Thực hiện kỹ thuật ELISA trên 139 mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae gồm 32 mẫu huyết thanh của những bệnh nhân mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 82 mẫu huyết thanh của những người không mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 25 mẫu huyết thanh của những người nhiễm ký sinh trùng khác. Kỹ thuật ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 96,3%. So sánh kết quả chẩn đoán Cysticercus cellulosae giữa bộ kit của Bộ môn Ký sinh trùng dùng kháng nguyên dịch nang với bộ kit của Biopharma có sự phù hợp cao (Kappa= 0,95).
Trang 1Phan Anh Tuấn*, Trần Thị Kim Dung*, Trần Thị Thanh Nga**
TÓM TẮT
Thực hiện kỹ thuật ELISA trên 139 mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae gồm 32 mẫu huyết thanh của những bệnh nhân mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 82 mẫu huyết thanh của những người không mắc bệnh Cysticercus cellulosae, 25 mẫu huyết thanh của những người nhiễm ký sinh trùng khác Kỹ thuật ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 96,3% So sánh kết quả chẩn đoán Cysticercus cellulosae giữa bộ kit của Bộ môn Ký sinh trùng dùng kháng nguyên dịch nang với bộ kit của Biopharma có sự phù hợp cao (Kappa= 0,95)
SUMMARY
COMPARATIVE EVALUATION OF DEPARMENT OF PARASITOLOGY ’ S KIT AND BIOPHARMA ‘ S FOR THE DIAGNOSIS OF HUMAN CYSTICERCOSIS
Phan Anh Tuan, Tran Thi Kim Dung, Trần Thị Thanh Nga
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 9 * Supplement of No 1 * 2005: 100 – 105
The ELISA with antigen produced by Department of Parasitology- University of Medicine and Pharmacy in Ho Chi Minh City was perform on 139 serum samples; 32 from patients having cysticercosis,
82 from persons not having Cysticercus cellulosae, 25 from patients who infected other parasites Considering all 139 specimens, the ELISA had sensitivity of 100% The specificity was 96,3% Compare betweem the result of ELISA and the kit of Biopharma have high coresspond (Kappa=0,95)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Cysticercus cellulosae là bệnh do nuốt
trứng thải ra bởi sán trưởng thành Cysticercus
cellulosae có thể gặp ở cơ, ở dưới da ở mắt, ở hệ thần
kinh trung ương Bệnh Cysticercus cellulosae ở dưới
da, cơ được chẩn đoán trực tiếp bằng phương pháp
sinh thiết(1) Bệnh Cysticercus cellulosae ở nội tạng
chẩn đoán khó vì không thể sinh thiết được Người ta
có thể chẩn đoán bệnh bằng hình ảnh học như CT
scanner, MRI nhưng chẩn đoán bằng hình ảnh học
đắt tiền, có độ nhạy thấp, đôi khi khó chẩn đoán phân
biệt với tổn thương do các nguyên nhân khác Xu
hướng ngày nay là dùng phương pháp chẩn đoán
huyết thanh
Tại Bộ môn Ký Sinh trùng, chúng tôi đã điều chế
kháng nguyên từ Cysticercus cellulosae để sử dụng
trong kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh và so sánh kết
quả chẩn đoán với bộ kit của Biopharma
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm labo
Nguyên vật liệu và dụng cụ Kháng nguyên
Được điều chế từ C cellulosae ở heo bị mắc tự nhiên
Huyết thanh
Có 676 mẫu HT gồm:
+ HT nhóm bệnh C cellulosae (HT chứng
dương): Có 6 mẫu HT của 6 bệnh nhân đã được xác
định bệnh C cellulosae
+ HT nhóm chứng (HT chứng âm)
HT nhóm chứng gồm 43 mẫu của những người
* Bộ môn Ký sinh trùng Đại học Y Dược TP HCM
Trang 2Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005
khỏe mạnh
+ HT nhóm bệnh ký sinh trùng khác: gồm 113
mẫu
+ HT nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng:
gồm 514
Tất cả các mẫu huyết thanh này được cho thêm
Azid de Natri 0,5% và lưu giữ ở nhiệt độ –20oC
Tiến hành nghiên cứu
- Điều chế KN: gồm 2 loại làø KN dịch nang và KN
mô nang
- Thực hiện kỹ thuật ELISA, đọc kết quả trị số OD
bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm
- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán
dương, giá trị tiên đoán âm của kỹ thuật ELISA
- So sánh kết quả xét nghiệm phát hiện kháng
thể kháng C cellulosae của kỹ thuật ELISA và bộ kit
của Biopharma
KẾT QUẢ
Xác định các thành phần trong kỹ
thuật ELISA
Xác định độ pha loãng cộng hợp
Sau thời gian thử nghiệm, chúng tôi chọn 3 mức
độ pha loãng cộng hợp là 1/10000, 1/20000 và
1/40000 Với từng nồng độ KN và hiệu giá KT, chúng
tôi có đường biểu diễn tỉ số OD+/OD- (OD+: trị số OD
nhóm bệnh, OD-: trị số OD nhóm chứng) theo độ pha
loãng cộng hợp như sau:
0 1 2 3 4 5
1/ 10 0 0 0 1/ 2 0 0 0 0 1/ 4 0 0 0 0
1/100 1/400 1/1600 1/6400 Nồng độ KN 26,25mcg/ml
1/100 1/400 1/1600 1/6400
0 1 2 3 4 5
1/ 10 0 0 0 1/ 2 0 0 0 0 1/ 4 0 0 0 0
Nồng độ KN 10,5mcg/ml
0 1 2 3 4
5
Nồng độ KN 5,25mcg/ml 1/100 1/400 1/1600 1/6400
Biểu đồ 1: Tỉ số OD + /OD - theo hiệu giá kháng thể ở các độ pha loãng cộng hợp
Biểu đồ 1: Tỉ số OD
Cho thấy ở độ pha loãng cộng hợp 1/40000 tỉ số này thấp nhất, ở 1/20000 và 1/10000 tỉ số này tương đương (P>0,05)
Cho thấy ở độ pha loãng cộng hợp 1/40000 tỉ số này thấp nhất, ở 1/20000 và 1/10000 tỉ số này tương đương (P>0,05)
Xác định loại KN
Chúng tôi điều chế KN từ C cellulosae thành 2
loại là KN dịch nang và KN mô nang
Chúng tôi điều chế KN từ C cellulosae thành 2
loại là KN dịch nang và KN mô nang
Thực hiện kỹ thuật ELISA với từng loại KN với các trị số OD đo được, chúng tôi có đường biểu diễn tỉ số OD+/OD- khi sử dụng KN dịch nang và KN mô
Thực hiện kỹ thuật ELISA với từng loại KN với các trị số OD đo được, chúng tôi có đường biểu diễn tỉ số OD
+ /OD - theo hiệu giá kháng thể ở các độ pha loãng cộng hợp
0
1
2
3
4
5
1 / 1 0 0 0 0
1 / 2 0 0 0 0
1 / 4 0 0 0 0
1/100 1/400 1/1600 1/6400
Nồng độ KN 52,5mcg/ml
+/OD- khi sử dụng KN dịch nang và KN mô
Trang 3
Biểu đồ 2: Tỉ số OD + /OD - theo hiệu giá KT khi sử
dụng KN dịch nang và KN mô nang
Xác định nồng độ KN sử dụng và hiệu giá KT
Biểu đồ 3: Tỉ số OD + /OD - theo nồng độ KN và hiệu
giá kháng thể
Xác định ngưỡng OD dương tính
Thực hiện thử nghiệm ELISA với nồng độ KN 5,83 mcg/ml và hiệu giá KT 1/800, độ pha loãng cộng hợp 1/20000 trên 43 mẫu HT nhóm chứng, trị số OD như sau:
- Trị số trung bình (X): 0,164
- Độ lệch chuẩn (SD): 0,009
Trị số OD dương tính được tính:
X + 3SD = 0,164 + (3 x 0,009) = 0,191 Vậy một mẫu HT pha loãng ở hiệu giá1/800 có trị số OD lớn hơn 0,191 được coi là dương tính
Bảng 1: So sánh trị số OD của kỹ thuật ELISA khi
dùng KN dịch nang và KN mô nang với HT bệnh ký sinh trùng khác
KTtừ 1/50 - 1/6400
Dịch nang 0,264 - 0,158
Toxocara spp
Mô nang 0,317 - 0,181 Dịch nang 0,248 - 0,150
Entamoeba histolytica
Mô nang 0,301 - 0,174 Dịch nang 0,256 - 0,167
Strongyloides stercoralis Mô nang 0,305 - 0,163
1/100 1/200 1/400 1/800 1/16001/32001/6400
0 5 1 5 2 2.5 3 3.5 4 5
0.
1.
4.
26,25mcg/ml
1/100 1/400 1/1600 1/6400
0
1
2
3
4
Dịch nang Mô nang
Nồng độ 105 mcg/ml
13,12 mcg/ml 8,75 mcg/ml 6,56 mcg/ml 5,83 mcg/ml 4,37 mcg/ml
1/100 1/400 1/1600 1/6400
Nồng độ 52,5 mcg/ml
0
1
2
3
4
5
Dịch nang Mô nang
3,5 mcg/ml
0
1
2
3
4
5
1/100 1/400 1/1600 1/6400
Nồng độ 10,5 mcg/ml
Dịch nang Mô nang
1/100 1/400 1/1600 1/6400
0
2
4
6
Dịch nang Mô nang
Nồng độ 5,25 mcg/ml
Trang 4Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005
KTtừ 1/50 - 1/6400
Dịch nang 0,228 - 0,161
Paragonimus spp
Mô nang 0,312 - 0,194 Dịch nang 0,216 - 0,167
Fasciola spp
Mô nang 0,318 - 0,212 Bảng 1 cho thấy KN dịch nang đặc hiệu hơn
Bảng 2: Kết quả ELISA của các mẫu HT nhóm bệnh,
nhóm chứng, nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng
và nhóm các bệnh ký sinh trùng khác
Kết qủa ELISA
Dương tính Aâm tính
Nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký
sinh trùng
514 25 489
Nhóm bệnh ký sinh trùng khác gồm113 mẫu:
Strongyloides stercoralis 15 1 14
Viêm màng não do
Cryptococcus spp
2 2
Với 6 mẫu HT nhóm bệnh, thử nghiệm Western
Blot đều dương tính với 2 băng protein có trọng lượng
phân tử 14.300 Dalton và 21.500 Dalton
- Với 43 mẫu HT nhóm chứng, chọn 10 mẫu
ngẫu nhiên: tất cả đều âm tính
- Với 514 mẫu HT nghi ngờ mắc bệnh ký sinh
trùng có:
- 25 mẫu ELISA dương tính trong đó có 2 trường
hợp giải phẫu bệnh lý thấy ấu trùng sán và 23 trường
hợp còn lại làm thử nghiệm Western Blot, tất cả đều
dương tính
- 489 mẫu ELISA âm tính, chúng tôi chọn ngẫu
nhiên 40 mẫu để thử nghiệm bằng kỹ thuật Western Blot, tất cả đều âm tính
Vậy từ 514 mẫu HT của các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng, chúng tôi xác định chẩn đoán được 65 trường hợp gồm 25 trường hợp bệnh và
40 trường hợp không bệnh
- Với 113 mẫu HT bệnh do ký sinh trùng khác có:
- 5 mẫu ELISA dương tính, thử nghiệm kỹ thuật Western - Blot, kết quả:
- 4 mẫu Western Blot âm tính: 4 trường hợp ELISA dương tính giả
- 1 mẫu Toxocara sp có kết quả Western Blot
dương tính Vậy đây là trường hợp đa nhiễm
- 108 mẫu ELISA âm tính, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 2 mẫu ở mỗi loại bệnh ký sinh trùng; tổng số
20 mẫu của 10 loại bệnh trên, thử nghiệm với kỹ thuật Western - Blot, tất cả đều âm tính
Như vậy từ 113 trường hợp mắc bệnh do ký sinh trùng khác, bằng kỹ thuật Western Blot, chúng tôi xác định chẩn đoán được 25 trường hợp gồm 1 trường hợp bệnh và 24 trường hợp không bệnh
Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của kỹ thuật ELISA
Để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của kỹ thuật ELISA, tổng hợp 139 mẫu đã xác định chẩn đoán
Bảng 3: Kết quả ELISA của 139 mẫu HT được xác
định chẩn đoán
Bệnh
ELISA
32
32 a
a
=
=
=
c
+
Độ đặc hiệu: 0,963 96,3%
107
103 d b
d
=
=
= +
Trang 5% 9 , 88 889 , 0 36
+ b
Giá trị tiên đoán âm: 1 100%
103
103 d c
d
=
=
= +
So sánh kết quả xét nghiệm phát hiện
kháng thể kháng C cellulosae của kỹ
thuật ELISA và bộ kit của Biopharma
Chúng tôi đã có kết quả ELISA của 42 mẫu HT
gồm 15 mẫu âm tính và 27 mẫu dương tính Các mẫu
này được làm thử nghiệm tại Bệnh viện Chợ Rẫy với
bộ kit chẩn đoán của Biopharma, kết quả như sau:
Bảng 4: Kết quả xét nghiệm của kỹ thuật ELISA và
bộ kít của Biopharma
Kết quả của bộ kit ELISA
Chỉ số Kappa K = (Po – Pe)/ (1- Pe)
Với Po = (a+d) / N = (15+26) / 42 = 0,976
Và
Pe=((r1s1+r2s2)/N)/N=((15x16+26x27)/42)/42=0,534
K = (0,976 – 0,534)/ (1- 0,534)= 0,95
Chỉ số Kappa: K =0,95; cho thấy kết quả xét
nghiệm của kỹ thuật ELISA với KN dịch nang và bộ
kit của Biopharma có sự phù hợp cao
BÀN LUẬN
Về độ nhạy của kỹ thuật ELISA
Dựa trên dữ kiện 139 mẫu HT thử nghiệm đã
được xác định chẩn đoán, kết quả phân tích theo
bảng 2 x 2 (bảng 3) cho biết kỹ thuật ELISA có độ
nhạy là 100% và độ đặc hiệu là 96,3%, giá trị tiên
đoán dương 88,9%, giá trị tiên đoán âm 100%
Kết quả nghiên cứu của các tác giả khác cho biết
độ nhạy của kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán bệnh C
cellulosae từ 88,6% - 100%(3,4,813,14,16) Có sự biến
thiên về độ nhạy có thể do:
nguyên điều chế từ Cysticercus cellulosae, các tác giả
khác đã điều chế kháng nguyên từ các loài khác như
Cysticercus longicollis(2,6)
- Các thành phần của nang sán: Từ nang sán
Cysticercus cellulosae có thể điều chế thành 3 loại
kháng nguyên là kháng nguyên toàn nang, dịch nang và kháng nguyên nội ngoại tiết Theo nghiên cứu của Guo H (1997) và Molinari J L (2002) thì độ nhạy của kỹ thuật ELISA khi dùng KN nội -ngoại tiết từ 51,1%
- 92% (9), (11) Theo các nghiên cứu của Costa J M (1986) và Shiguekawa K Y (2000), khi dùng KN dịch nang thì độ nhạy từ 95% - 100%(3,13), còn các tác giả Costa J M (1986), Dekumyoy P (1998), Silva A D (2000), Gekeler F (2002), Wang K H (1993) dùng
KN ø toàn nang thì độ nhạy từ 85,7% - 100%(3,4,8,14,16)
- Hơn nữa, độ nhạy của kỹ thuật ELISA còn tùy thuộc vào bệnh nhân thử nghiệm Diawan sử dụng cùng một kháng nguyên để chẩn đoán thì thấy độ nhạy của kỹ thuật ELISA là 79% từ các huyết thanh của các bệnh nhân ở Mexico và 61% ở các huyết thanh của các bệnh nhân ở Irian Jaya-Indonesia(5) Độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA trong công trình nghiên cứu này là 96,3% So với các nghiên cứu dùng
KN toàn nang thì độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA từ 75,3% - 100%(3,4,8,13) Ko R C (1998), Molinari J L (2002) dùng chất nội - ngoại tiết làm KN thì kỹ thuật ELISA có độ đặc hiệu từ 97% - 100%(10,11) và Costa (1986), Bueno E C (2000) dùng dịch nang làm KN, độ đặc hiệu từ 90% - 100%(2,3)
Độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA trong các nghiên cứu khác nhau Điều đó có thể là do chất lượng KN và tình trạng mắc bệnh ký sinh trùng khác tại nơi đang nghiên cứu có khác nhau
Về phản ứng chéo
Khi dùng kỹ thuật ELISA thử nghiệm trên các huyết thanh của các bệnh nhân bệnh ký sinh trùng khác cho thấy phản ứng có chéo với các bệnh do
Entamoeba histolytics, Toxocara canis, Strongyloides stercoralis với tỉ lệ thấp (bảng 2)
Trang 6Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005
Ngoài phản ứng chéo với Entamoeba histolytics, T
canis theo kết quả nghiên cứu của các tác giả khác,
phản ứng còn chéo với Echinococcus spp, Schistosoma
spp., Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis(4,8,13)
So sánh kết quả chẩn đoán Cysticercus
cellulosae của kỹ thuật ELISA và bộ
kit của Biopharma
Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng
C cellulosae của kỹ thuật ELISA với kháng nguyên
dịch nang so sánh với bộ kit của Biopharma có sự phù
hợp cao (Kappa= 0,950) (bảng 2.4)
KẾT LUẬN
Kỹ thuật ELISA với kháng nguyên dịch nang là
kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, đáng tin cậy,
thực hiện nhanh và tương đối đơn giản, không cần
những trang thiết bị đắt tiền, có thể thực hiện ở
những phòng thí nghiệm nhỏ và đây là thử nghiệm
rẻ tiền có ích góp phần trong chẩn đoán xác định
bệnh Kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể của
kỹ thuật ELISA với kháng nguyên dịch nang so sánh
với bộ kit của Biopharma có sự phù hợp cao
Tuy nhiên vẫn còn nhiều câu hỏi đặt ra mà kỹ
thuật ELISA chưa trả lời được Trường hợp nào với kết
quả ELISA xác định được rằng bệnh nhân nhiễm
nhiều nang hay ít nang, với kết quả ELISA dương
tính có thể xác định đó là bệnh mới mắc hay bệnh
mãn tính? ELISA dương tính thì có thể nào xác định
bệnh ấu trùng sán dải heo trong giai đoạn tiến triển
hay thoái hóa? Nếu phản ứng dương từ 2 loại kháng
nguyên ký sinh trùng thì đó là đa nhiễm hay chỉ là
phản ứng chéo? Đây là những vấn đề mà chúng tôi sẽ
nghiên cứu trong thời gian tới
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Baily GG (1988), “Serological diagnosis of
neurocysticercosis: evaluation of ELISA tests using
cyst fluid and other components of Taenia solium
cysticerci as antigen”, Trans R Soc Trop Med Hyg, 82
(2), pp 295-299
2 Bueno E.C et al (2000), “Specific Taenia crassiceps
and Taenia solium antigenic peptides for
neurocysticercosis immunodiagnosis using serum
samples”, J Clin Microbiol, 38(1), pp 146-151
3 Costa J M (1986), “Immunoenzymatic test (ELISA) in
the diagnosis of neurocysticercosis: study of various
antigenic extracts in the detection of IgG antibodies
in serum and cerebrospinal fluid samples”, Arq Neuropsiquiatr, 44(1), pp 15-31
4 Dekumyoy P et al (1998) “Use of delipidized antigens
of Taenia solium metacestodes in IgG-ELISA for detection of neurocysticercosis”, Southeast Asian J Trop Med Public Health, 29(3), pp 572-578
5 Diwan A., Coker Vann M., Brown P et al (1982),
“Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the
dection of antibody to cysticerci of Taenia solium”, Am
J Trop Med Hyg, 31, pp 364-369
6 Garcia E., Ordonez G., Sotelo J (1995), “Antigens
from Taenia crassiceps used in complement fixation,
enzyme – linked immunosorbent assay, and Western Blot (immunoblot) for diagnosis of neurocysticercosis,
J Clin Microbiol, 33(12), pp 3324-3325
7 Garcia H H et al (1998), “A specific antigen detection ELISA for the diagnosis of human
neurocysticercosis” Trans Royal Soc Trop Med Hyg,
92, pp 411-414
8 Gekeler F et al (2002), “Sensitivity and Specificity of ELISA and Immunoblot for Diagnosing
Neurocysticercosis”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis,
21, pp 227-229
9 Guo H., Zhao Z F., Shi D Z (1997), “A study on the
culture medium antigens of Cysticercus cellulosae for
detecting antibodies of cysticercosis by means of
ELISA”, Southeast Asian J Trop Med Public Health,
28 Suppl 1, pp 125-127
10 Ko RC, Ng TF (1998), “Evaluation of excretory/secretory
products of larval Taenia solium as diagnostic antigens for porcine and human cysticercosis”, Journal of Helminthology, 72, pp 147-154
11 Molinari J L et al (2002), “Discrimination between active and inactive neurocysticercosis by metacestode
excretory/secretory antigens of Taenia solium in an anzyme-linked immunosorbent assay”, Am J Trop Med Hyg, 66(6), pp 777-781
12 Shasha et al (1991), “Sero-epidemiological studies of cysticercosis in school children from two rural areas of
Transkei, South Africa”, Annal of Tropical Medicine and Parasitology, 85, pp 349-355
13 Shiguekawa K.Y et al (2000), “ELISA and Western Blotting tests in the detection of IgG antibodies to
Taenia solium metacestodes in serum samples in human neurocysticercosis”, Trop Med Int Health, 5(6),
pp 443-449
14 Silva A D et al (2000), “A quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the immunodiagnosis of neurocysticercosis using a purified
fraction from Taenia solium cysticerci”, Diagn Microbiol Infect Dis., 37(2), pp 87-92
15 Sloan L., Schneider S., Rosenblatt J (1995),
“Evaluation of enzyme – linked immunoassay for
serological diagnosis of cysticercosis”, J Clin Microbiol, 33(120), pp 3124-3128
16 Wang K H., Xu Z Y., Zeng D K (1993),
“Comparative study on antigens of Cysticercus
cellulosae by EITB and ELISA”, Chin J Parasitol Parasit Dis, 11, pp 53-5