Mục tiêu của đề tài này là khảo sát tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của các cao chiết cồn từ thạch tùng răng và râu rồng trên chuột nhắt trắng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN SUY GIẢM TRÍ NHỚ
CỦA CÁC CAO CHIẾT CỒN TỪ HAI LOÀI THẠCH TÙNG
THUỘC HỌ LYCOPODIACEAE TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG
Nguyễn Duy Tài, Nguyễn Ngọc Chương**, Nguyễn Thị Sơn**, Trần Công Luận***
TÓM TẮT
Mờ đầu: Mục tiêu của đề tài này là khảo sát tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của các cao chiết cồn từ
Thạch tùng răng và Râu rồng trên chuột nhắt trắng
Phương pháp nghiên cứu: dịch chiết cồn của 2 dược liệu được đánh giá tác động cải thiện trí nhớ trên
chuột swiss albino được gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin với mô hình Ma trận tám nhánh và Mê cung bơi
Kết quả: Cao chiết cồn của Thạch tùng răng (liều 0,533 g/kg) và Râu rồng (liều 0,171 g/kg) giúp cải thiện
tình trạng suy giảm trí nhớ trên chuột thực nghiệm LD 50 của cao Thạch tùng răng là 5,33g/kg, của cao Râu rồng
là 1,71 g/kg
Kết luận: Cao chiết cồn từ Thạch tùng răng và Râu rồng có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ trên chuột
nhắt trắng
Từ khóa: Thạch tùng răng, Râu rồng, suy giảm trí nhớ
ABSTRACT
STUDY ON ANTI-AMNESIC EFFECT OF ETHANOL EXTRACT OF HUPERZIA SERRATA AND HUPERZIA SQUARROSA ON INDUCED MEMORY IMPAIRMENT IN MICE
Nguyen Duy Tai, Nguyen Ngoc Chuong, Nguyen Thi Son, Tran Cong Luan
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 1 – 2014: 243 - 248
Background - Objectives: The aim of this work was to study recovery effect on memory and learning of
ethanolic extracts of Huperzia serrata and Huperzia squarrosa in mice
Methods: E thanolic extracts of these medicinal plants was evaluated for in vivo anti-amnesic activity
in memory indeficient Swiss albino mice induced by scopolamine with Arms radical maze and Morris water maze tests
Results: Ethanolic extracts of Huperzia serrata (0.533 g/kg) and Huperzia squarrosa (0.171 g/kg) help to recover cognitive impairment in mice LD 50 of oral administration of Huperzia serrata and Huperzia squarrosa was respectively 5.33g/kg and 1.71 g/kg
Conclusion: Ethanolic extracts of Huperzia serrata and Huperzia squarrosa exert recovery effects on impairment in mice memory and learning
Key words: Huperzia serrata, Huperzia squarrosa, cognitive impairment
ĐẶ T VẤN ĐỀ
Thuật ngữ mất trí nhớ bao gồm hai thể: suy
giảm trí nhớ và mất trí nhớ Tỷ lệ người dân
xuất hiện của các rối loạn về bộ nhớ tăng theo tuổi: 65-69 tuổi tỷ lệ là 1,5%; > 85 tuổi tỷ lệ là 35% và > 95 tuổi tỷ lệ là 60% Năm 2010 tỷ lệ người bị suy giảm trí nhớ là 35,6 triệu và dự
*Trường Cao Đẳng Y Tế Đồng Nai, **Khoa Y Học Cổ Truyền – ĐH Y Dược Tp.HCM,
***Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM
Trang 2đoán đến năm 2050 có 115.400.000 người bị suy
giảm trí nhớ(8) Mặt khác, cho đến nay, chưa có
phương pháp chữa lành suy giảm trí nhớ Tuy
nhiên, phát hiện và điều trị bệnh sớm bằng các
thuốc ức chế men acetylcholinesterase như
donepezil (Aricept), rivastigmin (Exelon),
galantamin (Reminyl)…, các thuốc chống oxy
hóa như vitamin E, ginko biloba… có thể làm
chậm diễn tiến của triệu chứng bệnh(9)
Do đó việc tìm ra một phương thuốc để điều
trị bệnh này đang là mục tiêu của rất nhiều nhà
nghiên cứu Một lĩnh vực đang thu hút các nhà
khoa học hiện nay đó là việc ứng dụng nghiên
cứu thảo dược trong điều trị bệnh Huperzin là
hợp chất tự nhiên được phân lập từ cây Thạch
tùng răng bởi các nhà khoa học Trung Quốc vào
acetylcholinesterase Đến năm 1996, Huperzin A
được sử dụng như là thuốc ở Trung Quốc và
được bán trên thị trường tại Mỹ dưới dạng thực
phẩm bổ sung vào năm 1999
Kế thừa những kết quả nghiên cứu trên, với
mong muốn tìm kiếm thuốc từ thảo dược tại Việt
Nam có tác dụng cải thiện sự suy giảm trí nhớ,
đề tài nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí
nhớ của cao chiết cồn từ hai loài Thạch tùng
thuộc họ Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng
được hình thành
NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Thạch tùng răng (Huperzia serrata), Râu rồng
(Huperzia squarrosa), được thu hái ở tỉnh Lâm
Đồng và định danh, lưu mẫu ở Bộ môn Tài
nguyên dược liệu thuộc Trung tâm Sâm và Dược
liệu thành phố Hồ Chí Minh-Viện Dược Liệu
Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng,
chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng
trung bình 20 ± 2 g, được cung cấp bởi viện
Pasteur TP.HCM và được để ổn định một tuần
trước khi thử nghiệm, mỗi chuột uống 0,2 ml/10g
thể trọng
Hóa chất
Dung môi chiết: cồn 96%
Thuốc làm giảm trí nhớ: scopolamine HBr mua từ hãng Sigma
Các hóa chất cần thiết cho tách chiết và phân tích được mua từ công ty Sigma (Mỹ) và một số công ty khác
Phương pháp nghiên cứu
Độc tính cấp (3)
- Chuẩn bị chuột thí nghiệm:
+ Để chuột nhịn đói 12 giờ trước khi cho uống thuốc
+ Cách chia lô chuột: chia chuột thí nghiệm làm nhiều lô, mỗi lô 6 con
- Đường dùng thuốc, thể tích nước thuốc cho uống:
+ Đường dùng thuốc: đường uống
+ Thể tích nước thuốc cho uống: 0,2 ml/10 g chuột, trong đó:
Lô chứng: cho mỗi con chuột uống nước cất với liều 0,2 ml/ 10 g chuột
Lô thử: cho mỗi chuột uống thuốc với liều 0,2
ml nước thuốc/10 g chuột
- Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn: + Giai đoạn thăm dò: khởi đầu từ liều cao nhất để nước thuốc có thể bơm được qua kim cho uống Xác định liều LD0 (liều tối đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100%)
+ Giai đoạn xác định: chuột được chia lô và cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0
và LD100, khoảng cách liều giữa các lô bằng nhau
- Các chỉ tiêu đánh giá kết quả:
+ Theo dõi các biểu hiện về hành vi của chuột trong vòng 72 giờ đầu sau khi dùng thuốc
và trong một tuần tiếp theo Ghi chép các biểu hiện trong thời gian đó Ghi giờ cho chuột uống thuốc, giờ xuất hiện các triệu chứng khác thường Ghi nhận số chuột chết trong từng lô Quan sát đại thể (quan sát tim, gan, thận, ruột) ngay sau khi chết đối với chuột bị chết và sau khi
Trang 3kết thúc thử nghiệm đối với chuột còn sống
+ Tính LD50 bằng phương pháp
Behrens-Karber
LD 50 = LD 100 - ∑ad
n
Trong đó:
LD50 : liều chết 50% số chuột thí nghiệm
LD100: liều nhỏ nhất gây chết 100% số chuột
thí nghiệm
a: số chuột chết trung bình 2 liều kế tiếp
d: hiệu hai liều kế tiếp
n: số trung bình chuột dùng ở mỗi liều
Khảo sát tác dụng cải thiện sự suy giảm trí
nhớ của cao Thạch tùng răng và Râu rồng
Chuột được chia thành hai nhóm:
+ Nhóm 1: là nhóm chuột bị gây suy giảm trí
nhớ và được chia thành 6 lô, mỗi lô 15 con:
Lô chứng sinh lý: cho uống nước cất
Lô bệnh lý: được gây bệnh bằng scopolamin
và cho uống nước cất (15 con)
Lô T1-1: được uống scopolamin liều 1 mg/kg
và cao Thạch tùng răng liều 0,533 g/kg
Lô T1-2: được uống scopolamin liều 1 mg/kg
và cao Thạch tùng răng liều 0,266 g/kg
Lô T2-1: được uống scopolamin liều 1 mg/kg
và cao Râu rồng liều 0,171 g/kg
Lô T2-2: được uống scopolamin liều 1 mg/kg
và cao Râu rồng liều 0,085 g/kg
+ Nhóm 2: là nhóm chuột không bị gây suy
giảm trí nhớ và được chia thành 2 lô:
Lô T1’-1: cho uống cao Thạch tùng răng liều
0,533 g/kg
Lô T2’-1: cho uống cao Râu rồng liều 0,171
g/kg
Khảo sát trí nhớ nhận diện không gian - Mô
hình mê cung bơi:
Đánh giá khả năng học tập, nhận thức và sự
hình thành trí nhớ của chuột qua các tiêu chí:
thời gian tiềm thời chuột tìm đến chân đế, thời
gian chuột ở vùng ¼ của diện tích bể bơi nơi đặt
chân đế
Cấu tạo Mê cung bơi:
Đường kính 1 m, chiều cao 60 cm Lượng nước trong mê cung bơi duy trì ở mức 46 cm, nhiệt độ của nước khoảng 30 0C trong suốt quá trình thí nghiệm
Mê cung bơi được đặt trong phòng có đặt sẵn các hình ảnh để định hướng không gian cho chuột trong quá trình học tập
Vị trí của các hình ảnh này không được thay đổi trong suốt quá trình chuột học tập Một phao
có đường kính 10 cm làm bằng nhựa được đặt tại một phần tư của mê cung bơi
Tiến hành thí nghiệm: chuột được huấn luyện và thử nghiệm trong 6 ngày
Ngày 1: tiến hành với 3 thử nghiệm, mỗi thử nghiệm là một vị trí bắt đầu bơi của chuột (thành của bể bơi có đánh dấu 4 điểm với khoảng cách các điểm đều nhau, để chuột bắt đầu bơi tại 3 điểm đánh dấu không trùng với diện tích ¼ của
bể bơi nơi đặt chân đế - vùng có phao) Trong mỗi thử nghiệm, cho chuột bơi trong 120 giây để tìm chân đế nổi trên mặt nước Sau khi kết thúc thử nghiệm, chuột được lau khô, sau đó trả về chuồng nuôi Nếu kết thúc 120 giây mà chuột không tìm thấy chân đế thì hướng dẫn chuột tìm đến chân đế và cho phép chuột đứng đó trong 15 giây để quan sát xung quanh trước khi đỡ chuột
ra khỏi bể nước
Ngày 2 - 5: mỗi ngày tiến hành với 3 thử nghiệm tương tự ngày 1, nhưng chân đế bị ẩn dưới mặt nước (mực nước trong bể cao hơn chân
đế 0,5 cm) Kết thúc mỗi thử nghiệm ghi lại thời gian tiềm thời chuột tìm đến chân đế
Ngày 6: tiến hành thử nghiệm như ngày 2 –
5, nhưng chân đế được lấy ra khỏi hồ nước Cho chuột bơi trong hồ với thời gian 60 giây Kết thúc thử nghiệm, ghi lại thời gian chuột bơi trong diện tích ¼ của bể bơi nơi đặt chân đế
Khảo sát trí nhớ nhận diện không gian – mô hình ma trận 8 nhánh:
Đánh giá khả năng học tập, nhận thức và sự
Trang 4hình thành trí nhớ của chuột qua các tiêu chí:
thời gian tiềm thời chuột đi vào cửa có đặt mồi,
số lần chuột đi vào cửa có đặt mồi
Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được
giảm khẩu phần ăn sao cho trọng lượng chỉ bằng
85% - 90% trọng lượng ban đầu
Thí nghiệm: chuột được huấn luyện và thử
nghiệm trong 7 ngày
Giai đoạn làm quen: chuột được làm quen
với ma trận trong 2 ngày
Ngày 1 : 5 chuột được đặt vào trụ trung tâm
của ma trận tám nhánh, các mẫu thức ăn được
đặt ở tất cả các cánh tay và được trải đều đến lối
vào ma trận, cho phép chuột khám phá ma trận
tám nhánh cho đến khi hết thức ăn hoặc đã 10
phút trôi qua
Ngày thứ 2, tiến hành tương tự ngày 1
nhưng thức ăn chỉ được đặt trong lọ cuối mỗi
cánh tay
Giai đoạn huấn luyện: chuột được huấn
luyện trong 4 ngày liên tục Trong giai đoạn này,
chỉ có 4 cánh tay (chọn cánh tay số 1, 3, 5, 7) được
đặt mồi (như ngày 2) và trình tự này không thay
đổi suốt thời gian huấn luyện 01 chuột được đặt
vào trụ trung tâm, sau 10 giây, tất cả các cửa tự
động mở, cho phép chuột tìm đến cánh cửa có
thức ăn Thử nghiệm kết thúc khi chuột đã tìm
được 4 cánh tay đặt mồi hoặc 10 phút
Giai đoạn kiểm tra: ngày thứ 7, tiến hành
tương tự giai đoạn huấn luyện Các thông số:
thời gian tiềm thời chuột đi vào cả 4 cửa có đặt
mồi, số lần chuột đi vào cửa không đặt mồi
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Độc tính cấp:
LD50 của cao Thạch tùng răng là 5,33 g/kg
LD50 của cao Râu rồng là 1,71 g/kg
Biểu hiện của chuột đã chết trong thử
nghiệm độc tính cấp: sau khi dùng các liều thử
nghiệm, chuột có các biệu hiện: quẫy mạnh đuôi,
lắc đầu liên tục, sùi bọt mép, mắt đứng tròng, tứ
chi cứng đờ và tử vong
- Hàm lượng chất chiết: dùng phương pháp chiết nóng với nước
Bảng 1: Hàm lượng chất chiết của Thạch tùng răng
và Râu rồng
+ Nhận xét: Hàm lượng chất chiết của Thạch tùng răng cao hơn Râu rồng
- Quy ra liều Dược liệu:
+ Thạch tùng răng:
Hàm lượng chất chiết là 23,16%; LD50 là 5,33 g/kg Lượng dược liệu là: 23,01 g/kg
+ Râu rồng:
Hàm lượng chất chiết là 4,97%; LD50 là 1,71 g/kg Lượng dược liệu là: 34,41 g/kg
Mô hình cải thiện suy giảm trí nhớ
Mô hình Mê cung bơi:
- Nhóm 1: là nhóm chuột bị gây suy giảm trí nhớ
+ Tiềm thời chuột tìm đến chân đế:
Bảng 2: Tiềm thời chuột tìm đến chân đế (giây)
Chứng sinh lý
59,1±4,4# 90,1±6,3
2
28,5±2,69
* ,#
45,8±5,7
#
27,6±1,1
* ,#
41,2±2,5 9#
( * ) p< 0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bình thường (#) p< 0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý
+ Kết quả (bảng 2): với mô hình tiềm thời chuột tìm đến chân đế, cao Thạch tùng răng với liều 0,533 g/kg và cao Râu rồng với liều 0,171 g/kg đều có tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình chuột bị suy giảm trí nhớ và chuột bình thường Tuy nhiên, đối với liều cao Thạch tùng răng liều 0,266 g/kg và Râu rồng liều 0,085 g/kg chỉ có tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bệnh lý
+ Thời gian chuột bơi trong vùng có phao
Trang 5Bảng 3: Thời gian chuột bơi trong vùng có phao
(giây)
Chứng
sinh lý
18±0,83# 41,2±2,8
6
15,1±0,8 8#
19,42±0,7 3#
14,8±0,6 1#
16,5±0,9 1#
( * ) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bình
thường (#)p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô
bệnh lý
+ Kết quả (bảng 3): với mô hình thời gian
chuột bơi trong vùng có phao, cao Thạch tùng
răng với liều 0,533 g/kg; 0,266 g/kg và cao Râu
rồng với liều 0,171 g/kg; 0,266 g/kg chỉ có tác
dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bệnh lý
- Nhóm 2: là nhóm chuột không bị gây suy
giảm trí nhớ
+ Tiềm thời chuột tìm đến chân đế (giây)
Bảng 4: Tiềm thời chuột tìm đến chân đế (giây)
( * ) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh
lý
+ Kết quả (bảng 4): cao Thach tùng răng liều
0,533 g/kg và cao Râu rồng liều 0,171 g/kg có tác
dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bình thường (lô
chuột uống nước cất)
+ Thời gian chuột bơi trong vùng có phao
(giây)
Bảng 5 Thời gian chuột bơi trong vùng có phao (giây)
(*) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng
sinh lý
+ Kết quả (bảng 5): cao Thach tùng răng liều
0,533 g/kg và cao Râu rồng liều 0,171 g/kg có tác
dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bình thường
Mô hình ma trận 8 nhánh:
- Nhóm 1:
+ Thời gian chuột đi vào các cửa có đặt mồi
(giây)
Bảng 6 Kết quả mô hình ma trận 8 nhánh ở chuột
dùng scopolamin
Chứng
217,63±13, 42#
291,75±
9,09
196,13±1 4,83#
235,63±3 1,47#
189,88±9 ,74*,#
226,65± 24,4#
(*) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (#)p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý
+ Kết quả (bảng 6): cao Thạch tùng răng với liều 0,533 g/kg; 0,266 g/kg và cao Râu rồng với liều 0,171 g/kg; 0,266 g/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bệnh lý Cao Râu rồng với liều 0,171 g/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bệnh lý và bình thường
- Số lỗi chuột mắc phải
Bảng 7 Số lỗi chuột mắc phải
Chứng sinh
2,25±1,04# 6,88±1,4
6
1,63±1,0 6#
4±1,07# 1,45±1,0
4#
3,38±0, 52#
(*) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (#) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý
+ Kết quả (bảng 7): cao Thạch tùng răng với liều 0,533 g/kg; 0,266 g/kg và cao Râu rồng với liều 0,171 g/kg; 0,266 g/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bệnh lý
- Nhóm 2: là nhóm mà chuột không bị gây suy giảm trớ nhớ
+ Thời gian chuột đi vào hết tất cả các cửa có đặt mồi (giây)
Bảng 8 Thời gian chuột đi vào hết tất cả các cửa có
đặt mồi (giây)
(*) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý
+ Kết quả (bảng 8): thời gian chuột đi vào các cửa có đặt mồi ở lô chuột uống cao Thạch tùng răng liều 0,533 g/kg và lô chuột uống cao Râu rồng liều 0,171 g/kg không có tác dụng trên chuột bình thường
Trang 6+ Số lỗi chuột mắc phải
Bảng 9: Số lỗi chuột mắc phải
(*) p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng
sinh lý
+ Kết quả (bảng 9): cao Thạch tùng răng liều
0,533 g/kg và cao Râu rồng liều 0,171 g/kg có tác
dụng cải thiện trí nhớ trên chuột bình thường
KẾT LUẬN
- Dựa vào kết quả độc tính cấp đã tìm được
liều LD50 của Thạch tùng răng và Râu rồng:
LD50 của Thạch tùng răng: 5,33g/kg
LD50 của Râu rồng: 1,71g/kg
- Tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng
răng và Râu rồng trên chuột thực nghiệm:
+ Liều 0,533 g/kg của Thạch tùng răng, 0,171
g/kg của Râu rồng có tác dụng cải thiện trí nhớ
trên chuột bị gây suy giảm trí nhớ bằng uống
scopolamin (1mg/kg) và trên chuột bình thường
+ Liều 0,266 g/kg của Thạch tùng răng, 0,085
g/kg của Râu rồng có tác dụng cải thiện trí nhớ
trên bị gây suy giảm trí nhớ bằng uống
scopolamin (1mg/kg)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Baddeley AD, Kopelman MD, Wilson BA (2004) “The Amnesic
Syndrome” Memory disorders for clinicians,16-30
2 Đỗ Trung Đàm (1996) Phương pháp xác định độc tính cấp của
thuốc NXB Y học Hà Nội, tr 50-57
3 Kaplan HI, Sadock BJ (1994) “The brain and behavior” Synopsis
of Psychiatry, 7 th Edition, pp 87-156
4 Ma X, Tan C, Zhu D, Gang DR (2005) “Is there a better source of huperzine A than Huperzia serrata? Huperzine A content of Huperziaceae species in China” J Agric Food Chem,
23(5):1393-8
5 Ma XC, Wang HX, Xin J, Zhang T, Tu ZH (2003) Effects of huperzine A on liver cytochrome P-450 in rats Acta Pharmacol Sin 24(8): 831-835
6 Nguyễn Đức Công (2012) Bệnh học người cao tuổi “Sa sút trí tuệ
và bệnh Alzheimer” NXB Y học, 244, 253-260
7 Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Thị Mỹ Xuân (2008) Nghiên cứu
tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn từ lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa L., Harms, họ Araliaceae) Tạp chí Y học Tp.HCM, tập 12 (số 4), 170-175
8 Tiia Ngandu (2012) Can we prevent memory disorders? The lancet Neurology, pp 3-4
9 Trần Thị Thu Hằng (2007) Dược lực học “Thuốc trị bệnh
Alzheimer” NXB Phương Đông, tr 235-239
Ngày nhận bài báo: 20/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014