Nội dung bài viết với mục tiêu bào chế tiểu phân nano artemisinin đạt kích thước yêu cầu và bền trong thời gian khảo sát. Nghiên cứu tiến hành tiểu phân được bào chế bằng phương pháp tạo nhũ tương với thiết bị ultraTurrax và đồng nhất hóa bằng siêu âm hoặc với áp suất cao (HPH).
Trang 1KHẢO SÁT THÀNH PHẦN CÔNG THỨC
VÀ THÔNG SỐ ĐIỀU CHẾ HỆ PHÂN TÁN NANO ARTEMISININ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỒNG NHẤT HÓA DƯỚI ÁP SUẤT CAO
Khưu Mỹ Lệ*, Trương Công Trị*, Nguyễn Minh Cang*, Hoàng Minh Châu*, Nguyễn Minh Đức*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Bào chế tiểu phân nano artemisinin đạt kích thước yêu cầu và bền trong thời gian khảo sát Phương pháp nghiên cứu: Tiểu phân được bào chế bằng phương pháp tạo nhũ tương với thiết bị
Ultra-Turrax và đồng nhất hóa bằng siêu âm hoặc với áp suất cao (HPH) Kích thước và dãy phân bố kích cỡ hạt được đánh giá bằng phương pháp nhiễu xạ laser và hình ảnh tiểu phân nano được quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Định lượng artemisinin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo, bước sóng 216 nm
Kết quả: Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artemisinin bằng phương pháp tạo
nhũ tương và đồng nhất hóa bằng HPH Hệ tiểu phân nano điều chế được có kích thước và dãy phân bố kích cỡ hạt từ 37 nm đến 339 nm, kích thước trung bình của tiểu phân là 99,8 nm, được phân tích bằng thiết bị Horiba LA-920 và JEM-1400 Định lượng HPLC, lượng hoạt chất trong hệ phân tán chiếm 1,3 % so với tổng lượng lipid Hệ tiểu phân bền trong thời gian khảo sát 2 tháng
Kết luận: Kết quả cho thấy có thể bào chế tiểu phân nanoartemisinin bằng phương pháp tạo nhũ tương với
thiết bị Ultra-Turrax và đồng nhất hóa bằng HPH
Từ khóa: Artemisinin, tiểu phân nano, HPH
ABSTRACT
FORMULATION OF ARTEMISININ-LOADED LIPID NANOPARTICLES
BY HIGH PRESSURE HOMOGENIZATION
Khuu My Le, Truong Cong Tri, Nguyen Minh Cang, Hoang Minh Chau, Nguyen Minh Duc
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 2 - 2014: 295 - 302
Objectives: The aim of the study was to prepare stable artemisinin lipid nanoparticles
Methods: Artemisinin lipid nanoparticles were prepared by emulsification with Ultra-Turrax device and
homogenization with ultrasonic or high pressure homogenization (HPH) The particle diameter and size distribution were measured by means of laser diffraction and transmission electron microscopy (TEM) HPLC with an ODS column and detection at the wavelength of 216 nm was used to determine the quantity of artemisinin
Results: Artemisinin lipid nanoparticles were successfully prepared by emulsification and high pressure
homogenization The particle size distribution ranged from 37 nm to 339 nm, the average size was 99,8 nm measured by Horiba LA-920 and JEM-1400 The content of artemisinin in nanodispersions is about 1,3 % of total lipid Then anoparticles have been stable for 2 months
Conclusions: The present results provided evidence that artemisinin-loaded lipid nanoparticles could be
prepared by emulsification and homogenization with Ultra-Turrax and HPH
∗
Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Trang 2Keywords: Artemisinin, lipid nanoparticles, HPH
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo kết quả thống kê, trên thế giới vẫn còn
hơn một triệu người chết vì sốt rét mỗi năm và
hơn hai tỉ người trong khoảng 100 quốc gia có
nguy cơ mắc bệnh Đời sống kinh tế khó khăn là
một trong những nguyên nhân khiến bệnh tồn
tại và lây lan Tại các nước đang phát triển ở
Châu Á và Châu Phi, tỉ lệ tử vong do sốt rét rất
cao Nguy hiểm hơn là tình trạng đề kháng lan
rộng của ký sinh trùng sốt rét đối với các thuốc
điều trị kinh điển như quinin, cloroquin, …
Artemisinin, một sesquiterpen lacton
endoperoxid được tìm thấy trong lá của cây
thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.)(1,2) là
một phát minh rất có ý nghĩa trong điều trị sốt
rét Artemisinin và dẫn chất đã trở thành hoạt
chất chính trong điều trị bệnh sốt rét do
Plasmodium spp, kể cả chủng kháng cloroquin
Artemisinin có thời gian cắt sốt và làm sạch ký
sinh trùng trong máu nhanh hơn so với nhiều
hoạt chất cùng nhóm điều trị Tuy nhiên, đây
là chất rất kém tan nên sinh khả dụng đường
uống thấp, thời gian tác dụng lại ngắn, phải sử
dụng nhiều lần trong ngày nên có nguy cơ bị
đề kháng
Hệ tiểu phân nano lipid(6,8,9) có thể làm tăng
tính tan của artemisinin dẫn đến tăng sinh khả
dụng của hoạt chất này Ngoài ra, khi được chứa
trong các tiểu phân, artemisinin sẽ được bảo vệ
tránh sự phân hủy do tiếp xúc với môi trường
dịch cơ thể Nhờ vậy, hiệu quả điều trị tăng lên,
hạn chế tình trạng đề kháng thuốc
Nhằm ứng dụng công nghệ nano vào nghiên
cứu sản xuất dược phẩm, chúng tôi tiến hành
khảo sát các tá dược lipid và chất diện hoạt để
thiết lập thành phần công thức cơ bản của tiểu
phân nano artemisinin, bên cạnh đó, lựa chọn
các thông số của phương pháp tạo nhũ tương và
đồng nhất hóa dưới áp suất cao để xây dựng quy
trình bào chế tiểu phân
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu
Artemisinin chuẩn (99 %, kl/kl) và artemisinin nguyên liệu (Sao Kim Pharma, Việt Nam), Labrafac® CC (hỗn hợp acid capric và acid caprylic), Labrafac® PG (propylen glycol dicaprylocaprat), Compritol®, Precirol® (glycerin behenat), chất diện hoạt được sản xuất bởi Gattefosse – Pháp, cung cấp bởi Asia Shine (TP
thiết khác đạt tiêu chuẩn nhà sản xuất
Phương pháp nghiên cứu
HPLC artemisinin
Xác định hàm lượng artemisinin bằng phương pháp HPLC với các điều kiện sắc ký: Máy HPLC Shimadzu LC - 10AD
Cột: X.Terra LC 18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm) Pha động: CH3CN - H2O (68 : 32)
Detector: SPD - M10AVP Bước sóng phát hiện: 216 nm Nhiệt độ cột: 25 - 30 oC Tốc độ dòng: 0,62 ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 30 µl
Dung dịch chuẩn
Cân chính xác khoảng 5 mg artemisinin chuẩn vào bình định mức 1 ml, hòa tan bằng pha động, siêu âm và bổ sung pha động vừa đủ thể tích Lọc qua màng lọc 0,45 µm, dung dịch chuẩn
có nồng độ khoảng 5 mg/ml
Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 10 g mẫu thử, đun cách thủy ở 80 oC, hòa tan trong 25 ml methanol Siêu âm và lọc, rửa tủa bằng 3 ml MeOH (3 lần), thu dịch lọc Cho dịch lọc vào bình lắng, lắc với
20 ml ether dầu 30 - 60 (2 lần), cô lớp MeOH đến cắn Cân chính xác khoảng 5 mg cắn, hòa cắn bằng pha động trong bình định mức 1 ml, bổ sung đủ thể tích và định lượng bằng HPLC
Trang 3Điều chế tiểu phân nano artemisinin bằng
HPH
Hòa tan chất hoạt động bề mặt vào nước (80
oC), khuấy đều pha nước bằng Ultra-Turrax
(IKA, Đức), tốc độ 10.000 vòng/phút, 5 phút Đun
pha dầu (80 oC) Phối hợp pha dầu vào pha
nước, khuấy đều bằng Ultra-Turrax, tốc độ
10.000 vòng/phút (10 phút), sau đó tăng lên
20.000 vòng/phút (5 phút) Tiếp tục siêu âm nhũ
tương 5 phút hoặc đồng nhất hóa dưới áp suất
cao (máy HPH, APV, Đan Mạch) Để nhũ tương
nano nguội dần ở nhiệt độ phòng sẽ thu được hệ
phân tán nano
Kích thước và phân bố kích cỡ hạt
Kích thước và phân bố kích cỡ được đo bởi
nhiễu xạ tia laser (LA-920 - Horiba, Nhật)
Nguyên tắc của phương pháp là nhiễu xạ và
khuếch tán một chùm ánh sáng dựa theo định
luật xấp xỉ Fraunhofer và lý thuyết Mie Mẫu
được pha loãng trong môi trường nước ở tỷ lệ
1/150 và nhiệt độ phân tích là 25 oC Dựa vào
biểu đồ, xác định kiểu phân bố kích thước, dãy
phân bố kích cỡ, kích thước trung bình của tiểu
phân và giá trị các thông số d50, d90(5,8,11)
TEM
Khảo sát hình thể học của tiểu phân bằng
TEM (JEM 1400 - Jeol, Nhật) để đánh giá tính
chất bề mặt và cấu trúc bên trong tiểu phân(5,8,11)
Pha loãng mẫu bằng nước cất với tỉ lệ phù hợp,
cho mẫu lên lưới đồng Đặt lưới đồng vào đĩa
petri, dùng máy hút ẩm để làm khô mẫu trong
khoảng 24 giờ Khảo sát mẫu từ nguồn electron
của đèn tungsten với điện thế 100 kV Hình ảnh
tiểu phân được phóng đại nhờ các thấu kính từ
và được ghi nhận lại trên màng huỳnh quang,
sau đó camera kết nối với phần mềm điều khiển
của máy tính sẽ nhận tín hiệu và chuyển hình
ảnh về máy tính
Thế zêta
Thế zêta được xác định khi đo tốc độ di
chuyển của tiểu phân trong vùng điện trường
ZS90, Malvern), pha loãng mẫu ở tỉ lệ 1/150 trong môi trường NaCl 0,1 N Cho mẫu vào cốc
đo, tránh sự hình thành bọt khí bên trong cốc đo, tiến hành đo và phân tích kết quả
Định lượng
Xác định hàm lượng ART trong mẫu bằng HPLC (theo phương pháp nêu trên) Công thức tính hàm lượng % (kl/kl) ART trong 100 g công thức như sau:
S c , S t Lần lượt là diện tích đỉnh của dung dịch chuẩn và
dung dịch thử
hoạt chất
Độ ổn định
Khảo sát ở nhiệt độ phòng (30 °C ± 2) và nhiệt độ mát (4 - 8 °C) Thời điểm đánh giá là 1, 2 tháng sau khi bào chế Quan sát bằng mắt thường, hệ tiểu phân không có các hiện tượng kết bông, lắng cặn, tách lớp trong thời gian khảo sát Phân tích dãy phân bố kích cỡ hạt của tiểu phân nano artemisinin trong thời gian khảo sát bằng nhiễu xạ laser, thiết bị LA920, Horiba
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thành lập công thức
Kết quả khảo sát tính tan(3) của artemisinin trong một số tá dược và dung môi cho thấy artemisinin tan một phần trong lipid và tan tốt trong methanol, ethanol so với nước Thành phần công thức bào chế, dựa trên cơ sở của nghiên cứu trước đây đã công bố(10), được trình bày trong bảng 1 Mẫu được đồng nhất hóa bằng siêu âm
Bảng 1: Thành phần công thức bào chế tiểu phân
nano
Trang 4Thay đổi tỉ lệ hỗn hợp lipid rắn - lỏng từ (1 :
9) đến (9 : 1), giữ nguyên thành phần khác Sơ bộ
đánh giá kích thước hạt bằng kính hiển vi quang
học, tất cả mẫu bào chế có hạt to (lớn hơn 1 µm)
và không đồng đều Công thức có tỉ lệ hỗn hợp
lipid rắn – lỏng (7 : 3) và tỉ lệ chất diện hoạt như
bảng 1 cho hệ bền sau một tuần khảo sát (CT1)
Đo kích thước hạt bằng nhiễu xạ laser cho thấy
kiểu phân bố nhiều đỉnh, kích thước trung bình
là 1419 nm, khoảng 11 % hạt dưới 500 nm
Kích thước hạt trung bình quá to so với yêu
cầu, có thể chất nhũ hóa chưa phù hợp Chất
diện hoạt 1 được thay thế bằng chất diện hoạt 3,
giữ nguyên tỉ lệ chất nhũ hóa trong công thức
Tiếp tục khảo sát các công thức có tỉ lệ hai chất
diện hoạt thay đổi từ 1 đến 9 Qua kính hiển vi
cơ học xác định được mẫu cho hạt có kích thước
nhỏ nhất Lấy mẫu để khảo sát phân bố kích cỡ hạt bằng nhiễu xạ laser Kết quả kích thước hạt trung bình là 1645 nm, hạt phân bố nhiều đỉnh, hạt dưới 500 nm chiếm khoảng 8 % Hạt thu được có kích thước trung bình to và dãy phân bố
cỡ hạt rộng hơn so với các công thức dùng chất diện hoạt 1 và 2
Khảo sát với polysorbat (chất diện hoạt 3)
và chất diện hoạt 4
Khảo sát công thức với cặp chất diện hoạt 3
và 4 hoặc 1 và 4, giữ nguyên tỉ lệ chất diện hoạt như bảng 1 Hệ phân tán đạt yêu cầu cảm quan, công thức dùng chất diện hoạt 3 và 4 (CT3) có kích thước hạt nhỏ nhất với biểu đồ phân bố kích cỡ như hình 1
Hình 1: Biểu đồ phân bố kích cỡ của công thức CT3
Các thông số của dãy phân bố kích cỡ:
Các thông số cho thấy CT3 có cải thiện đáng
kể về kích thước hạt trung bình và dãy phân bố
kích cỡ hạt cũng như tỉ lệ hạt có kích thước nhỏ
hơn 500 nm Kích thước hạt trung bình giảm từ
trên 1000 nm xuống còn 439 nm Hạt có kích
thước nhỏ chiếm tỉ lệ nhiều hơn các công thức đã
khảo sát trước đó Điều đó cho thấy các thành
phần và tỉ lệ trong công thức đã khá phù hợp Tuy nhiên, những kết quả này vẫn cần cải thiện hơn do kích thước hạt chưa đều, còn phân bố nhiều đỉnh Cần thay đổi phương pháp đồng nhất hóa kích thước hạt
Đồng nhất hóa bằng áp suất cao (HPH)
Khảo sát các thông số đồng hóa: Đồng hóa 2 cấp với áp suất và số chu kỳ như bảng 2
Bảng 2: Áp suất và số chu kỳ đồng hóa
Trang 5Kích thước tiểu phân của các mẫu khảo sát ở
500 bar và 800 bar không đồng đều, hạt to chiếm
tỉ lệ khá cao (16 %) Mẫu đồng hóa ở 1000 bar
cho kích thước hạt đồng đều nhất, biểu đồ phân
bố kích cỡ hạt đồng hóa ở 1000 bar và 3 chu kỳ như hình 2
Hình 2: Biểu đồ phân bố kích cỡ hạt CT190 1000b 3c
Các thông số của dãy phân bố kích cỡ như
sau:
Áp suất cao hơn (1200 bar), dãy phân bố có
độ rộng tương tự và kích thước hạt trung bình
khoảng 200 nm Như vậy, áp suất 1200 bar
không làm cho tiểu phân có kích thước nhỏ hơn
hay đồng đều hơn Do đó, chọn thông số đồng
nhất hóa là 1000 bar và 3 chu kỳ để đồng nhất
hóa kích thước tiểu phân trong các công thức
chứa artemisinin
Nang hóa artemisinin vào tiểu phân
Nang hóa artemisinin ở các hàm lượng khác
nhau (100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg) vào công
thức Kết quả khảo sát một số tính chất của các
mẫu bào chế như bảng 3
Bảng 3: Tính chất của các công thức bào chế
mặt, không tách lớp, không lắng cặn Phân bố kích
cỡ
- Trung bình (nm)
Độ ổn định (sau
1 tháng)
Hệ tiểu phân vẫn ổn định
Không tách lớp, không lắng cặn, bề mặt có kết bông (rất ít)
Khi tăng khối lượng hoạt chất nang hóa trong hệ phân tán, kích thước và dãy phân bố kích cỡ hạt dường như không thay đổi (Bảng 3).Theo dõi độ ổn định, công thức phối hợp 100
mg và 200 mg artemisinin (lần lượt là CT100 và CT200) có kích thước đạt yêu cầu và bền hơn so với hai công thức còn lại Chính vì thế, CT200 được chọn để đánh giá và khảo sát một số tính chất hóa lý của hệ phân tán nano
Đánh giá một số tính chất của tiểu phân
Cảm quan
Hệ tiểu phân đồng nhất, không lắng cặn, không tách lớp ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ mát
và sau khi ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút
Kích thước và phân bố kích cỡ
Biểu đồ phân bố kích cỡ của CT200 như hình
3
Trang 6Hình 3: Biểu đồ phân bố kích cỡ hạt của công thức phối hợp 200 mg artemisinin
Các thông số của dãy phân bố:
Từ kết quả thu được có thể kết luận công
thức khảo sát có kích thước hạt trung bình và
dãy phân bố kích cỡ nằm trong khoảng kích
thước yêu cầu, nhỏ hơn 400 nm, đây là kích
thước phù hợp so với đường kính nhỏ nhất của
mao mạch (từ 5 – 6 µm)(7) Kích thước nhỏ giúp
tiểu phân có thời gian lưu trong tuần hoàn lâu
hơn (nhờ tránh được sự bắt giữ của hệ thống đại
thực bào) và có thể bào chế với nhiều đường
dùng khác nhau
Hình thể học
Hình ảnh và kích thước của tiểu phân được
khảo sát bằng TEM, kết quả như hình 4
Hình 4: Hình ảnh và kích thước tiểu phân chụp bằng
TEM
Kích thước và phân bố kích cỡ quan sát từ
TEM phù hợp với kích thước đo bằng nhiễu xạ
laser Hình ảnh từ TEM cho thấy tiểu phân có hình cầu, khá đều nhau Tiểu phân có một viền
mờ bao quanh nhìn khá rõ Để đánh giá tính
chất bề mặt cũng như cấu trúc bên trong của tiểu phân một cách đầy đủ hơn, có thể phân tích CryoTEM hoặc DSC và DRX
Thế zêta
Theo kết quả đo được, thế zêta có giá trị -7,89
± 3,57 mV, thấp hơn giá trị cho phép Theo các nghiên cứu, sự ổn định về mặt tĩnh điện đạt được khi trị tuyệt đối của thế zêta lớn hơn 30
mV, tối ưu khi thế lớn hơn 60 mV(4) Nếu chỉ dựa vào thế zêta, có thể đánh giá hệ tiểu phân tạo thành chưa đạt về độ bền
Định lượng hoạt chất
Kết quả sắc ký đồ định lượng artemisinin như hình 5
Dựa vào kết quả định lượng, tính được lượng artemisinin trong 100 g công thức là 133,32 mg, chiếm khoảng 1,3 % so với lipid Quy trình định lượng đã được thẩm định, kết quả quy trình có tính tương thích hệ thống (RSD mẫu chuẩn và thử lần lượt là 1,79 % và 1,12 %), khoảng nồng độ tuyến tính từ 3,125 - 18,75 mg/ml với R2 = 0,996, có độ chính xác cao với RSD% = 1,93 % và tỉ lệ phục hồi trung bình là 99,43 % ± 1,2 %
Hàm lượng artemisinin định lượng được còn thấp so với lượng ban đầu Có thể phương pháp chiết tách qua nhiều giai đoạn loại tạp đã loại mất một phần artemisinin
Trang 7(a) (b)
Hình 5: Sắc ký đồ định lượng HPLC artemisinin chuẩn (a) và artemisinin mẫu thử (b)
Độ ổn định
Kết quả khảo sát kích thước tiểu phân sau
thời gian bảo quản như bảng 4
Bảng 4: Kết quả theo dõi kích thước tiểu phân sau thời gian bảo quản
- Dãy PB (nm)
- KT hạt TB
TP < 100 nm (%)
TP < 200 nm (%)
TP < 300 nm (%)
TP < 400 nm (%)
- Biểu đồ PB
39 - 339
110 22,08 93,76 93,76 99,61 Hình 6a
39 - 339 109,2 19,57 93,61 94,56 99,66 Hình 6b
39 - 339 95,20 36,29 94,27 94,27 99,66 Hình 6c
39 - 339 104,7 22,29 92,45 92,45 99,31 Hình 6d
Hình 6: Biểu đồ phân bố kích cỡ của các mẫu bào chế sau 1 tháng, 2 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ
mát
Theo kết quả khảo sát, sau 2 tháng bảo quản
ở các điều kiện như trên, hệ tiểu phân vẫn ổn
định về kích thước và dãy phân bố Điều đó
chứng tỏ, tiểu phân được che phủ bởi các nhóm
PEG, tạo nên sự cản trở không gian giữa chúng,
nhờ vậy, hệ phân tán trở nên rất bền
KẾT LUẬN
Tiểu phân nano artemisinin đã được bào
chế theo phương pháp tạo nhũ tương và đồng
nhất hóa bằng áp suất cao Dãy phân bố kích
cỡ hạt từ 37 nm - 339 nm, kích thước hạt trung
bình là 99,8 nm Hệ tiểu phân ổn định trong
thời gian 2 tháng
Tuy nhiên, cần tiếp tục khảo sát kích thước
tiểu phân, thế zêta và hàm lượng artemisinin
theo thời gian để đánh giá độ ổn định của hệ tiểu
phân Ngoài ra, cần khảo sát sự tương tác hóa lý
cũng như đánh giá sự giải phóng hoạt chất theo thời gian
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,
Nxb khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tập II, tr 820 - 825
2 Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y
học, 640 – 642
3 Dược điển Việt Nam 4 (2009), Nxb Y học, phần Quy định chung
4 Heurtault B, Saulnier P, Pech B, Proust JE, Benoit JP (2003),
“Physico-chemical stability of colloidal lipid particles”, Biomaterials 24: 4283 - 4300
5 Hu FQ, Jiang SP, Du YZ, Yuan H, Ye YQ, Zeng S (2006),
“Preparation and characteristics of monostearin
nanostructured lipid carriers”, International Journal of
Pharmaceutics 314:83 - 86
6 Mader K, Mehnert W (2005), “Solid lipid nanoparticals -
Concepts, Procedures, and Physicochemical Aspects”, CRC
Press LLC, 2-17
7 Müller RH, Keck CM (2004), “Challenges and solutions for the delivery of biotech drugs - a review of drug nanocrystal
technology and lipid nanoparticals”, Journal of Biotechnology
113:151 - 170
Trang 8and dermatological preparations”, Advanced Drug Delivery
Reviews 54:133 - 141
9 Müller RH, Radtke M, Wissing SA (2007), “Nanostructured
lipid matrices for improved microencapsulation of drugs”,
International Journal of Pharmaceutics 242:121 - 128
10 Trương Công Trị, Khưu Mỹ Lệ, Nguyễn Minh Đức (2011),
“Nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano của rutin”, Tạp chí Y
11 Yuan H, Wang LL, Doo YZ, You J, Hu FQ, Zeng S (2007),
“Preparation and characteristics of nanostructured lipid
carriers for control - releasing progesterone by melt
emulsification”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2-3
Ngày nhận bài báo: 13.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20.12.201 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014