Trong đề tài này được thực hiện nhằm nghiên cứu này nhằm phân lập, nuôi cấy, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc (TBG) từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin giống tế bào beta. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN ĐỂ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH THÁO ĐƯỜNG TYPE 2
Trần Đặng Xuân Tùng*, Đặng Vạn Phước**, Lê Thị Bích Phượng*, Phạm Văn Phúc***
TÓM TẮT
Mục tiêu: nghiên cứu này nhằm phân lập, nuôi cấy, tăng sinh và biệt hóa tế bào gốc (TBG) từ mô mỡ thành
tế bào tiết insulin giống tế bào beta
Đối tượng và phương pháp: mô mỡ được thu nhận từ người tình nguyện Sau đó, tế bào gốc từ mô mỡ
được phân tách bằng bộ kit ADSC extraction kit và nuôi cấy trong môi trường MSCult kit để làm giàu tế bào gốc ứng viên Các tế bào gốc này được khẳng định các đặc điểm của tế bào gốc trung mô bằng cách xác định các marker bề mặt Cuối cùng tế bào gốc được biệt hóa thành tế bào tiết insulin trong môi trường chuyên biệt bổ sung các chất nicotinamide, exendin-4, B27
Kết quả: qui trình này là thu nhận được 1,01 x 10 6 tế bào trong 1 gram mỡ , trong đó có 78,3 ± 5,7% tế bào sống và tỷ lệ tế bào gốc là 7,15 ± 2,22%, qui trình biệt hóa thành công tế bào gốc này thành tế bào tiết insulin
Kết luận: số lượng tế bào gốc thu được đủ dùng trong các nghiên cứu và nhân lên ứng dụng trong điều trị,
qui trình biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin là hoàn toàn khả thi
Từ khóa: Tế bào gốc, tế bào gốc từ mô mỡ, tế bào tiết insulin, biệt hóa
ABSTRACT
DIFFERENTIATION THE ADIPOSE DEVIRED STEM CELL TO INSULINE PRODUCING CELL
FOR DIABETTES MELLITUS TREATMENT
Tran Dang Xuan Tung, Dang Van Phuoc, Le Thi Bich Phuong, Pham Van Phuc
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - No 2 - 2014: 50 - 54
Purposes: This research is carried out in order to subdivide, culture, multiple and differentiate adipose
derived stem cell (ADSC) to insulin producing cells, which similar to beta cells
Subjects and Methods: Adipose tissue was obtained from healthy volunteer Adipose derived cells is
isolated by ADSC extraction kit and cultured in MSCult kit to enrich stem cell candidate These cells are identified as stem cells by defining surface markers following the definition of Mesenchymal stem cells Finally, ADSC is differentiated to insulin producing cells in specific medium supplemented with nicotinamide, exendin-4, B27
Results: we can obtain1,01 x 10 6 cells in 1 gram of adipose tissue with stem cell percentage be 7,15± 2,22%,
it is 78,3 ± 5,7% life cells and 7,15 ± 2,22% stem cells ADSC is differentiated successfully to Insulin producing cells
Conclusion: the quality of stem cell have been derived, that is enough for research and culture to clinical
treatment The process for differentiation stem cell to insulin producing cell is realizable
Key words: stem cell, adipose devised stem cell (ADSC), insulin producing cell, differentiation
GIỚI THIỆU
Đái tháo đường là một bệnh mãn tính, gây ra
do tình trạng thiếu insulin tuyệt đối hoặc tương
đối của cơ thể Đặc trưng của bệnh là tình trạng đường huyết tăng cao, kèm theo đó là các rối loạn quan trọng chuyển hóa carbohydrate, protein, lipid và chất khoáng Các rối loạn này sẽ dẫn đến
* *Bệnh viện đa khoa Vạn Hạnh **Đại Học Y Dược TpHCM ***Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TpHCM
Tác giả liên lạc: ThS Trần Đặng Xuân Tùng ĐT: 0903120280 Email: dr_xuantung@yahoo.com
Trang 2nhiều biến chứng cấp tính và mạn tính
Nhằm ngăn ngừa các biến chứng cũng như tử
vong từ bệnh đái tháo đường, bệnh nhân cần
phải kiểm soát đường huyết chặt chẽ tùy theo
mục tiêu của từng đối tượng Khi những tiềm
năng to lớn của tế bào gốc được khám phá, nó
mang lại hi vọng sử dụng tế bào gốc như một
phương pháp điều trị hứa hẹn cho bệnh nhân đái
tháo đường Trong vòng hai thập niên qua, nhiều
nghiên cứu về liệu pháp tế bào gốc trong điều trị
bệnh đái tháo đường được tiến hành Các nghiên
cứu này đã điều trị được nguyên nhân gây bệnh
và mang lại kết quả ổn định lâu dài(3,8)
Tại Việt Nam, nhiều tác giả đã thành công
trong việc biệt hóa tế bào gốc thu nhận từ máu
cuống rốn hoặc tủy xương thành tế bào tiết
insulin và đã thử nghiệm thành công trên mô
hình động vật(7) Tuy nhiên, những phương pháp
này còn có những hạn chế nhất định như tính
xâm lấn trong việc thu nhận tế bào gốc từ tủy
xương hay người bệnh không có nguồn lưu trữ
máu cuống rốn hay dây rốn… Do đó, việc phát
hiện ra tế bào gốc từ mô mỡ đã mở ra một tương
lai mới trong việc ứng dụng tế bào gốc trong điều
trị đái tháo đường do những ưu điểm: mô mỡ dễ
phân tách, thủ thuật thu nhận ít xâm lấn(9)
Với những kết quả trên, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu này nhằm (1) xây dựng quy trình thu
nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, (2) biệt hóa
tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết
insulin, (3) đánh giá chất lượng tế bào đã biệt hóa
để ứng dụng vào điều trị bệnh đái tháo đường
type 2, đồng thời là những thử nghiệm cơ bản với
các số liệu ban đầu mang tính chất tham khảo
cho các nghiên cứu lớn sau này
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp nghiên cứu: In vitro
Sinh phẩm nghiên cứu
Mô mỡ của người tình nguyện được lấy tại
Bệnh viện Đa khoa Vạn Hạnh TP.Hồ Chí Minh
Tiêu chuẩn chọn mẫu
Mô mỡ có kết quả âm tính với HIV, HBV,
HCV thông qua các xét nghiệm PCR Lượng mỡ thu nhận tối thiểu 100ml (kể cả chất gây tê)
Tiêu chuẩn loại mẫu
Mô mỡ được lấy ở những người tình nguyện
có bệnh lý gây viêm hoặc có dấu hiệu nhiễm trùng vùng lấy mẫu
Các quy trình và thao tác được thực hiện tại Phòng thí nghiệm nghiên cứu và ứng dụng Tế bào gốc và Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.Hồ Chí Minh
Qui trình nghiên cứu gồm các giai đoạn sau: Thu nhận mỡ
Thu nhận SVF và nuôi cấy TBG từ mô mỡ Định lượng, định danh TBG sau phân tách Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin Kiểm tra sự nhiễm khuẩn, nhiễm nấm và bộ NST của tế bào tiết insulin
Đánh giá sự biệt hóa thành tế bào tiết insulin
Giai đoạn 1: Thu nhận mỡ bụng
Bệnh nhân được gây mê mask thanh quản phối hợp tê tại chỗ bằng lidocaine Thu mỡ dưới
da của vùng bụng dưới rốn, hút đều hai bên đối xứng qua đường trắng giữa bụng Bơm vào mô
mỡ 100ml nước muối sinh lí với hỗn hợp nồng độ Lidocain 1% và adrenaline 1/1000000 Hút mỡ bằng tay nhẹ nhàng tránh tổn thương các tế bào
Số lượng hút là 100ml hỗn hợp mô mỡ và nước muối sinh lý trên 1 tình nguyện viên
Giai đoạn 2: Thu nhận phân đoạn mạch nền (SVF) và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ:
Bước 1: Xử lí sơ bộ mẫu
Bước 2: Rửa mẫu bằng Washing buffer 1 Bước 3: Lặp lại bước 2
Bước 4: Rửa mẫu bằng Washing buffer 2 Bước 5: Lặp lại bước 4
Bước 6: Phân tách mẫu
Bước 7: Thu nhận tế bào
Bước 8: Rửa tế bào
Bước 9: Sử dụng hay nuôi cấy tế bào
Trang 3Huyền phù cặn trong môi trường
DMEM/F12 10% FBS nuôi ở điều kiện 370C, 5%
CO2
Thay môi trường 3 ngày/lần đến khi tế bào
phát triển 70% bề mặt flask và cấy chuyền dùng
hóa chất trypsin 0,25%
Giai đoạn 3: Định lượng, định danh tế bào gốc
sau phân tách:
Tế bào gốc có trong mẫu được phân tích
bằng kĩ thuật flow cytometry trên máy FACS
calibur (BD Bioscience) theo hướng dẫn của của
nhà sản xuất
Tế bào gốc trung mô phải có kết quả về các
marker như sau:
(+) với các marker CD13, CD44, CD73,
CD90, CD105
(-) với các marker CD14, CD34, CD45,
HLA-DR
Giai đoạn 4: Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào
tiết Insulin
Bước 1: Tế bào nuôi tăng sinh trong MSCCult
được tách bằng trypsin/EDTA 0,25% cấy vào đĩa
6 giếng, mỗi giếng 100.000 tế bào Nuôi tế bào
trong môi trường IPC-M1 trong 5-7 ngày ở 370 C,
với chế độ thay môi trường 3 ngày/lần
Bước 2: Thay môi trường nuôi tế bào thành
IPC-M2 nuôi trong 7 ngày
Bước 3: Thay môi trường nuôi tế bào thành
IPC-M3 Tiếp tục nuôi như bước 1, trong 3
ngày Sau đó tách tế bào bằng trypsin/EDTA
0,25% rồi nuôi lại trong cùng giếng của đĩa Tế
bào này được tiếp tục nuôi trong 4-5 ngày
Tất cả môi trường trên được cung cấp bởi
công ty GeneWorld, HCM, VN
Giai đoạn 5: Đánh giá sự nhiễm khuẩn, nhiễm
nấm và bộ NST của tế bào tiết insulin: bằng
các tiêu chí sau:
Bảng 1 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng TBG
Giai đoạn 6: Đánh giá sự biệt hóa tế bào tiết insulin:
Tiến hành chạy Realtime RT-PCR Với các Gen: Pdx-1, Ngn3, Insulin
Dùng phương pháp 2-∆∆Ct của Livak để định lượng biểu hiện của gen nghiên cứu và gen tham chiếu (GAPDH)
Dùng phương pháp nhuộm Dithizone (DTZ) để nhận biết sự tiết insulin trong các tiểu đảo tụy của tuyến tụy hay các cụm tế bào giống tiểu đảo tụy
Đánh giá khả năng tiết insulin của tế bào sau khi biệt hóa phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trường nuôi Cho tế bào vào 2 giếng A và B
có môi trường IPC-M3 với nồng độ glucose lần lượt là 5.5mmol/L và 23mmol/L Ủ tế bào trong điều kiện nuôi 24 giờ Sau đó, định lượng sự hiện diện của insulin trong dịch nuôi tế bào bằng kĩ thuật HPLC
Phân tích thống kê
Nghiên cứu được thực hiện trên 7 mẫu Số liệu nghiên cứu được xử lí bằng phần mềm Excel
2010 với độ tin cậy 95%
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Tế bào gốc trung mô được thu nhận từ mô
mỡ, tăng sinh in vitro và biểu hiện các marker đặc trưng sau vài lần cấy chuyền
Chúng tôi đã thành công với tỷ lệ 100% (7/7) trong việc tác chiết SVF từ mô mỡ Tổng số tế bào thu nhận được là 1.0126 ± 0.0933 × 106 tế bào, tỷ lệ sống đạt 78,3 ± 5,7% (n=7) Sử dụng kĩ thuật flow cytometry với các marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô, kết quả đánh giá cho thấy cho 7,12± 2,22% tế bào phân đoạn SVF là tế bào gốc trung mô Số lượng này đủ để dùng trong các nghiên cứu và nhân lên ứng dụng trong điều trị
Bảng 2: Kết quả định lượng tế bào SVF và tế bào gốc
trong mô mỡ của các lần thí nghiệm
Tế bào có nhân SVF (x 10 6 )
Tế bào/gam (x
10 6 )
Phần trăm tế bào sống (%)
Phần trăm TBG (%)
Trang 4Tế bào có nhân
SVF (x 10 6 )
Tế bào/gam (x
10 6 )
Phần trăm tế bào sống (%)
Phần trăm TBG (%)
Kết quả này là tương đương với các nghiên
cứu khác trên thế giới(1) SVF đã được chứng minh
có chứa đến 3% là tế bào gốc trong tổng số tế bào,
gấp 2.500 lần so với tần số tế bào gốc trong tuỷ
xương ngươzi(4) Như vậy SVF là nguồn tế bào gốc
phong phú, an toàn và hiệu quả hiện nay
Kết quả nuôi cấy ADSC
Sau 7 ngày nuôi, các tế bào tăng sinh mạnh
và bắt đầu hợp dòng Khi tế bào chiếm 70-80%
diện tích bề mặt nuôi, tiến hành cấy chuyền theo
tỷ lệ 1:3 Tốc độ phát triển của tế bào tương đối
như nhau giữa các lần cấy chuyền và cao hơn
trong nuôi cấy sơ cấp
Hình 1 Tế bào ứng viên gốc trung mô có hình thoi,
trải dài trên bề mặt nuôi cấy (20x)
Các tế bào gốc trung mô ứng viên biểu hiện
các marker của tế bào gốc trung mô
Biểu đồ 1: Kết quả biểu hiện marker của tế bào sau
khi nuôi cấy
Theo kết quả trên chúng tôi đã bước đầu chứng minh khả năng tách triết được ADSC trong mô mỡ của tình nguyện viên
Biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô từ
mô mỡ thành tế bào tiết insulin
Sau 12 ngày biệt hóa, có sự co cụm và rút ngắn của tế bào dồn chúng lại trong một vị trí hình thành một nhóm tế bào ngày càng nén chặt
Từ đó một số cụm tế bào giống đảo tụy bắt đầu xuất hiện vào khoảng ngày thứ 14
Khi nhuộm với dithizone, 100% cụm tế bào giống đảo tụy này bắt màu đỏ với thuốc nhuộm
Hình 2 Các tế bào sau khi co cụm lại thành tụy đảo
bắt màu với thuốc nhuộm Dithizone (20x)
Các tế bào được kiểm tra các gen chuyên biệt
ở tế bào β tụy đảo so với tế bào chưa biệt hóa (đối chứng), được bình thường hóa bằng gen đối chứng nội GAPDH theo công thức của Lavik
Bảng 2 Mức độ biểu hiện Gen chuyên biệt của tế bào
β tụy đảo
Kết quả đánh giá sự tiết insulin bằng kỹ thuật HPLC ở 7 lô thí nghiệm đạt 100% dương tính với insulin Điều này chứng tỏ các tế bào sau khi biệt hóa thành công không những có khả năng biểu hiện các gen liên quan đến kiểu hình tế bào β tụy đảo mà còn có khả năng dịch mã thành công insulin và tiết ra ngoài Insulin là sản phẩm cuối cùng trong suốt quá trình chuyển biệt hóa của tế bào gốc trung mô thành tế bào tiết insulin Sự
Trang 5xuất hiện insulin được phát hiện bằng HPLC
chứng tỏ chúng tôi đã biệt hóa thành công tế bào
gốc trung mô từ mô mỡ thành tế bào tiết insulin
Để đánh giá tính toàn vẹn về tính năng của
một tế bào β tụy đảo, chúng tôi tiến hành đánh
giá khả năng tiết insulin phụ thuộc vào nồng độ
đường kích thích Kết quả là 6/6 (tỷ lệ 100%) mẫu
tế bào biệt hóa có khả năng đáp ứng tốt với lượng
đường Cụ thể, lượng đường cao hơn thì lượng
insulin tiết ra nhiều hơn
Bảng 3 Mức dộ đáp ứng tiết Insuline theo nồng độ
đường
Nồng độ 5 mmol/l Nồng độ 23 mmol/l
Trong kết quả nghiên cứu của Kim và cộng
sự(5), họ cho răzng chỉ có tế bào gốc ở màng xương
mới có khả năng biệt hóa thành tế bào tiết insulin
mà đáp ứng được với lượng đươzng Tuy nhiên
kết quả của nhiều nhóm nghiên cứu khác lại cho
thấy tế bào tiết insulin biệt hóa tưz mô mỡ có khả
năng đáp ứng với lượng đươzng, kết quả này
tương đương với nghiên cứu của Chardar(2),
Mohamad Buang(6) Kết quả nghiên cứu của
chúng tôi cho thấy sự sản xuất Insulin của tế bào
gốc trung mô tưz mô mỡ sau khi biệt hóa thành tế
bào tiết insulin có khả năng được điều hòa bởi sự
thay đổi của nồng độ glucose
Tế bào sau khi biệt hóa có chất lượng tốt
Các tế bào sao khi biệt hóa không phát hiện
nhiễm nấm hay vi khuẩn khi quan sát dưới kính
hiển vi Kết quả nhuộm G-banding cho thấy bộ
NST của tế bào ổn định về số lượng và cấu trúc
sau nhiều lần cấy chuyền và biệt hóa thành tế bào
tiết insulin 100% (3/3) mẫu tế bào được lấy ngẫu
nhiên đều không quan sát thấy đột biến NST
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu xây dựng qui trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ
mô mỡ, đồng thời chứng minh khả năng biệt hóa của ADSC thành thế bào tiết insuline Các tế bào sau khi biệt hóa đều có khả năng tiết insuline và đều có khả năng thay đổi nồng độ insuline tiết ra theo nồng độ đường
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Arakawa M, Ebato C, Mita T, Hirose T, Kawamori R, Fujitani
Y, Watada H (2009), "Effects of exendin-4 on glucose tolerance, insulin secretion, and beta-cell proliferation depend
on treatment dose, treatment duration and meal contents",
Biochem Biophys Res Commun, 390(3), p 809-814
2 Chandra V, Muthyala S, Jaiswal AK, Bellare JR, Nair PD, Bhonde RR (2011), "Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate
experimental diabetes in mice", PLoS One, 6(6) p 20615
3 Figlinzzi M et al (2009), "Bone marrow derived mesenchymal stem cells improve islet graft function in diabetic rats",
Transplant Proceeding, 41(5) p 1797-1800
4 Gronthos S, F.D., Leddy HA, Robey PG, Storms RW, Gimble
JM (2001), "Surface protein characterization of human adipose
tissue-derived stromal cells", J Cell Physiol, 189, p.54-63
5 Kim SJ, Ko ES, Lim SM, Lee CW, Kim DI (2012), "Glucose-stimulated insulin secretion of various mesenchymal stem
cells after insulin-producing cell differentiation", J Biosci Bioeng, 113(6) p 771-777
6 Mohamad Buang ML, S.H., Chung LH, Saim AB, Idrus RB (2012), "In vitro generation of functional insulin-producing cells from lipoaspirated human adipose tissue-derived stem
cells", Arch Med Res, 43(1) p 83-88
7 Phan Kim Ngọc, Dương Thanh Thủy, Phạm Lê Bửu Trúc, Phạm V n Phúc (2010), "So sánh hiệu quả điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách cấy ghép tế bào gốc trung mô tủy
xương và tế bào tiết insulin trên mô hình chuột", Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học: khu vực miền trung và tây nguyên
8 Phạm Lê Bửu Trúc, Dương Thanh Thủy, Phạm V n Phúc, Phan Kim Ngọc (2009), "Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh đái tháo đường bằng cách ghép tế bào tiết insulin trên mô hình
chuột", Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía Nam,
p 23-24
9 Trần Thị Như Mai, Vương Gia Tuệ, Khổng Hiệp, Phạm V n Phúc, Phan Kim Ngọc (2008), "Thu nhận và biệt hóa tế bào
gốc trung mô từ mô mỡ người", Hội nghị khoa học lần thứ 6:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/03/2014 Ngày bài báo được đăng: 20/03/2014