Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư phổi người. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
Trang 119
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA CHẤT CT-1 CHIẾT XUẤT TỪ CÂY KHỔ SÂM CHO LÁ
TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH
Trịnh Hồng Anh*; Cao Minh Hưng*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn**
Phương Thiện Thương*; Nguyễn Minh Khởi*; Lê Tuấn Anh*
TÓM TẮT
Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá có tác dụng dự
phòng và điều trị ung thư phổi người tế bào không nhỏ (UTPNTBKN) trên chuột thiếu hụt miễn
dịch, thể hiện:
- Sau khi ghép tế bào (TB) ung thư, nhóm dự phòng có 20% chuột không xuất hiện khối u,
trong khi nhóm chứng và nhóm điều trị 100% xuất hiện khối u
- Kích thước khối u ở nhóm điều trị nhỏ hơn nhóm chứng ở mọi thời điểm theo dõi
- Sau 3 tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết ở nhóm chứng là 100%, nhóm dự phòng 60%, nhóm
điều trị 40%
* Từ khóa: Khổ sâm cho lá; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn
Research about Anticancer of CT-1 Extracted from Croton tonkinensis
Gagnep on Nude Mice
Summary
CT-1 extracted from Croton tonkinensis Gagnep with dose of 50 mg/kg has the effective
in prevention and treatment of lung cancer on nude mice:
- After cancer cell transplantation, 20% of mice in control group had no tumor, 100% of mice in
prevention and treatment groups had tumor
- The volume of tumor in treatment group was smaller than the other groups at any times
- After 3 months: control goup: 100% of nude mice dead, prevention group: 60% of nude
mice dead, treatment group: 40% of nude mice dead
* Key words: C tonkinensis; Acute toxicity; Semi-chronic toxicity
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là
Croton tonkinensis Gagnep, thuộc họ Thầu
dầu (Euphorbiaceae), là một loại cây đặc
hữu của Việt Nam được sử dụng làm thuốc chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài (lỵ cấp tính), ăn không tiêu, viêm loét tá tràng, đau dạ dày
* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
** Học viện Quân y
*** Viện Dược liệu
Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com)
Ngày nhận bài: 10/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/11/2014
Ngày bài báo được đăng: 28/11/2014
Trang 220
Các nghiên cứu về thành phần hóa
học của cây Khổ sâm cho lá bắt đầu
khoảng 20 năm trở lại đây cho thấy thành
phần hóa học chính của lá Khổ sâm cho
lá là ent-kauranediterpenoid, điển hình là
ent-18-acetoxy-7β-hydroxy
kaur-15-oxo-16-ene (tạm gọi là chất CT-1), có hàm
lượng khoảng 293,05 µg/g [3] Chất này
có tác dụng ức chế sự phát triển của
nhiều dòng TB ung thư trên in vitro, g m
thư v MCF-7, ung thư phổi NCI-H460
[6], ung thư gan SK-HEP1 [7], ung thư đại
tràng Caco-2 và LS180 trên in vitro [8]
Sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch (gọi
tắt là chuột nude) là một bước đột phá
trong nghiên cứu ung thư, cho phép
nghiên cứu ung thư người trên cơ thể
động vật Chuột nude có một gen bị đột
biến đ ng hợp tử (homozygous), gen này
quy định sự phát triển của lông và tuyến
ức Do đó, với gen bị đột biến, chuột nude
có tuyến ức bị suy giảm chức năng hoặc
thậm chí không có tuyến ức, không có
lông và hệ thống đáp ứng miễn dịch TB bị
hạn chế do suy giảm mạnh số lượng TB
lympho T Nhờ vậy, khi ghép TB ung thư
người lên chuột nude, khối u phát triển
không bị đào thải do yếu tố miễn dịch của
chuột và khối u mang đặc tính sinh học
khá tương đ ng với khối ung thư trên cơ
thể người
Để đánh giá tác dụng kháng ung thư
trên mô hình in vivo, ch ng tôi thực hiện
đề tài này nhằm: Đánh giá tác dụng
kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất
từ cây Khổ sâm cho lá trên mô hình chuột
thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư
phổi người
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Chuột thiếu hụt miễn dịch: 30 con
- TB UTPNTBKN (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) A549 (Công
ty ATCC, Hoa Kỳ)
- Môi trường nuôi cấy TB ung thư
- Thước đo kích thước khối u, tủ nuôi cấy TB
- Chất CT-1 thu được từ quá trình chiết xuất, phân lập từ lá của cây Khổ sâm cho lá
2 Phương pháp nghiên cứu
* Nuôi cấy TB ung thư và tạo khối u trên chuột:
TB UTPNTBKN A549 được nuôi cấy trong môi trường Eagle’s minimum essential medium, bổ sung fetal bovine serum 10%, 1% penicillin và streptomycin (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức), 1,5 mcg insulin/ml môi trường Mỗi chai nuôi cấy diện tích 75 cm2 chứa 106 TB TB được nuôi cấy tăng sinh và thay môi trường
2 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ 370C, CO2 5% Khi TB phát triển đạt 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển sang chai mới Tách TB và đếm, thu TB với n ng độ 107
TB/ml để phục vụ các thử nghiệm tiếp
theo
Chuẩn bị TB trước ghép: TB trước khi tách được rửa hai lần bằng dung dịch PBS 1X, sau đó tách bằng dung dịch trypsin-EDTA 1X Dung dịch TB ung thư
đã chuẩn bị được h t vào bơm tiêm 1 ml với số lượng 107/ml Cố định chuột nude
và tiêm 0,1 ml vào dưới da đùi phải (106
TB/chuột) Quá trình thao tác thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối
Trang 321
* Đánh giá hiệu quả dự phòng và điều
trị ung thư của CT-1:
- Phân nhóm: 30 chuột nude, phân
thành 3 nhóm:
+ Nhóm dự phòng: 10 con, uống CT-1
với liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2
tuần liên tục trước khi ghép TB tạo khối
ung thư
+ Nhóm điều trị: 10 con, uống CT-1 với
liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2 tuần
liên tục sau khi có khối ung thư
+ Nhóm chứng: 10 con, uống nước cất
với thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng/ngày,
trong 2 tuần liên tục sau khi có khối ung thư
- Sau khi ghép TB, xuất hiện khối u,
phân riêng chuột nhóm dự phòng, những
chuột còn lại được chia ngẫu nhiên thành
2 nhóm điều trị và nhóm chứng và bắt
đầu cho uống thuốc
- Đánh giá theo dõi sự phát triển khối u
tại vị trí tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần bằng
quan sát, sờ nắn và đo kích thước bằng
thước chính xác NSK
+ Kích thước khối u: đo theo 2 kích thước dài x rộng bằng thước chính xác NSK (Nhật Bản) 01 lần/tuần Kích thước
u được tính theo công thức: V = D x R2
x 0,5 (Yamaura và CS, 2000), trong đó: V: thể tích khối u; D: chiều dài khối u; R: chiều rộng khối u
Quá trình đánh giá kích thước khối u dừng lại khi có chuột chết ở bất kỳ nhóm nào, những con khác vẫn được theo dõi
để xác định thời gian sống thêm
+ Thời gian sống của các nhóm: thời gian sống của chuột được tính từ sau khi ghép TB ung thư Quá trình theo dõi thời gian sống của mỗi nhóm chuột dừng lại khi toàn bộ chuột của nhóm chứng đều chết
- Các chỉ tiêu đánh giá:
+ Tỷ lệ xuất hiện khối u
+ Kích thước khối u trung bình của các nhóm
+ Tỷ lệ chết sau theo dõi
KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn
1 Tác dụng dự phòng ung thƣ của CT-1
80%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Biểu đồ 1: Tỷ lệ xuất hiện khối u sau ghép TB ung thư ở các nhóm (n = 10)
Trang 422
Cho chuột thiếu hụt miễn dịch uống
chất CT-1 với liều 50 mg/kg/ngày trong
2 tuần liên tục, sau đó ghép 106 TB
A549/con Trong số 10 chuột nhóm này, 8
chuột phát triển khối u, 2 chuột (20%)
không phát triển khối u (sau 2 tuần ghép
TB) Đối với nhóm chứng và nhóm điều trị,
100% chuột đều có khối u phát triển Điều
đó cho thấy chất CT-1 có thể có tác dụng
dự phòng ung th- phæi
2 Tác dụng của CT-1 lên kích thước
khối u
Biểu đồ 2: Kết quả theo dõi thể tích khối u
qua các thời điểm nghiên cứu
Chuột sau khi hình thành khối u (ở ngày
thứ 7), kích thước khối u ở 3 nhóm tương
đương nhau
Tiếp tục theo dõi kích thước khối u
ch ng tôi nhận thấy: nhóm điều trị bằng
CT-1 có tác dụng cải thiện rõ rệt trong
kìm hãm tốc độ phát triển của khối u,
thể hiện kích thước khối u của nhóm
điều trị luôn nhỏ hơn nhóm chứng và
nhóm dự phòng ở mọi thời điểm theo
dõi Nhóm dự phòng, kích thước khối u
có xu hướng nhỏ hơn, tuy nhiên chưa
có sự khác biệt đáng kể so với nhóm
chứng Điều đó chứng tỏ, chất CT-1 không chỉ có tác dụng dự phòng ung thư phổi mà còn có tác dụng ức chế sự phát triển của TB ung thư phổi trên chuột thiếu
hụt miễn dịch
- Hình ảnh đại thể:
Nhóm chứng
Nhóm dự phòng
Nhóm điều trị
Ảnh 1: Hình ảnh khối u của 3 nhóm tại thời
điểm bắt đầu theo dõi
Trang 523
Khối u của các nhóm tại thời điểm bắt
đầu theo dõi có kích thước tương đ ng
Khối u của nhóm chuột được phân ngẫu
nhiên, có kích thước trung bình khoảng 70
mm3 Khối u có bờ rõ, cứng chắc, ít di
động Da phía trên không thay đổi màu sắc
Nhóm chứng
Nhóm dự phòng
Nhóm điều trị
Ảnh 2: Hình ảnh khối u của các nhóm tại
thời điểm 35 ngày sau điều trị
Sau 35 ngày điều trị, kích thước khối u
khác biệt đáng kể giữa các nhóm
3 Thời gian sống dƣ của chuột sau ghép TB ung thƣ
Thời gian sống dư của các nhóm: thời gian sống dư của chuột tạm được coi từ sau khi ghép TB ung thư Trong suốt thời gian này, ngoài việc đo kích thước khối u,
ch ng tôi còn theo dõi các biểu hiện bất thường khác như liệt, chết Quá trình theo dõi thời gian sống dư của mỗi nhóm chuột dừng lại khi toàn bộ chuột của nhóm chứng đều chết
Biểu đồ 3: Biểu diễn thời gian sống của
các nhóm chuột
Sau 3 tháng, toàn bộ chuột ở nhóm chứng chết, thống kê thời gian sống dư của từng nhóm, so sánh tỷ lệ chuột chết Nhóm điều trị còn 60% chuột sống (6 con), nhóm dự phòng còn 40% (4 con, trong đó
2 con không mọc u) Như vậy, chất CT-1
có tác dụng kéo dài thời gian sống dư đối
với chuột nude mang khối ung thư phổi người
KẾT LUẬN
Đánh giá tác dụng của chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung th- phæi người
ch ng tôi nhận thấy:
Trang 624
Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1
bước đầu cho thấy có tác dụng dự phòng
và điều trị ung thư phổi không biệt hóa TB
nhỏ, thể hiện:
- Nhóm dự phòng có 20% chuột không
xuất hiện khối u, trong khi nhóm chứng và
nhóm điều trị 100% đều xuất hiện khối u
- Kích thước khối u ở nhóm điều trị nhỏ
hơn nhóm chứng ở mọi thời điểm theo dõi
- Sau 3 tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết
ở nhóm chứng là 100%, nhóm dự phòng
60%, nhóm điều trị 40%
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Đình Bảng, Hồ Anh Sơn,
Nguyễn Lĩnh Toàn Nghiên cứu tạo khối ung
thư tuyến tiền liệt người trên chuột nude
“nude mice” bằng kỹ thuật ghép dị loài Tạp chí
Y - Dược học Quân sự 2011, 2
2 Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn Xác
định hoạt chất ent-kauranditerpenoid trong cây
Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,
Euphorbiaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng
cao Tạp chí Dược học 2011, 8, tr.29-33
3 Phan Minh Giang, Phan Tống Sơn Hoạt
tính gây độc TB của các ent-kauranditerpenoid từ
cây thuốc Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis
Gagnep., Euphorbiaceae) Tạp chí Dược học
2011, 419, tr.24-27
Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi Tổng quan các nghiên cứu
về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Khổ sâm cho lá Hà Nội 2014
5 Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Hamada Y, Otsuka H Cytotoxic Diterpenoids
from Vietnamese medicinal plant Croton
tonkinensis Gagnep Chem Pharm Bull 2005,
53 (3), pp.296-300
6 Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Lee JJ, Otsuka H Four ent-kaurane-type diterpenoids
from Croton tonkinensis Gagnep Chem Pharm Bull 2004, 52, pp.879-882
dvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/
Default.aspx?ATCCNum=30-500K&Template= bioproducts
CatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default
.aspx?ATCCNum=HTB-22&Template=cellBiology
9 Nguyen Minh Khoi, Phuong Thien Thuong, Saho Ohta, Shinichiro Shiota, Hironori Kanta, Kenji Takeuchi, Fumiaki Ito An ent-kauran
diterpenoid from Croton tonkinensis Induce
Apoptosis in Colorectal cancer cell through the phosphorylation of JNK mediated by reactive oxygen species and dual - specificity JNK kinase MKK4 Anticancer Agent in Medicinal Chemistry 2014, 14, pp.1051-1061.