẩn với mồi p8FPL-UF/ p806R-UR, U340-UF/ U806-UR; 3,4: ARN của Candida và Aspergillus với mồi RRF1-UF/ RRH1-UR; 5, 6: ARN của Candida và Aspergillus với mồi SSU-0817-UF/ SSU196-UR; Ec, Ps, Sal, Sta:
ARN của vi sinh vật chỉ thị với mồi đặc hiệu
Do vậy khi tối ưu các thông số của các cặp
mồi sử dụng, cũng như khảo sát giới hạn phát
hiện, tính đặc hiệu của mồi, thời gian tăng sinh
để phát hiện các vi sinh vật chúng tôi tiến hành
trên khuôn mẫu là ADN và kiểm tra lại các
thông số này với khuôn mẫu là ARN Kết quả
cho thấy các thông số của phản ứng PCR đều
thích hợp khi áp dụng lên phản ứng RT-PCR với khuôn mẫu là ARN
KẾT LUẬN
Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi sinh vật chỉ thị và thử vô khuẩn trong dược phẩm có thời gian thực hiện nhanh hơn khoảng 5 lần so với phương
Trang 9pháp Dược điển Ngoài ra, các yêu cầu về độ đặc
hiệu và độ nhạy đều đạt trên các cặp mồi đã
khảo sát Như vậy, kỹ thuật PCR để xác định
giới hạn vi sinh vật trong dược phẩm là hoàn
toàn khả thi
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y Tế (2009) Dược điển Việt Nam 4 Phụ luc 13.6 Thử giới
hạn nhiễm khuẩn PL258- PL269 Hà Nội
2 Bayardelle P., Zafarullah M (2002) Development of
oligonucleotide primers for the specific PCR-based detection
of the most frequent Enterobacteriaceae species ADN using
wec gene templates Can J Microbiol 48(2): 113-22
3 Borneman J., Hartin R J (2000) PCR primers that amplify
fungal rADN genes from environmental samples Appl
Environ Microbiol 66(10): 4356-60
4 Harju S., Fedosyuk H., et al (2004) Rapid isolation of yeast
genomic ADN: Bust n' Grab BMC Biotechnol 4: 8
5 Jaffe R I., Lane J D., et al (2001) Real-time identification of
Pseudomonas aeruginosa direct from clinical samples using a
rapid extraction method and polymerase chain reaction (PCR) J Clin Lab Anal 15(3): 131-7
6 McCabe K M., Zhang Y H., et al (1999) Bacterial species identification after ADN amplification with a universal primer pair Mol Genet Metab 66(3): 205-11
7 Tsai Y L., Palmer C J., et al (1993) Detection of Escherichia coli
in sewage and sludge by polymerase chain reaction Appl Environ Microbiol 59(2): 353-7
8 Vanittanakom N., Vanittanakom P., et al (2002) Rapid
identification of Penicillium marneffei by PCR-based detection
of specific sequences on the rADN gene J Clin Microbiol 40(5): 1739-42
9 Voytenko A V., Kanbar T., et al (2006) Identification of
Staphylococcus hyicus by polymerase chain reaction mediated
amplification of species specific sequences of superoxide dismutase A encoding gene sodA Vet Microbiol 116(1-3): 211-6