Bài viết có nội dung trình bày về phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao chiết từ lá trầu không. Nghiên cứu thực hiện sử dụng sắc ký cột với sự hỗ trợ của sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hiện hình sinh học, phương pháp khuếch tán và phương pháp pha loãng để xác định hoạt tính kháng nấm của hoạt chất.
Trang 1PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HOẠT CHẤT
KHÁNG NẤM CÓ TRONG CAO CHIẾT TỪ LÁ TRẦU KHÔNG
Nguyễn Thu Gương*, Nguyễn Vũ Giang Bắc*, Lê Thị Lệ Uyên**, Nguyễn Đinh Nga*
TÓM TẮT
Mục tiêu: phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm có trong cao Trầu không
Vật liệu và phương pháp:
Cao trầu không (cao TK): được chiết xuất từ lá Trầu không thu hái ở Hóc Môn, TP.HCM Cao TK cho tác động kháng nấm men, nấm da, một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm
Phương pháp phân lập hoạt chất kháng nấm từ cao TK: Sử dụng sắc ký cột với sự hỗ trợ của sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hiện hình sinh học, phương pháp khuếch tán và phương pháp pha loãng để xác định hoạt tính kháng nấm của hoạt chất
Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng nấm trong cao TK bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H NMR và 13 C NMR)
Kết quả và bàn luận:
Đã phân lập và xác định được hoạt chất kháng nấm có trong cao TK là hydroxychavicol Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt chất cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có trong cao chiết từ lá Trầu không ở Ấn Độ, Mã lai,…
Từ khóa: Cao Trầu không, hydroxy chavicol
ABSTRACT
ISOLATING AND DETERMINING CHEMICAL STRUCTURE OF ANTIFUNGAL PRINCIPLE AGENT
IN BETLE EXTRACT
Nguyen Thu Guong, Nguyen Vu Giang Bac, Le Thi Le Uyen, Nguyen Dinh Nga
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 2 - 2014: 235 - 239
Objectives: Isolation and determination of chemical structure of antifungal agent in the betle extract Material and methods: Betle extract was produced from leaves of Piper betle L Piperaceae, harvested in
Hoc Mon, District 12, HCM city The antifungal agent in betle extract was isolated by column chromatography
in support with thin layer chromatography (TLC), autobiography, disk diffusion and broth dilution method Chemical structure of the antifungal agent in betle extract were determined by using TLC, GC, GC-MS, 1 H NMR and 13 C NMR
Outcome: The antifungal agent in betle extract was determined as hydroxy chavicol These results may be
used in verify raw material and betle products
Key words: Betle extract, hydroxy chavicol
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trầu không (Piper betle L Piperaceae) được
trồng nhiều nơi ở Việt Nam Lá Trầu không đã
được dùng nhai với cau để làm chắc răng, thơm
miệng Ngoài ra, y học cổ truyền còn dùng lá Trầu không chữa cảm, giảm đau trong bong gân, làm lành vết thương, se niêm mạc, kích thích tiết men gan, làm lành vết thương, kích thích sinh
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Trang 2dục, trị hắc lào, lang ben,…
Trong một số nghiên cứu ở các nước Đông
Nam Á như Ấn Độ, Mã Lai, các tác giả đã phân
lập được từ cao lá Trầu không, chiết với nước
hoặc cồn ethyl hợp chất hydroxychavicol(Error!
Reference source not found.), và chứng minh đây là hợp chất
chính cho tác động kháng khuẩn, đặc biệt là
những vi khuẩn gây hôi miệng, gây sâu răng(4);
kháng Aspergillus, nấm da, C albicans, C
glabrata(Error! Reference source not found.) và kháng ung thư(1)
Ở Việt Nam, cao chiết từ lá Trầu không và
tinh dầu Trầu không đã được chứng minh
kháng C albicans in vitro(3), Betelvine (cao chiết từ
lá Trầu không) phối hợp với sucrategel cho hiệu
quả giảm đau trên các bệnh nhân viêm dạ dày
mạn tính có Helicobacter pylori(6)
Nhằm tạo cơ sở cho việc xây dựng tiêu
chuẩn cao trầu không, hướng ứng dụng làm
thuốc kháng nấm, mục tiêu chính của đề tài
nhằm “Phân lập và xác định cấu trúc hóa học
của hoạt chất kháng nấm có trong cao chiết từ lá
Trầu không”
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Cao Trầu không
Cao trầu không được chiết xuất từ bột lá
Trầu không thu hái ở Hóc Môn, quận 12, TP
HCM theo qui trình sau: Bột lá trầu được ngâm
lạnh với ethanol 96% theo tỷ lệ 1:10 trong 24h
Dịch chiết ethanol được cô ở 40 oC với áp suất
giảm đến còn khoảng 1/10 thể tích ban đầu Cao
chiết 1:1 được loại chlorophyll bằng ether dầu
hỏa và lắc phân bố với dichloromethan, dịch
chiết dichloromethan được thu hồi dung môi ở
50 oC để có cao Trầu không (cao TK) Cao TK
chiết theo qui trình trên cho tác động kháng C
albicans , Trichophyton mentagrophytes, T rubrum,
T tonsurans, Microsporum gypseum, Malassezia
furfur, với MIC từ 0,064–0,512 mg/ml
Vi nấm sử dụng trong các thí nghiệm:
Candida albicans ATCC 10231
Phương pháp nghiên cứu
Phân lập hoạt chất kháng nấm có trong cao Trầu không
Hoạt chất kháng nấm trong cao TK được phân lập bằng sắc ký cột
Điều kiện sắc ký: Cột 30 cm x 0,5 cm; Chất hấp phụ: silica – gel G; cỡ hạt: 60 µm 10g hoạt hóa ở
105 oC/ 1 giờ ; Lượng mẫu: 0,6 g cao CH2Cl2
tương ứng với 30 g dược liệu khô; Dung môi khai triển CH2Cl2, CH2Cl2-EtOAc, MeOH; Tốc độ chảy: 11 giây/ giọt; Thể tích mỗi ống hứng: 2 ml Gộp các phân đoạn có cùng tính chất trên sắc ký lớp mỏng, khảo sát tác động kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán và kỹ thuật hiện hình sinh học để xác định phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm trong cao Trầu không
Kỹ thuật hiện hình sinh học: Phân đoạn cho tác động kháng nấm từ sắc ký cột được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng và xác định vết sắc ký cho tác động kháng nấm Điều kiện thực hiện: Bản mỏng Silicagel F 254 (Merck), dày 0,25 mm,
20 x 20 cm; Dung môi khai triển: n- Hexan – EtOAc – MeOH (4: 2: 1); Phát hiện các vết bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm; Vi
nấm thử nghiệm: Candida albicans ATCC 10231;
Môi trường thử nghiệm: thạch Sabouraud Xác định mức độ tinh khiết của hoạt chất kháng nấm bằng sắc ký lớp mỏng 2 chiều (Chiều 1: CH2Cl2 – EtOAc (8:2); Chiều 2: n-Hexan – Dietylete (4:6)); sắc ký khí và phổ UV-Vis
Xác định cấu trúc của hoạt chất kháng nấm trong cao TK bằng phổ khối, 1H NMR và 13C NMR
Tác động kháng Candida albicans của cao
Trầu không và hoạt chất kháng nấm được xác đinh bằng phương pháp pha loãng theo hướng dẫn của CLSI M27-A2 Môi trường sử dụng: Mueller Hinton broth bổ sung xanh methylen và glucose
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập hoạt chất kháng nấm trong cao TK
Phân lập hoạt chất kháng nấm trong cao TK
Sau khi cao TK (0,6 g) được triển khai qua cột
Trang 3đã thu được 10 phân đoạn, chỉ có PĐ 1 ở dạng
dầu, màu vàng xanh (206,7 mg) và PĐ 2, tinh thể
trắng xám, dễ chảy lỏng, Rf = 0,54, chiếm 307,4
mg cho tác động kháng C albicans với đường
kính vòng kháng nấm là 28 mm, các phân đoạn
còn lại không cho tác động kháng nấm Sắc ký
đồ của phân đoạn 2 trên sắc ký lớp mỏng sạch và
tinh hơn phân đoạn 1 nên được sử dụng trong
các nghiên cứu tiếp theo
Kiểm tra phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm (PĐ 2) bằng sắc ký lớp mỏng và kỹ thuật hiện hình sinh học
Kết quả ở hình 1 cho thấy phân đoạn chứa hoạt chất kháng nấm chỉ cho 1 vết duy nhất ở sắc
ký đồ sắc ký lớp mỏng (SKLM) một chiều (Rf = 0,54) và hai chiều Vết này cho vòng kháng nấm
ở kỹ thuật hiện hình sinh học
Hình 1: Phân đoạn chứa chất kháng
nấm cho 1 trên sắc ký đồ SKLM và cho
vòng kháng nấm xác định bằng kỹ
thuật hiện hình sinh học
Hình 2: Sắc ký đồ sắc ký 2 chiều hoạt chất chiết từ cao TK (A: Phát hiện vết bằng UV 254 nm; B: Phát hiện bằng thuốc thử VS)
Kiểm tra hợp chất kháng nấm bằng UV – vis
và sắc ký khí
Kết quả ở hình 3 và 4 cho thấy sắc ký đồ GC
của hợp chất kháng nấm trong cao TK chỉ cho
một đỉnh có thời gian lưu 35,56 và phổ UV – Vis
của chất này cũng chỉ có 1 đỉnh hấp thu duy nhất
tại 282 nm
Hình 3: Sắc ký đồ GC của hợp chất kháng nấm
Hình 4: Phổ UV –Vis của hợp chất kháng nấm
Xác định MIC của hợp chất phân lập từ cao
TK
Từ kết quả sắc ký lớp mỏng 1 chiều, 2 chiều,
kỹ thuật hiện hình sinh học, phổ UV-Vis, sắc ký khí và MIC cho thấy hợp chất có trong phân đoạn phân tách từ cao TK chỉ chứa một chất, chất này là hoạt chất chính cho tác động kháng nấm có trong lá Trầu không
Bảng 1: Nồng độ MIC của chất kháng nấm và cao TK
1
2
1
2
VK
Trang 4trên C albicans
Xác định cáu trúc hóa học của hoạt chất
kháng nấm trong cao TK
Bảng 2: Dịch chuyển hóa học trong phổ 1 H NMR của
chất kháng nấm có trong cao TK
STT Độ dịch chuyển
hóa học (ppm)
Dạng đỉnh
Hằng số ghép (Hz)
Số proton
Vị trí proton
STT Độ dịch chuyển hóa học (ppm)
Dạng đỉnh
Hằng số ghép (Hz)
Số proton
Vị trí proton
Bảng 3: Dịch chuyển hóa học trong phổ 13 C NMR của chất kháng nấm có trong cao TK
OH
OH
3
4 5
6
1' 2' 3'
Hình 5 Phổ khối của hợp chất kháng nấm trong cao TK 2-hydroxy chavicol
Qua phân lập và xác định hoạt chất kháng
nấm có trong cao TK, các dữ liệu phổ khối (hình
5), 1H NMR và 13C NMR của hoạt chất kháng
nấm trong cao TK, với độ dịch chuyển hóa học ở
bảng 2 và bảng 3, cho thấy cấu trúc hóa học của
chất kháng nấm trong cao TK phù hợp với cấu
trúc của 2-hydroxychavicol với công thức
nguyên C9H10O2, MW là 150 (7) Kết quả này phù
hợp với các nghiên cứu trước đây về hoạt chất
cho tác động kháng nấm – kháng khuẩn có trong
cao chiết từ lá Trầu không ở một số nước Châu Á
như Ấn Độ (2), Mã lai (4), …
KẾT LUẬN
Lá trầu không đã được sử dụng nhiều trong
y học cổ truyền Việt Nam từ xưa đến nay nhưng
vẫn chưa được nghiên cứu một cách có hệ thống
Các kết quả thu được này có thể được ứng dụng trong kiểm nghiệm nguyên liệu và các sản phẩm chiết xuất từ lá Trầu không
TÀI LIỆU THAM KHẢO
(2012), “Evaluation of the In vitro antioxidant, Anti-Enteropathogenic and Anticancer Efficacy of Natural and Synthetic Hydroxychavicol”, Int J Med Res.,1(5): 250-254
ethnobotany, phytochemistry, pharmacological profile and profiling by new hyphenated technique DART-MS (Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry)”, Journal of Pharmacy Research, 4(9): 2991-2997
và tác động kháng Candida spp của tinh dầu và cao chiết từ
lá Trầu không Việt Nam”, Tạp chí Dược Học, 410: 27-30
Extract of Piper betle L and its Antibacterial Effect Towards Streptococcus mutans”, American Journal of Biotechnology and Biochemistry 3 (1): 10-15
Trang 5Piper betle Linn”, The Pharma Research, 01: 110-113
giảm đau của phác đồ BETELVINE (TRẦU KHÔNG) +
SUCRATEGEL (BS) trong điều trị chứng viêm dạ dày mạn
tính nhiễm HP (vị quản thống)”, Y học thực hành, 7(774): 159
http://chemeo.com/cid/33-057-2
Ngày nhận bài báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014