Bài viết báo cáo kết quả bước đầu áp dụng quy trình chẩn đoán tiền làm tổ tại Học viện Quân y. Đối tượng và phương pháp: 20 bệnh nhân (BN) có con bị mắc bệnh di truyền hoặc có tiền sử bị đình chỉ thai vì bệnh di truyền, tiến hành thụ tinh ống nghiệm, sinh thiết phôi chẩn đoán di truyền tiền làm tổ.
Trang 1KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN
TIỀN LÀM TỔ TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y
Nguyễn Đình Tảo*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng*
Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*
TÓM TẮT
Mục tiêu: báo cáo kết quả bước đầu áp dụng quy trình chẩn đoán tiền làm tổ tại Học viện
Quân y Đối tượng và phương pháp: 20 bệnh nhân (BN) có con bị mắc bệnh di truyền hoặc có
tiền sử bị đình chỉ thai vì bệnh di truyền, tiến hành thụ tinh ống nghiệm, sinh thiết phôi chẩn đoán di truyền tiền làm tổ Kết quả: 7 gia đình đã thành công sau khi chuyển phôi, trong đó
2 gia đình có con bị bệnh teo cơ tuỷ (SMA), 5 gia đình có con bị bệnh thalassemia Kết luận:
đã thành công trong việc xây dựng quy trình chẩn đoán một số bệnh di truyền trước khi phôi cấy truyền phôi với sự thành công của 7 gia đình
* Từ khóa: Teo cơ tủy; Gen SMN; Thalassemia; Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ
Primary Results of Applying Protocol of Preimplantation Genetic Diagnosis in Military Medical University
Summary
Objectives: To report the primary results of applying protocol of preimplantation genetic diagnosis in Military Medical University Subjects and methods: 20 patients who had their children with the genetic disease or history of suspended pregnancy for genetic diseases were conducted in vitro fertilization and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis Results:
7 families succeeded after embryo transfer, in which 2 families having children with SMA,
5 families having children with thalassemia Conclusion: We have succeeded in building diagnostic procedures of some genetic diseases before embryo transfer with the success of 7 families
* Key words: Spinal muscular atrophy; SMN gene; Thalassemia; Preimplantation genetic diagnosis
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh teo cơ tủy (Spinal muscular
atrophy - SMA) là bệnh thần kinh cơ, di
truyền lặn do đột biến gen trên nhiễm sắc
thể thường Bệnh SMA đặc trưng bởi thoái
hoá tuần tiến của tế bào sừng trước tuỷ
sống, dẫn đến yếu cơ đối xứng gốc chi,
trương lực cơ và phản xạ gân xương bị
giảm hoặc mất, biến dạng lồng ngực và cứng khớp Tỷ lệ bệnh SMA chung trên toàn thế giới là 1/10.000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ người mang gen bệnh dao động từ 1/40 - 1/60 Theo cách phân loại quốc tế hiện hành, SMA được chia thành ba thể lâm sàng dựa vào tuổi khởi phát bệnh và mức
độ nặng của bệnh: thể nặng, thể vừa và thể nhẹ tương đương với SMA týp I, II và III [8]
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đình Tảo (dinhtao1955@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 20/05/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/07/2016
Ngày bài báo được đăng: 24/07/2016
Trang 2Gen SMN bao gồm 9 exon mã hoá cho phân tử protein SMN dài 294 axít amin Gen
SMN cả hai bản sao giống nhau là gen SMNt (SMN1) và gen SMNc (SMN2) Hai gen
này chỉ khác nhau ở 5 cặp base: một cặp ở intron 6, một cặp ở exon 7, hai cặp ở intron
7 và một cặp ở exon 8 Sự khác nhau ở exon 7 và exon 8 được sử dụng để phân biệt
giữa gen SMNt và SMNc trong chẩn đoán SMA
Người bình thường có cả exon 7 của gen SMNc và gen SMNt, đối với người bị SMA chỉ có exon 7 của gen SMNc, sự khác biệt ở vị trí nucleotid 214 trên exon 7 gen
SMNt là nucleotit C, còn exon 7 gen SMNc là nucleotit T
Hình 1: Sự khác biệt giữa gen SMNt với SMNc
Sự khác nhau ở 1 nucleotid thuộc
exon 7 giữa SMNt và SMNc, khiến cho
SMNt tổng hợp ra phân tử protein SMN
đủ chiều dài và có đủ chức năng, trong
khi protein do SMNc tổng hợp có chức
năng rất hạn chế
Có ba dạng đột biến gen SMN gây
bệnh SMA gồm: dạng 1: đột biến mất
đồng hợp toàn bộ gen SMNt hoặc chỉ mất
đồng hợp một phần gen SMNt; dạng 2:
đột biến chuyển đổi gen SMNt thành
SMNc; dạng 3: đột biến điểm xảy ra ở
gen SMNt của một nhiễm sắc thể, gen
SMNt trên nhiễm sắc thể còn lại trong cặp
tương đồng số 5 bị đột biến dạng 1 hoặc 2
Trong đó, khoảng 95% BN SMA có gen
SMNt bị đột biến thuộc dạng 1 hoặc 2, chỉ
5% BN SMA bị đột biến gen SMNt thuộc
dạng 3 Cả hai dạng 1 và dạng 2 đều
chẩn đoán được bằng cách phân tích sự
có mặt hay không exon 7 SMNt, đây là
cơ sở của phương pháp chẩn đoán gen bệnh SMA
Mỗi trẻ em mắc bệnh SMA ra đời là gánh nặng cho gia đình về tâm lý và tài chính, đồng thời cũng là gánh nặng cho toàn xã hội Do đó, việc chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation genetic diagnosis - PGD) với những gia đình tiểu sử có người mắc bệnh SMA nhằm chọn ra phôi lành để cấy chuyển vào tử cung mẹ, từ đó sinh ra em bé khỏe mạnh là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, nhân văn cao cả
Thalassemia là một trong những bệnh
di truyền đơn gen phổ biến nhất trên thế giới Ở Việt Nam, ước tính có khoảng
5 triệu người mang gen và bị bệnh Hàng năm có khoảng 2.000 trẻ được sinh ra mắc bệnh thalassemia Điều trị cho những trẻ này tạo ra một gánh nặng cả về kinh tế cũng như tinh thần cho gia đình và toàn
Trang 3xã hội Chẩn đoán di truyền trước chuyển
phôi là phương pháp sàng lọc phôi bất
thường về mặt di truyền, được thực hiện
trước khi cấy phôi vào tử cung người mẹ,
đây là một phương pháp dự phòng hiệu
quả cho các bệnh di truyền, trong đó có
thalassemia Để thực hiện được điều này,
cần một quy trình phát hiện đột biến gen
trên một tế bào Đây cũng là một khó
khăn của kỹ thuật PGD mang lại hy vọng
cho những cặp vợ chồng bị thất bại nhiều
lần trong thụ tinh ống nghiệm nhưng không
rõ nguyên nhân Ngoài ra, PGD còn áp dụng
cho những bà mẹ lớn tuổi để hạn chế bất
thường về di truyền Trên thế giới hiện nay
có khoảng 300 gen liên quan đến bệnh có
thể được phát hiện bằng PGD
Trên cơ sở thực hiện nghiên cứu “Nghiên
cứu quy trình chẩn đoán một số bệnh di
truyền trước chuyển phôi để sàng lọc
phôi thụ tinh trong ống nghiệm”, chúng tôi
báo cáo: Kết quả bước đầu áp dụng quy
trình chẩn đoán tiền làm tổ tại Học viện
Quân y
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
20 gia đình, vợ < 35 tuổi, có con đang
điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương và
Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương,
được chẩn đoán bị bệnh SMA do mất
đồng hợp tử exon 7 gen SMNt hoặc bị bệnh
thalassemia
2 Phương pháp nghiên cứu
- Tách ADN từ tế bào máu ngoại vi của
bố, mẹ và con của tất cả gia đình có con
bị bệnh thalassemia và SMA
- Chuẩn bị kích trứng cho người mẹ của các gia đình đăng ký tham gia làm PGD
- Sinh thiết phôi bào từ các phôi ngày
3 hoặc ngày 5
- Khuếch đại bộ gen từ tế bào phôi sau sinh thiết bằng bộ kít RepliG (Qiagen)
- Tiến hành phản ứng PCR nhân exon 7, exon 8 gen SMN từ các mẫu phôi chẩn đoán SMA
- Tiến hành nhân gen chạy minisequencing
và TripAssay cho các mẫu phôi và bố mẹ, con của các gia đình đã chẩn đoán thalassemia
- Chẩn đoán bệnh thalassemia và SMA cho các phôi đã sinh thiết
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Kết quả chẩn đoán phôi của gia đình mang gen SMA
Khuếch đại exon 7, exon 8 của gen SMN bằng kỹ thuật nested-PCR bằng hai cặp mồi đặc hiệu exon 7, exon 8 gen SMN qua hai vòng Chu trình nhiệt PCR được thực hiện trên máy khuếch đại gen efpendorft trong điều kiện: 960C/5 phút; [940C/1 phút; 550C/1 phút; 720C/1 phút]
x 25 chu kỳ; 720C/10 phút
Lấy sản phẩm PCR của vòng 1 làm mẫu cho phản ứng PCR vòng 2 Chu trình nhiệt PCR thực hiện trên máy khuếch đại gen efpendorft trong điều kiện: 960C/5 phút; [950C/30 giây; 550C/30giây; 720C/45 giây] x
35 chu kỳ; 720C/5 phút
Sản phẩm PCR ủ với enzym giới hạn Dra I và DdeI trong thời gian từ 2 - 3 giờ Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 3%
Trang 4- Sản phẩm sau khi cắt enzym của exon
7 gen SMNt (188 bp) và exon 7 gen SMNc
(164 bp và 24 bp)
- Sản phẩm sau khi cắt enzym của exon
8 gen SMNt (190 bp) và exon 8 gen SMNc
(120 bp, 70 bp)
Hình 2: Kết quả điện di trên gel agarose
2% sản phẩm PCR của gia đình BN C3:
ladder 50 bp
Sản phẩm PCR exon 7 khi chưa ủ với
enzym DraI (Ko DraI) và exon 8 khi chưa
ủ với enzym DdeI (Ko DdeI) của cả bố BN
C3 (B3), mẹ BN C3 (M3), BN C3 đều giống
nhau, cùng có băng 188 bp - sản phẩm nhân
của exon 7 và băng 190 bp - sản phẩm nhân
exon 8
Nhưng khi ủ sản phẩm PCR với enzym
DraI thấy:
- B3 và M3 đều có hai băng tương ứng
là 188 bp và 164 bp, có nghĩa cả B3 và
C3 đều có exon 7 SMNt (không bị cắt -
188 bp), exon 7 SMNc bị cắt thành hai
mảnh (164 bp và 24 bp)
- Trong khi đó con C3 chỉ có 1 băng
tương ứng 164 bp, nghĩa là con C3 bị mất
đồng hợp exon 7 SMNt, chỉ có exon 7
SMNc nên bị enzym giới hạn cắt thành
hai băng (164 bp, 24 bp), điều này phù hợp
với kết quả của Bệnh viện Nhi Trung ương
Hình 3: Kết quả điện di trên gel agarose 3%
sản phẩm PCR sau khi ủ với enzym giới hạn của gia đình BN C7: ladder 100 bp
Cả bố (B7) và mẹ (M7) của BN C7 đều
có exon 7 gen SMNt nên khi ủ sản phẩm
PCR với enzym giới hạn DraI có hai băng (188 bp của exon 7 SMNt và 164 bp của exon 7 SMNc), tương tự đối với exon 8
của gen SMN Như vậy, BN C7 cũng mất
đồng hợp exon 7 và exon 8 của gen
SMNt BNC3 mất đồng hợp exon 7 và 8
gen SMNt
Trang 5Các phôi sinh thiết của 3 gia đình có con bị bệnh SMA cũng được chẩn đoán bằng phương pháp này Gia đình số 3 có 3 phôi sinh thiết ngày 3; gia đình số 7 thụ tinh được 3 phôi, nhưng các phôi không phát triển đến ngày 3 Do vậy, không có phôi sinh thiết; gia đình số 18 được 5 phôi sinh thiết ngày 3 Chúng tôi thu được một số kết quả sau:
Bảng 1: Kết quả phát hiện đột biến gen SMNt trên máu toàn phần và trên phôi sinh
thiết của 3 gia đình có con mắc bệnh SMA
Kết quả: được 1 phôi bình thường
Không có phôi sinh thiết
Kết quả: phôi số 4 được chuyển và thành công
Tất cả bố, mẹ của các BN trên đều có mặt exon 7, 8 SMNt và thực tế, các cặp bố
mẹ đều là người không có biểu hiện bệnh SMA Nghĩa là, một nhiễm sắc thể trong cặp
tương đồng số 5 có gen SMNt bình thường (dạng dị hợp) cũng dịch mã đủ lượng
protein SMN (survival motor neurone) cho tế bào thần kinh vận động hoạt động bình thường Các phôi bình thường của những gia đình này được chuyển phôi, kết quả:
2 gia đình có con bị bệnh SMA đã có con khỏe mạnh (Lê Thị H, Nguyễn Văn V, SMA, chọc noãn 25/11/2014 chuyển phôi lần 1 không kết quả; chuyển phôi lần 2 ngày 30/3/2015, sinh con khỏe mạnh ngày 12/12/2015 Phạm Thị Việt H, Nguyễn Tuấn A, SMA Nghệ An; chọc noãn 19/5/2015, sinh thiết 5 phôi; phôi 1 bị bệnh; phôi 2, 3, 4 bình thường; phôi 5 chưa có thông tin di truyền; chuyển phôi ngày 18/6/2015; đã mang thai, sinh con gái ngày 28/2/2016 Gia đình Phạm Thị H, Nguyễn Văn V, SMA; chọc noãn ngày 16/12/2014; sinh thiết được 3 phôi; phôi 1; phôi 2 bình thường; phôi 3 bị bệnh; chuyển phôi 12/3/16, không kết quả)
Trang 62 Kết quả chẩn đoán thalassemia của gia đình và mẫu phôi sinh thiết của
17 gia đình tham gia nghiên cứu
Hình 3: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THM16, THB16
THM16 mang kiểu gen dị hợp tử Cd26, píc trên màu đen là nucleotid C (bình thường), píc dưới màu đỏ là nucleotid T (đột biến)
THB16 mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, píc trên xanh lá cây là nucleotid A (đột biến), píc dưới đỏ là nucleotid T (bình thường)
Hình 4: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC16
Mẫu nghiên cứu THC16 mang kiểu gen dị hợp tử cả hai đột biến Cd26/Cd17
Trang 7Hình 5: Hình ảnh TripAssay của mẫu nghiên cứu THB16, THC16, THM16
Kết quả chẩn đoán xác định đột biến bằng kỹ thuật minisequencing được kiểm chứng bằng bộ kít TripAssay cho kết quả phù hợp: vị trí đột biến trên mẫu của bố là Cd17 dị hợp tử, mẹ là Cd26 dị hợp tử, con mang cả 2 đột biến Cd17 và Cd26
Hình 6: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THB24, THM24
THB24, THM24 mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, píc trên xanh lá cây là nucleotid A (đột biến), píc dưới đỏ là nucleotid T (bình thường)
Trang 8Hình 7: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC24
THC24 mang kiểu gen đồng hợp tử Cd17, chỉ xuất hiện 1 píc xanh lá cây A (đột biến) Gia đình này có 6 phôi được sinh thiết ngày 5 để chẩn đoán xác định đột biến với kết quả: 1 phôi bình thường không mang gen đột biến (phôi số 1), 2 phôi đồng hợp tử Cd17 (phôi 2 và phôi 3) và 3 phôi mang gen dị hợp tử Cd17 (phôi số 4, 5, 6) Dưới đây là kết quả nhân gen bằng kỹ thuật minsequencing và kiểm tra lại bằng bộ kít TripAssay:
Hình 8: Hình ảnh điện di minisequenicng 6 phôi của gia đình 24
Từ hình ảnh trên cho thấy mẫu số 1 có xuất hiện píc huỳnh quang của nucleotid T, đây là vị trí nucleotid bình thường Do vậy, phôi số 1 này là một phôi không mang gen gây bệnh, phôi bình thường Phôi số 2 và phôi số 3 đều xuất hiện píc huỳnh quang của nucleotid A Vị trí nucleotid này là vị trí đột biến, do vậy phôi số 2 và phôi số 3 mang gen đồng hợp tử Cd17, phôi bị bệnh Các phôi số 4, 5, 6 xuất hiện cả 2 píc huỳnh quang của nucleotid A và T, do đó các phôi này mang gen dị hợp tử Cd17, phôi chỉ mang gen nhưng không phát hiện bệnh
Trang 9Hình 9: Hình ảnh chẩn đoán 6 phôi sinh thiết bằng kít TripAssay
Đây là hình ảnh chẩn đoán 6 phôi sinh thiết ngày 5 của gia đình số 24, trong 6 phôi này, 2 phôi mang gen đồng hợp tử Cd17, là phôi số 2 và số 3 Các phôi này khi lai TripAssay thấy xuất hiện vạch tại vị trí đột biến Cd17 và mất cả vạch tại vị trí bình thường của Cd17 Phôi số 1 không xuất hiện vạch đột biến Do vậy, phôi số 1 bình thường Phôi số 4, 5, 6 xuất hiện vạch đột biến, nhưng chưa mất vạch ở vị trí bình thường nên các phôi này chỉ mang gen dị hợp tử Cd17, phôi không biểu hiện bệnh Tương tự như trên, kết quả của gia đình số 23 được 16 phôi ngày 3, trong đó 14 phôi tốt
6 - 10 tế bào, 2 phôi 4 - 6 tế bào, ngày 5 có 5 phôi phát triển bình thường được sinh thiết
Đã chẩn đoán di truyền bệnh thalassemia cho tất cả các phôi Một số gia đình tạo được phôi, nhưng các phôi phát triển bất thường; Do vậy, không có phôi sinh thiết Một số gia đình có phôi được chẩn đoán và đang được chuyển phôi, một số gia đình khác phôi đã chuyển lần 1, nhưng chưa đậu phôi, đang chờ chuyển lần 2 Trong số những
BN thalassemia, có 5 gia đình đậu phôi, trong đó 2 gia đình đã sinh con khỏe mạnh và
3 gia đình đang mang thai
Trang 10KẾT LUẬN
- Đã xây dựng quy trình chẩn đoán một
số bệnh di truyền trước chuyển phôi để
sàng lọc phôi thụ tinh trong ống nghiệm
- Đã ứng dụng quy trình PGD thành
công trên BN thalassemia và SMA, tổng
số 7 gia đình, trong đó 2 gia đình SMA và
5 gia đình thalassemia
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Dreesen JC, Bras M, Die - Smulders C
et al Preimplantation genetic diagnosis of
spinal muscular atrophy Mol Hum Reprod
1998, 4 (9), pp.881-885
2 Graeme Daniels, Rachel Pettigrew, Alan
Thornhill et al Six unaffected livebirths
following preimplatation diagnosis for spinal
muscular atrophy Mol Hum Reprod 2001, 7
(10), pp.995-1000
3 Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S et al
Identification and characterization of a spinal
muscular atrophy-determining gene Cell
1995, 80, pp.155-165
4 Rodrigues NR, Owen N, Talbot K,
Ignatius J, Dubowitz V, Davies KE Deletions
in the survival motor neurone gene on 5q13 in
autosomal recessive spinal muscular atrophy
Hum Mol Genet 1995, 4, pp.631-634
5 Taylor JE, Thomas NH, Lewis CM et al
Correlation of SMNt and SMNc gene copy
number with age of onset and survival in
spinal muscular atrophy Eur J Hum Genet
1998, 6, pp.467-474
6 Ng IS, Law HY Challenges in screening
and prevention of thalassaemia in Singapore Asian-Oceanian Journal of Paediatrics and Child Health 2003, 2, pp.29-38
7 Wang W, Kham SK, Yeo GH, Quah TC, Chong SS Multiplex minisequencing screen
for common Southeast Asian and Indian beta-thalassaemia mutations Clin Chem 2003, 49, pp.209-218
8 Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O, Ivakhnenko V, Evsikov S, Wolf G et al
Preimplantation diagnosis of thalassaemias
J Assist Reprod Genet 1998, 15, pp.219-225
9 Deng J, Peng WL, Li J, Fang C, Liang
XY, Zeng YH et al Successful preimplantation
genetic diagnosis for alpha-and beta-thalassaemia in China Prenat Diagn 2006, 26, pp.1021-1028
10 De Rycke M, Van de Velde H, Sermon
K, Lissens W, De Vos A, Vandervorst M et al
Preimplantation genetic diagnosis for sickle-cell anemia and for beta-thalassaemia Prenat Diagn 2001, 21, pp.214-222