Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies-Mab)

Kháng thể đơn dòng là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro. Và để hiểu rõ hơn về lĩnh vực này, mời các bạn tham khảo bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies-Mab) sau.

SẢN XUẤT KHÁNG THỂ

(Monoclonal antibodies-Mab)

Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B

trong điều kiện in vitro

Định nghĩa

Là kháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho một vị trí epitope duy nhất của kháng nguyên (Milstein)

George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984

Không gi ới hạn về số lượng

8 bước tạo MAb

• Nhân sinh khối MAb bằng phương pháp

in vitro hay in vivo

• Tinh chế MAb

• Thu nhận, kiểm tra MAb

(1a) Chọn động vật gây nhiễm

• Động vật thường được sử dụng để tạo

hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley

rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ…

• Mouse là mô hình lý tưởng nhất:

đáp ứng miễn dịch mạnh

tổng hợp kháng thể nhanh

• 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản

xuất MAb: BALB/c và C57BL/6

Rat Hamster

Hệ thống chuồng chuột sạch

(1b) Chọn Ag

• Quyết định sự thành công của quy trình

• Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành

• Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm (MAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)

• Được nhận diện bởi MAb mục tiêu

• Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh

• Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốtHiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuậtprotein tái tổ hợp

• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, cáchapten phối hợp với protein, vaccine thương

phẩm hay là một phân tử protein nào đó

Antigen

Các vị trí tiêm Ag

Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch)

Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)

Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da)

Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ)

Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)

(2) Gây đáp ứng MD

Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả năng dung hợp của nó với tế bào lách

Nguyên tắc 2

- Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên

chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay

X63/Ag.8653

- Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn

dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3

Tiêm 10-100g/1 chuột/1 lần

Tá dược thường được sử dụng là CFA

Với kháng nguyên là protein

Tiêm 0,5 - 5 x10 7 tb/1 chuột/ 1 lần

Tá dược thường được sử dụng là ALUM Với kháng nguyên là tế bào

Ngày Thao tác Tá dược Vị trí tiêm

36 Thu serum

42 Nghỉ trước khi dung hợp

(hay tiêm nhắc lần 3)

IFA s.c.

55 Thu tế bào lách sau khi đã xác định

hiệu giá của Ig trong huyết thanh

Quy trình gây ĐƯMD ở mouse

Ngày THAO TÁC Chất bổ trợ Vị trí tiêm

0 Tiêm mũi cơ bản CFA i.p.

21 Tiêm nhắc lần 1 IFA i.p.

42 Tiêm nhắc lần 2 IFA i.p.

52 Kiểm tra serum

53 ELISA

63 Tiêm nhắc lần 3 IFA i.p.

73 Kiểm tra serum

74 ELISA

84 Tiêm nhắc lần 4 IFA i.p.

94 Kiểm tra serum

Undiluted serum 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative

Ch ọn lọc hybridoma

Tổng hợp nucleotide

Con đường de novo (bị ức chế bởi môi trường HAT)

Con đường dự trữ (sử dụng enzyme HGPRT)

B cell

de novo Salvage (HGPRT + )

Hybridoma

de novo Salvage (HGPRT + )

Myeloma

de novo Salvage (HGPRT-)

Chết Sống Chết

Môi trường chọn lọc HAT

Môi trường chọn lọc HAT

Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường:

– Con đường De novo cần hoạt động của enzyme

– Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine

(hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage

Dung hợp tế bào lách với myeloma

Chu ột đã được gây MD

Lympho B

Chu ột

D ầu khoáng Plasmacytoma (Bào t ương ung thư)

Immortal Tumor Of Lymphocytes +

(4) Các kĩ thuật dung hợp tế bào

Máy tạo xung điện

Buồng dung hợp

Tế bào trong buồng dung hợp

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ELISA

Western Blotting

Immunoflorescent essay

(5b) Dòng hóa Hybridoma

(6) Nhân sinh khối MAb

• Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển

nhân tạo (bioreactor, bình Roux…)

• MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào (supenatant cell culture)

• Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp (0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy)

• Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ thống bioreactor

(6a) Sản xuất MAb in vitro

Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào

• Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ (ascites)

• MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid)

• Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao

(1-15mg/mL nước báng)

• Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí nghiệm

(6b) Sản xuất MAb in vivo

Mồi chuột bằng pristane

Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity)

Thu thập nước báng (ascites fluid)

• 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane

• Tách chiết từ dầu gan cá mập

• Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu bệnh viêm khớp mãn tính ở người

• Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu bệnh tự miễn

• Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb

(7) Tinh chế protein

• Sắc ký ái lực (affinity chromatography)

• Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

• Lọc gel (gel filtration)

• Sắc ký cao áp

• Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic

Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC (High pressure liquid chromatography)

Sắc ký ái lực

Mab trong liệu pháp chữa trị ung thư

Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano

(quantum dot)

Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano

(quantum dot) ứng dụng trong in vitro

KTĐD gắn quantum dot phát huỳnh quang

trong nhận diện thụ thể bề mặt tế bào ung thư đại tràng

Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano

(quantum dot) ứng dụng trong in vivo

Mouse MAb Chimeric MAb Humanized

MAb