Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài trình bày về: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền. Và mục tiêu nghiên cứu nhằm ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2.
Trang 1CHẨN ĐOÁN DI TRUYỀN Ở CÁC BỆNH NHÂN MẮC BỆNH TĂNG SẢN TUYẾN THƯỢNG THẬN BẨM SINH
Ngô Thị Hồng Phước*, Đỗ Thị Thanh Thủy* , **, Nguyễn Ngọc Minh***, Nguyễn Thị Băng Sương* , **
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột
biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền.
Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2. Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên hai bệnh nhân CAH được chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm
sàng, tách chiết DNA của bệnh nhân và thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA (Multiplex ligation‐ dependent probe amplification) để phân tích đột biến gen CYP21A2.
Kết quả: Phát hiện được một bệnh nhân bị đột biến điểm và một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp
tử từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2.
Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình và ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật
MLPA trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh CAH.
Từ khóa: Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, gen CYP21A2, MLPA.
ABSTRACT
IDENTIFICATION OF GENE MUTATIONS AT CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA PATIENTS
Ngo Thi Hong Phuoc, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Ngoc Minh, Nguyen Thi Bang Suong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 502 ‐ 507
Introduction: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH)is a genetic disease caused by mutations in the
CYP21A2gene which is located on chromosome 6. Detection of CYP21A2 gene mutations is important for diagnostic and genetic counseling. Sequencing and MLPA technique are used by many authors for diagnostic of CYP21A2 gene mutations.
Objectives: Applification of sequencing and MLPA technique to identify mutations in CYP21A2 gene. Patients and Methods: Two patients were diagnosed CAH by clinical symptoms,DNA of these patients
was extracted by Qiagen kit. After that we performedsequencing technique to identify point mutations and MLPA technique to identify deletion mutations in CYP21A2 gene.
Results: Onepatient had point mutation and the other patient had homozygote deletion in CYP21A2 gene. Conclusions: The research was initially completed the application process and successfully in the diagnosis
of CYP21A2 mutations causing CAH disease.
Keywords:Congenital Adrenal Hyperplasia, CYP21A2gene, MLPA .
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tăng sản tuyến thượng thận (CAH) là
bệnh di truyền trong đó thể thiếu enzym 21‐
hydroxylase là thể bệnh hay gặp nhất, chiếm tỷ
lệ 90 ‐ 95%. Đứng thứ hai là thể 11β‐hydroxylase
5 ‐ 9%, ngoài ra thiếu hụt các enzyme khác gây các thể bệnh: 3β-HSD, 17α‐hydroxylase và 20, 22‐desmolase ít gặp hơn. Sự khiếm khuyết của enzyme 21‐hydroxylase dẫn đến mức độ khác
* Trung tâm Y Sinh học phân tử, **Bộ môn Hóa sinh, ***Bộ môn Xét nghiệm, Đại học Y Dược TPHCM
Trang 2nhau của việc suy giảm tổng hợp cortisol và
giảm/hoặc không giảm aldosterone đi kèm với
tăng sinh tổng hợp nội tiết tố androgen. Những
bất thường này dẫn đến nam hóa các thai nhi
nữ, phát triển thể trạng nhanh hơn bình thường
và giả dậy thì sớm ở trẻ nam. Trong đó thể mất
muối là hình thức nghiêm trọng nhất của bệnh,
do thiếu sinh tổng hợp aldosterone dẫn đến
không có khả năng để giữ natri. Nếu không
được điều trị kịp thời sẽ dễ nhanh chóng tử
vong trong vài tuần(4).
Tỷ lệ mắc bệnh trên thế giới là 1/14.000‐
15.000 trẻ em sơ sinh, trong đó thể thiếu
enzym 21 – hydroxylase chiếm tỷ lệ 1/10.000 trẻ
sinh ra(2,3). Ở Việt Nam, hiện nay vẫn chưa có
đề tài nghiên cứu về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ
người lành mang gen bệnh tăng sản tuyến
thượng thận bẩm sinh Theo thống kê tại khoa
Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi
Trung ương, số lượng bệnh nhân hàng năm tăng
lên, trung bình mỗi năm khoảng 40 – 70 bệnh
nhân nhập viện và được điều trị tại khoa. Tính
đến tháng 6 năm 2010 tổng số bệnh nhân lên
đến 512 trẻ Hiện nay, Việt Nam được coi là một
trong những nước có tỷ lệ bệnh nhân mắc CAH
cao trên thế giới(9 ).
Nguyên nhân gây bệnh được khẳng định
chủ yếu do đột biến gen CYP21A2. Gen
CYP21A2 mã hóa enzyme 21‐hydroxylase, nằm
trên cánh ngắn NST số 6 (6p21.3) có chiều dài
khoảng 30 kb. Phần lớn các đột biến (95%) do sự
bắt chéo không đồng đều giữa các cặp NST dẫn
đến trình tự ở vùng giả gen CYP21A1P sẽ
chuyển sang gen CYP21A2 trong quá trình phân
bào giảm nhiễm, 5% còn lại là do gen CYP21A2
tự đột biến(8, 10)
Việc phân tích đột biến gen CYP21A2 có vai
trò quan trọng xác định bệnh cũng như phân
loại bệnh, giúp định hướng chỉ định điều trị
bằng liệu pháp hormon thay thế suốt đời và là
cơ sở của tư vấn di truyền, chẩn đoán trước sinh
bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề
tài nhằm mục tiêu:“Ứng dụng kỹ thuật giải trình
tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2”.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu: 2 bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh.
Nhóm đối chứng: 2 người bình thường không mắc bệnh lý gì đặc biệt, mẫu đối chứng này được dùng để chuẩn kỹ thuật và chạy cùng với mẫu bệnh nhân.
Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết DNA tổng số
Bước 1: Thu 2 ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA của bệnh nhân.
Bước 2: Sử dụng 200 μl máu tĩnh mạch chống đông EDTA để tách chiết DNA tổng số,
sử dụng bộ tách chiết QIAamp DNA Blood mini kit (Qiagen).
Bước 3: Hòa mẫu DNA trong 200 μl TE 1X, bảo quản ở ‐200C.
Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng máy đo quang phổ
Sử dụng 1‐5 μl DNA sau khi tách chiết, kiểm tra bằng hệ thống máy định lượng quang phổ
DNA Nanodrop 2000c. Độ tinh sạch nằm trong
khoảng 1,8 đến 2,0 mới được sử dụng để tiến hành phản ứng tiếp theo.
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại exon 1 đến exon 3 và exon 3 đến exon 9 của gen
CYP21A2, phản ứng PCR được thực hiện trên
máy khuyếch đại gen Eppendorft.
Kỹ thuật điện di thường trên gel agarose
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose nồng độ 1%, đệm TBE 1X, kết quả được đọc trên máy geldoc. Mẫu bệnh nhân luôn được tiến hành cùng với mẫu người bình thường.
Trang 3Kỹ thuật MLPA (multiplex ligation –
dependent probe amplification)
Sử dụng kit MLPA P050 (MRC ‐ Holland)
bao gồm 3 giai đoạn chính:
‐ Biến tính và lai DNA: 100 ng DNA (hòa
trong 5μl) được biến tính và lai với 1,5μl hỗn
hợp probe cùng 1,5μl buffer MLPA (chu trình
nhiệt: 98oC – 5 phút, 25oC – tạm dừng, 95oC– 1
phút, 60oC ‐ 16 giờ).
‐ Phản ứng nối: thực hiện bằng enzyme
ligase (chu trình nhiệt: 54oC – 15 phút và 98oC – 5
phút).
‐ Phản ứng PCR: tiến hành thực hiện các quy
trình nhiệt để khuếch đại các probe đã nối,
thành phần phản ứng PCR gồm: primer, Taq
polymerase, nước (chu trình nhiệt: 95oC – 1
phút, 30 chu kì với 95oC – 30 giây, 60oC – 30 giây,
72oC – 1 phút và kéo dài ở 72oC – 20 phút, 4oC
dừng).
Điện di và phân tích kết quả: điện di mao
quản trên máy Beckman Coulter. Sử dụng phần
mềm GeneMarker v1.92 để phân tích kết quả.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bệnh nhân CAH 01
Kết quả PCR
Hình 1: Khuếch đại exon 1 đến exon 3 và exon 3 đến
exon 9 của gen CYP21A2.
BN: Mẫu bệnh nhân, BT: Mẫu người bình thường, (‐):
Mẫu nước
Nhận xét: Phản ứng PCR đã khuếch đại
được hai đoạn: đoạn 1 từ exon 1 đến exon 3 (có kích thước 1157 bp) và đoạn 2 từ exon 3 đến exon 9 (có kích thước 2051 bp), sản phẩm PCR của bệnh nhân và người bình thường có kích thước như nhau, bờ đều sắc nét. Từ đó chúng tôi tiến hành giải trình tự sản phẩm khuếch đại của bệnh nhân.
Kết quả giải trình tự gen
Hình 2. Kết quả giải trình tự gen của bệnh nhân
CAH 01.
Nhận xét: Tại vị trí c.1276 của bệnh nhân
xuất hiện một đỉnh của nucleotid T, trong khi đó trình tự của genBank là C. Sự sai khác này làm thay đổi acid amin arginine tại vị trí codon 426 thành acid amin cysteine. Đột biến này đã được Grischuk công bố vào năm 2006 trên tạp chí J.Clin Endocrinol Metab(5). Như vậy chúng ta khẳng định bệnh nhân bị đột biến điểm đồng hợp tử tại c.1276C>T.
Hình 3. Kết quả giải trình tự exon 1 của gen
CYP21A2.
Nhận xét: Tại codon 10 của bệnh nhân có
chèn thêm 3 nucleotid TGC, trong khi đó trình
tự genBank NG_007941 không có codon này.
BN
Exon 1- 3
Exon 3 - 9
Trang 4Kết quả PCR
Hình 4. Kết quả PCR khuếch đại gen CYP21A2 của
bệnh nhân CAH 02
BN: Mẫu bệnh nhân, BT: Mẫu người bình thường
Nhận xét: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR cho
thấy ở mẫu người bình thường xuất hiện hai vạch
điện di tương ứng với 2 đoạn được khuếch đại có
kích thướng 1157 bp và 2051 bp. Trong khi đó mẫu
bệnh nhân không lên vạch, điều này chứng tỏ
bệnh nhân bị đột biến tại vùng gắn mồi, do vậy
không khuếch đại được sản phẩm PCR.
Kết quả MLPA
Mẫu bệnh nhân được thực hiện phản ứng
MLPA cùng mẫu đối chứng (người bình
thường) để so sánh.
Hình 5. Kết quả MLPA của mẫu bệnh nhân CAH 02
Màu nhạt (bên trái): mẫu đối chứng. Màu đậm (bên phải):
mẫu bệnh nhân CAH 02.
Nhận xét: Tại các đỉnh tương tứng với exon
1 và exon 3 của gen CYP21A2, mẫu người bình
thường xuất hiện đỉnh nhưng mẫu bệnh nhân không xuất hiện đỉnh, chứng tỏ rằng bệnh nhân
bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến
exon 3 của gen CYP21A2. Xét các đỉnh của exon
4, 6, 8, chiều cao đỉnh của bệnh nhân chỉ bằng ½
so với mẫu người bình thường, chứng tỏ rằng bệnh nhân bị đột biến mất đoạn dị hợp tử từ exon 4 đến exon 8.
BÀN LUẬN
Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh
là bệnh di truyền liên quan đến rối loạn hormone của tuyến thượng thận, nguyên nhân
chính gây bệnh là do đột biến gen CYP21A2.
Tuy nhiên trong cơ thể chúng ta tồn tại gen
CYP21A1P là gen giả (không có chức năng), có
trình tự nucleotide tương đồng 98% so với gen
CYP21A2. Như vậy vấn đề chỉ khuếch đại gen CYP21A2 để phân tích đột biến ở bệnh nhân
CAH là vấn đề rất khó khăn. Dựa vào sự khác biệt 8 bp tại exon 3 của hai gen này chúng tôi đã chọn lựa hai cặp mồi được thiết kế để chỉ
khuếch đại chọn lọc gen CYP21A2 mà không khuếch đại được gen CYP21A1P(7).
Phản ứng PCR ở bệnh nhân CAH 01 khuếch
đại được toàn bộ gen CYP21A2 gồm 2 đoạn:
đoạn gen từ exon 1 đến exon 3 (có kích thước
1157 bp) và đoạn từ exon 3 đến exon 9 (kích thước 2051 bp). Sau đó, sản phẩm PCR được giải trình tự và kết quả phát hiện bệnh nhân bị đột biến điểm đồng hợp tử ở vị trí c.1276 C>T, đột biến này làm thay đổi acid amin tại codon 426 là arginin thành cysteine (đột biến p.R426C) và đã được Grischuk công bố vào năm 2006 trên tạp chí J ClinEndocrinoMetab(5). Arginine là một trong 4 acid amin có liên kết hydro với chuỗi propionate của heme (cysteine‐169, glycine‐178, tryptophan‐302 và arginine‐426), điều này không chỉ giúp định hướng heme trong protein
mà còn tham gia vào việc vận chuyển điện tử.
Sự đột biến thay đổi acid amin arginine tại vị trí codon 426 thành acid amin cysteine sẽ phá vỡ các liên kết hydro với nhân tố heme, khiến
Exon 1- 3
BN BT BN BT
Exon 3 - 9
Trang 5protein không có chức năng và gây thể mất
muối CAH(6). Ở bệnh nhân này chúng tôi còn
tìm thấy có sự khác biệt so với trình tự Genbank
NG_007941 như sau: tại codon 10 có chèn thêm
3 nucleotid TGC, kiểm tra kết quả SNP trên
website NCBI chúng tôi phát hiện đây chỉ là
SNP chứ không phải đột biến. Từ kết quả này
cho thấy chúng tôi đã bước đầu hoàn thiện được
các yếu tố thực hiện quy trình PCR để khuếch
đại gen CYP21A2 như: lựa chọn trình tự mồi,
chuẩn nồng độ các thành phần phản ứng, nhiệt
độ của chu kì luân nhiệt trong phản ứng
PCR,…cũng như quá trình giải trình tự gen để
xác định đột biến.
Ở bệnh nhân 2, mặc dù đã sử dụng các cặp
mồi đặc hiệu như đối với bệnh nhân CAH 01
nhưng kết quả PCR không khuếch đại được hai
đoạn gen của CYP21A2 như bệnh nhân CAH 01,
trong khi đó mẫu người bình thường vẫn xuất
hiện 2 vạch tương ứng với kích thước của sản
phẩm PCR. Điều này cho thấy khả năng bệnh
nhân bị đột biến tại vùng gắn mồi, vì vậy các
mồi không gắn được vào phân tử DNA của
bệnh nhân và không khuếch đại được vùng gen
cần khảo sát. Do cả hai đoạn exon 1‐3 và exon 3‐
9 đều không lên vạch của sản phẩm PCR nên
chúng tôi nghĩ bất thường có thể liên quan đến
exon gắn mồi chung là exon 3. Từ suy đoán này
chúng tôi tiếp tục sử dụng phản ứng MLPA để
phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2. Kết
quả hình 5 cho thấy ở người bình thường, tất cả
các đỉnh tương ứng với các exon của gen
CYP21A2 đều xuất hiện, trong khi đó ở mẫu
bệnh nhân, đỉnh của exon 1 và exon 3 không
xuất hiện, còn đỉnh của các exon 4, 6, 8 có chiều
cao chỉ bằng ½ so với người bình thường. Kết
quả chứng tỏ bệnh nhân bị mất đoạn đồng hợp
tử từ exon 1 đến exon 3, còn từ exon 4 đến exon
8 thì bị mất đoạn dị hợp tử. Điều này suy đoán
rằngmột trong hai người bố (hoặc mẹ) của bệnh
nhân sẽ mang kiểu gen CYP21A2 dị hợp tử,
trong đó 1 allele bình thường và allele bị đột
biến mất đoạn từ exon 1‐3. Người mẹ (hoặc bố)
còn lại cũng có kiểu gen CYP21A2 dị hợp tử,
mang 1 allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐8.
Muốn khẳng định suy đoán cần tiến hành phân tích kiểu gen của bố và mẹ bệnh nhân. Việc phân tích di truyền bệnh CAH vẫn còn hạn chế tại Việt Nam nhưng đối với các nước trên thế giới vấn đề này được quan tâm từ lâu. Năm
2009, Concolino đã ứng dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen
CYP21A2(3). Năm 2011, tác giả Rabbani cũng đã dùng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất
đoạn đồng hợp tử gen CYP21A2 gây thể nam
hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp MLPA có thể sử dụng trong chẩn đoán mất đoạngen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến
thượng thận bẩm sinh và chúng tôi đã thành công trong việc ứng dụng phương pháp này.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã bước đầu ứng dụng thành công kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến điểm và kỹ thuật MLPA để phát hiện đột
biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản
tuyến thượng thận bẩm sinh. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp tục mang thai nhằm tránh sinh ra những đứa trẻ
bị bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bahareh R, Akbari MT, Mahdieh N, Zaridust E, Ashtiani MT, Lee HH, Auchus R, Rabbani A (2011). Homozygous complete
deletion of CYP21A2causes a simple virilizing phenotype in an Azeri child. Asian Biomedicine. 889‐892.
2 Brook C, Hughes I, and Kelnar C (2000). Antenatal Treatment of
a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia.
Archive Disease Children Fetal Neonatal. 82(3):F176‐81.
3 Concolino P, Mello E, Toscano V, Ameglio F, Zuppi
C, Capoluongo E (2009). Multiplex ligation – dependent probe
amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene
deletions/ duplications in Congenital Adrenal Hyperplasia:
First technical report.Clin Chim Acta. 402(1‐2):164‐70.
4 Day DJ, Speiser PW, Schulze E, Bettendorf M, Fitness J, Barany
F, White PC (1996). Identification of Non‐Amplifying CYP21
Genes When Using PCR‐Based Diagnosis of 21‐Hydroxylase Deficiency in Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Affected
Pedigrees. Hum Mol Genet. 5(12):2039‐48.
5 Grischuk Y, Rubtsov P, Riepe FG, Grötzinger J, Beljelarskaia
S, Prassolov V, Kalintchenko N, Semitcheva T, Peterkova
V, Tiulpakov A, Sippell WG, Krone N (2006). Four novel
missense mutations in the CYP21A2 gene detected in Russian
patients suffering from the classical form of congenital adrenal
Trang 6hyperplasia: identification, functional characterization, and
structural analysis. J.Clin Endocrinol Metab;91(12):4976‐80.
6 Haider S, Islam B, DʹAtri V, Sgobba M, Poojari C, Sun L, Yuen
T, Zaidi M, New MI (2013).Structure phenotype correlations of
hyperplasia.Proc Natl Acad Sci USA; 110(7):2605‐10.
7 Loke KY, Lee YS, Lee WW, Poh LK (2001). Molecular Analysis
of CYP‐21 Mutations for Congenital Adrenal Hyperplasia in
Singapore.Horm Res; 55(4):179‐84.
8 Speiser PW, Dupont J, Zhu D, Serrat J, Buegeleisen M, Tusie‐
Luna MT, Lesser M, New MI, White PC (1992). Disease
expression and molecular genotype in congenital adrenal
hyperplasia due to 21‐hydroxylase deficiency. J Clin. Invest;
90(2): 584‐595.
9 Trần Vân Khánh, Lê Thị Phương, Trần Huy Thịnh và Tạ
Thành Văn (2012). Phát hiện đột biến gen CYP21A2 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh.Tạp chí nghiên cứu Y
học, 78(1):100‐103.
10 Vrzalova’ Z, et al (2011).Chimeric CYP21A1P/ CYP21A2 genes
identified in Czech patients with congenital adrenal
hyperplasia. Eur J Med Genet; 54(2):112‐7.
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26/11/2013