Nghiên cứu với mục tiêu nhằm khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành tế bào thần kinh (neuron) và tế bào sao trên mô hình in vivo. Nghiên cứu thực hiện ghép các tế bào đầu dòng thần kinh vào não chuột.
Trang 1VAI TRÒ CỦA FOXG1 ĐỐI VỚI SỰ MẤT CÂN BẰNG TRONG QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH NEURON VÀ TẾ BÀO SAO TRONG HỘI CHỨNG WEST
Mai Phương Thảo*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của sự biểu hiện vượt mức của protein FoxG1 đối với sự hình thành tế bào
thần kinh (neuron) và tế bào sao trên mô hình in vivo
Đối tượng – Phương pháp: Mô tả hàng loạt ca, ghép các tế bào đầu dòng thần kinh vào não chuột
Kết quả: Biểu hiện vượt mức protein FoxG1 thúc đẩy sự hình thành tế bào thần kinh và ức chế sự hình thành các tế bào sao
Kết luận: Nghiên cứu này góp phần củng cố mối liên quan giữa hội chứng West và protein FoxG1 đồng thời
cũng phần nào làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh của hội chứng West vốn chưa được hiểu biết tường tận
Từ khóa: Protein FoxG1, biểu hiện vượt mức, tế bào đầu dòng thần kinh, tế bào thần kinh (neuron), tế bào sao, hội chứng West
ABSTRACT
THE ROLE OF FOXG1 IN NEUROGENESIS AND GLIOSIS IMBALANCE IN WEST SYNDROME
PATHOGENESIS
Mai Phuong Thao * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - Supplement of No 1 - 2015: 291 - 296
Objective: Evaluating effects of FoxG1 overexpression in the the formation of neurons and astrocytes in vivo
Materials – Methods: Case series report using neuronal progenitor transplantation on mouse brain
Results: Overexpression of FoxG1 promotes neurogenesis and inhibits gliogenesis
Conclusion: These findings consolidate the role of FoxG1 in West syndrome pathogenesis which remains
unclear
Key words: FoxG1 (forkhead nox protein G1), overexpression, neuronal progenitor, neurons, astrocytes, West syndrome
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hội chứng West (West syndrome), được đặt
theo tên của bác sĩ người anh William James
West, là một hội chứng động kinh hiếm gặp ở trẻ
em và trẻ nhũ nhi Tần suất mắc bệnh ở trẻ mới
sinh vào khoảng 1/2000 đến 1/4000(9) Biểu hiện
lâm sàng của hội chứng West gồm có tam chứng:
động kinh, bất thường trên EEG đột ngột, lan tỏa
với hình ảnh sóng cao không đồng dạng
(hypsarrhythmia) đặc trưng và chậm phát triển
trí tuệ Tuy nhiên cơ chế bệnh sinh của hội
chứng West vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ Nhiều giả thiết được đặt ra, trong số đó, có giả thiết cho rằng sự tăng cường quá mức trong hoạt động của các synap thần kinh dẫn đến tình trạng động kinh và hình ảnh EEG bất thường Nếu tình trạng kích thích synap kéo dài sẽ dẫn đến chậm phát triển tâm thần, vận động ở trẻ(4) Một
số nghiên cứu gần đây đưa ra bằng chứng cho thấy mối liên quan mật thiết giữa hội chứng West và lặp đoạn dài trên nhiễm sắc thể số 14 (14q12), có chứa gen FoxG1(1,12) đóng vai trò quan
* Bộ môn Sinh lý học, ĐH Y Dược TpHCM
Trang 2trọng trong quá trình hình thành não bộ trong
thời kì phôi thai
Forkhead box protein G1 (FoxG1) là protein
được mã hóa từ gen FoxG1 trên NST 14 Đây là
protein kiểm soát phiên mã có vai trò quan trọng
trong việc hình thành não bộ trong giai đoạn
phôi thai (hình thành não bộ, phân vùng não bộ,
kiểm soát sự phân bào của các tế bào đầu dòng
thần kinh…)(8,10,11) và trong giai đoạn trưởng
thành (duy trì sự tân tạo các neuron nhằm phục
vụ cho các chức năng thần kinh cao cấp)(5,14) Rối
loạn điều hòa hoạt động của gen FoxG1 được
cho là có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của hội
chứng West Trong một nghiên cứu gần đây,
một nhóm tác giả đã chỉ ra rằng việc tăng biểu
hiện của protein FoxG1 trên mô hình nuôi cấy tế
bào đầu dòng thần kinh làm tăng quá trình tạo
thành các neuron mới và ức chế sự hình thành
các tế bào sao(2) Sự mất cân đối giữa số lượng
neuron và tế bào sao ảnh hưởng rất lớn lên hoạt
động điện thế của não Do đó, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu tăng biểu hiện của protein
FoxG1 trên mô hình chuột thực nghiệm bằng
cách ghép các tế bào đầu dòng thần kinh đã
được kích hoạt gen FoxG1 vào não chuột nhằm
đánh giá biểu hiện của các tế bào này và là nền
tảng cho các nghiên cứu làm sáng tỏ cơ chế bệnh
sinh của hội chứng West
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Động vật thực nghiệm
Các dòng chuột CD1 wild-type (wt), EGFP
và Tau-EGFP được dùng trong nghiên cứu này
được nuôi dưỡng và phát triển tại cơ sở động vật
của viện SISSA, Trieste-Italy
Nuôi cấy tế bào
Các tế bào đầu dòng thần kinh tách ra từ
phôi chuột được nuôi cấy trong dĩa 24 giếng với
mật độ 3*105 tế bào / giếng trong 350 μl môi
trường giúp tế bào sinh sản nhưng không biệt
hóa: DMEM-F12, 1X Glutamax (Gibco), 1X N2
supplement (Invitrogen), 1 mg/ml BSA, 0,6%
glucose, 2 μg/ml heparin (Stemcell technologies),
20 ng/ml bFGF (Invitrogen), 20 ng/ml EGF
(Invitrogen), 1X Penicillin/Streptomycin (Gibco),
10 pg/ml fungizone (Gibco) và 2μg/ml doxycycline (Clontech)
Lenti virus vector
Lenti virus thế hệ thứ 3 được chuẩn bị theo protocol của Follenzi và Naldini bằng cách biến nạp các plasmid khung của virus và các plasmid mang bộ gen cần biểu hiện vào tế bào HEK293T Sau 24 – 48 giờ, đem môi trường nuôi cấy tế bào
ly tâm 100.000g để thu các virion và hòa tan virion trong PBS Nồng độ virion được định lượng bằng RT-PCR
Cấy ghép tế bào
Các tế bào sau khi nuôi cấy được thu lại và huyền phù với nồng độ 50000 tế bào/μl Lấy 3 μl dịch tế bào tiêm vào thùy thái dương của não chuột sơ sinh (1-2 ngày tuổi)
Hóa mô miễn dịch huỳnh quang
Mô não chuột này được cắt với độ dày 10-22
μm Ủ mẫu mô với dung dịch blocking (1X PBS, 10% FBS, 1mg/ml BSA và 0,1% Triton X100) trong 1 giờ, kháng thể 1 qua đêm ở nhiệt độ 4oC,
và kháng thể 2 trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng Sau
đó, mẫu mô được nhuộm với dung dich DAPI (4’,6’-diamino-2-phenylindone) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
Phân tích và xử lý hình ảnh
Hình ảnh được chụp bằng kính hiển vi huỳnh quang Nikon TI-E vật kính 20 và 40X và sau đó được xử lý bằng phần mềm GIMP 2.6 và Image J để phân tích số lượng các loại tế bào
Phân tích thống kê
Các thí nghiệm đều được thực hiện lặp lại
ít nhất 3 lần Kết quả được kiểm định bằng t-test và được cho là có ý nghĩa thống kê khi trị
số p < 0,05
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tế bào đầu dòng thần kinh có khả năng sống sót sau khi được tiêm vào não chuột
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng sống sót của các tế bào đầu dòng
Trang 3thần kinh sau khi đã được cấy vào não của vật
tiếp nhận Để theo dấu các tế bào sau ghép,
chúng tôi dùng dòng chuột biểu hiện protein
huỳnh quang GFP (green fluorescent protein)
Tế bào đầu dòng thần kinh của dòng chuột này
được tách ra từ phôi chuột 12 ngày tuổi và nuôi
trong môi trường thuận lợi cho sự phân bào
trong vòng 7 ngày Đến ngày thứ 7, tế bào được
ghép vào thùy thái dương của não chuột CD1 sơ
sinh (chuột 1-2 ngày tuổi) với số lượng 150.000 tế
bào/3μl Sau khi cấy ghép, chuột sơ sinh được
nuôi bằng sữa mẹ đến khi trưởng thành Bằng
phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang,
chúng tôi phát hiện rằng các tế bào đầu dòng
thần kinh có thể sống sót hơn 2 tháng sau khi
ghép mà hoàn toàn không cần sử dụng bất kì
liệu pháp ức chế miễn dịch nào (Hình 1)
Hình 1 Các tế bào đầu dòng thần kinh từ chuột
EGFP sau khi được ghép vào não chuột sơ sinh
Tín hiệu huỳnh quang của nhân màu xanh dương,
protein EGFP màu xanh lá cây Hình ảnh được chụp
dưới vật kính 20X và 40X
Thiết kế gen mã hóa FoxG1 trên Lenti virus
vector và chuẩn hóa qui trình cấy ghép tế
bào đầu dòng thần kinh vào não chuột
Từ kết quả bước đầu, chúng tôi nhận thấy số
lượng tế bào thần kinh sống sót thay đổi tùy theo
khả năng đáp ứng của chuột nhận ghép Để
đánh giá khách quan về tính chất cũng như số
lượng của các tế bào thần kinh đã được can thiệp
gen, cụ thể là tăng cường khả năng biểu hiện của
FoxG1 (gọi tắt là tế bào FoxG1-GOF, với GOF là
gain of function), chúng tôi tiến hành thí nghiệm
cấy ghép sử dụng đồng thời cả hai loại tế bào
đầu dòng thần kinh, nhóm can thiệp FoxG1-GOF
và nhóm chứng vào cùng một vật tiếp nhận
Để tăng cường biểu hiện protein FoxG1 trên
tế bào đầu dòng thần kinh, chúng tôi sử dụng phương pháp chuyển gen vào tế bào bằng Lenti virus vector Lenti virus là một nhánh virus thuộc hệ Retroviridae và là một công cụ dùng để chuyển gen vào tế bào rất hiệu quả, có thể chuyển đoạn gen mong muốn vào tế bào đang phân chia cũng như tế bào trưởng thành (các loại virus vector thông thường khác chỉ có khả năng xâm nhập vào v đang trong giai đoạn phân chia)(3) Bộ khung của Lenti virus vector được hình thành từ các chủng Lenti virus thông thường và được loại bỏ khả năng tự nhân lên của virus sau khi đã xâm nhập vào bộ gen Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các
tế bào đầu dòng thần kinh từ dòng chuột biểu hiện Tau-EGFP, chứa gen mã hóa cho protein EGFP được gắn ngay sau trình tự gen mã hóa cho protein Tau Protein Tau là một protein luôn được biểu hiện ở các tế bào neuron trưởng thành, do đó với dòng chuột đột biến này, các tế bào neuron trưởng thành sẽ phát ra tín hiệu huỳnh quang EGFP màu xanh lá
Tế bào đầu dòng thần kinh được tách từ phôi chuột Tau-EGFP 12 ngày tuổi, sau đó được biến nạp (transform) các phức hợp Lenti virus vector mang gen mong muốn Để đảm bảo chỉ có tế bào đầu dòng thần kinh được tăng cường biểu hiện FoxG1, chúng tôi sử dụng promoter ptα1 - chỉ được kích hoạt ở tế bào đầu dòng thần kinh Hơn nữa, để có thể kích hoạt và bất hoạt gen FoxG1 vào bất kì thời điểm nào trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi sử dụng kĩ thuật TetON (6, 7) Trong kĩ thuật này, FoxG1 sẽ không được biểu hiện trực tiếp dưới sự tác động của promoter ptα1 mà sẽ được kích hoạt gián tiếp qua promoter TRE (tetracycline respone element), promoter TRE lại chịu sự kiểm soát của phức hợp ptα1-rtTA Trong môi trường nuôi cấy có chứa Doxycycline (dẫn xuất của nhóm tetracycline) thì rtTA sẽ kích hoạt TRE và từ đó phiên mã gen FoxG1 và ngược lại trong môi
Trang 4trường không có Doxycycline, quá trình này sẽ
bị bất hoạt Bên cạnh đó, để phân biệt được hai
nhóm tế bào được ghép vào vật chủ, chúng tôi
sử dụng thêm Lenti virus vector có mang gen
mã hóa mCherry (protein phát huỳnh quang
màu đỏ) vào nhóm tế bào FoxG1-GOF Như vậy,
khi các tế bào neuron được cấy ghép sống sót
trong não vật chủ, một nhóm sẽ chỉ phát tín hiệu
huỳnh quang màu xanh lá (EGFP) - là nhóm
chứng, và một nhóm tế bào vừa phát tín hiệu huỳnh quang màu xanh lá vừa có tín hiệu huỳnh quang đỏ - là nhóm FoxG1-GOF Hai nhóm tế bào được gây nhiễm với các phức hợp lenti virus
như hình 2, trong đó nhóm chứng được gây
nhiễm với lenti virus chứa gen PLAP (placenta alkaline phosphatase) - một gen không có hiệu quả sinh học trên tế bào thần kinh
Hình 2 Các phức hợp lenti virus vector dùng để chuyển đoạn gen mong muốn vào các tế bào đầu dòng thần kinh
FoxG1-GOF là nhóm được tăng cường biểu hiện FoxG1 Control là nhóm chứng
FoxG1 thúc đẩy sự biệt hóa của tế bào đầu
dòng thần kinh thành neuron
Sau khi được biến nạp với các nhóm Lenti
virus vector, tế bào đầu dòng thần kinh được
tiếp tục nuối cấy trong môi trường kích thích
phân bào trong vòng 7 ngày và được bổ sung
Doxycyclin (nồng độ 2μg/l) nhằm kích hoạt gen
FoxG1 Sau đó, các tế bào đầu dòng thần kinh
của hai nhóm được trộn lẫn theo tỉ lệ 1:1 và tiêm
vào thùy thái dương của chuột sơ sinh CD1 Mô
não chuột được phân tích vào thời điểm 7 và 14 ngày sau khi cấy ghép
Chúng tôi nhận thấy các tế bào FoxG1-GOF (biểu hiện đồng thời EGFP và mCherry) biệt hóa thành neuron nhiều hơn so với nhóm chứng (chỉ biểu hiện EGFP) gấp 1,5 lần (p<0,01) Điều này chứng tỏ các tế bào đầu dòng thần kinh khi được tăng biểu hiện của FoxG1, chúng có khuynh hướng biệt hóa thành neuron nhiều hơn so với tế
bào sao (Hình 3)
Hình 3 Mức độ biệt hóa thành neuron của nhóm FoxG1-GOF và nhóm chứng khi cùng được cấy ghép vào một
vật chủ (mCherry được dùng để đánh dấu FoxG1-GOF) (A) Quy trình thực hiện thí nghiệm với các mốc thời gian (GFs: growth-factors) (B) Kết quả hóa mô miễn dịch cho thấy hai nhóm tế bào được cấy ghép sống sót và biệt hóa thành neuron trong não vật chủ (C) Mức độ biệt hóa thành neuron của tế bào FoxG1-GOF luôn cao hơn nhóm chứng 50%
Để xác định kết quả quan sát được là do tăng
mức độ biểu hiện của FoxG1, không phải do các
thành phần khác trong cấu trúc của Lenti virus vector, thí nghiệm được lặp lại nhưng dùng
Trang 5mCherry để đánh dấu cho nhóm tế bào chứng
thay vì nhóm FoxG1-GOF Như vậy, trong thí
nghiệm này, nhóm tế bào biểu hiện FoxG1-GOF
chỉ phát tín hiệu huỳnh quang màu xanh lá
EGFP và nhóm tế bào chứng phát tín hiệu huỳnh
quang màu xanh lá EGFP và màu đỏ mCherry Tương tự, chúng tôi ghi nhận kết quả tỉ lệ các tế bào FoxG1-GOF vẫn biệt hóa thành neuron cao
gấp 1,5 lần so với nhóm chứng (Hình 4)
Hình 4 Mức độ biệt hóa thành neuron của hai nhóm tế bào FoxG1-GOF và nhóm chứng khi cùng được cấy ghép vào một vật chủ (mCherry được dùng để đánh dấu nhóm chứng) (A) Quy trình thực hiện thí
nghiệm với các mốc thời gian (GFs: growthfactors) (B) Kết quả hóa mô miễn dịch cho thấy cả hai nhóm tế bào được cấy ghép sống sót và biệt hóa thành neuron trong não vật chủ (C) Mức độ biệt hóa thành neuron của tế bào FoxG1-GOF luôn cao hơn nhóm chứng
BÀN LUẬN
Từ các kết quả trên, chúng tôi có thể khẳng
định FoxG1 có vai trò thúc đẩy các tế bào đầu
dòng thần kinh biệt hóa theo khuynh hướng
thành neuron nhiều hơn là thành tế bào sao Với
số lượng các tế bào được cấy ghép ban đầu ở hai
nhóm là bằng nhau, việc nhóm tế bào
FoxG1-GOF biệt hóa thành nhiều neuron hơn nhóm
chứng cũng đã chứng minh một cách gián tiếp
rằng số lượng các tế bào sao được hình thành từ
nhóm FoxG1-GOF sẽ ít hơn nhóm chứng, điều
này sẽ dẫn đến sự mất cân đối về số lượng trong
việc hình thành neuron và tế bào sao
Với kết quả thí nghiệm ở trên, chúng tôi đã
chứng minh được rằng việc tăng biểu hiện của
protein FoxG1 làm mất cân bằng trong việc hình
thành các neuron và các tế bào sao từ các tế bào
đầu dòng thần kinh không chỉ trên in vitro mà
còn cả trên in vivo Như đã trình bày trong phần
đặt vấn đề, các bệnh nhi được chẩn đoán mắc hội chứng West đa phần đều có lặp đoạn dài NST số 14, trên đoạn lặp này có chứa 1 gen rất quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển não bộ, đó là gen FoxG1 Đoạn lặp này làm tăng mức độ biểu hiện của protein FoxG1 và như vậy sẽ làm mất cân bằng tỉ lệ hình thành giữa neuron và tế bào sao Tế bào sao không chỉ có vai trò nâng đỡ và dinh dưỡng cho các neuron mà chúng còn có vai trò điều hòa hoạt động của các synap thần kinh Thật vậy, khi các kích thích diễn ra tại các synap và neuron, các chất trung gian dẫn truyền thần kinh như glutamate, ATP… cũng như ion Kali được phóng thích rất nhiều, chính các tế bào sao sẽ có vai trò như là các tế bào đệm, hấp thu và phân hủy các hợp chất và ion Kali còn sót lại(13) Do đó, việc mất cân bằng về số lượng giữa neuron và tế bào sao, đặc biệt là khuynh hướng tăng số lượng neuron và giảm số lượng tế bào sao sẽ dẫn đến tăng tình
Trang 6trạng kích thích của các synap cũng như các
neuron và đây chính là tiền đề cho cơ chế bệnh
sinh của hội chứng West Chính sự tăng kích
thích quá mức của hoạt động thần kinh này sẽ
dẫn đến biểu hiện lâm sàng là động kinh và biểu
hiện hình ảnh các sóng cao không đồng dạng
(hypsarrhythmia) trên EEG
KẾT LUẬN
Việc chứng minh được mối liên quan giữa
gen FoxG1 và cơ chế bệnh sinh của hội chứng
West qua các thí nghiệm trên cũng đặt nền tảng
cho việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế bệnh sinh
của hội chứng này Gần đây, một số nghiên cứu
cũng chỉ ra rằng việc tăng biểu hiện của protein
FoxG1 dẫn đến tăng sự hình thành các sợi trục
(axon) cũng như các sợi nhánh (dendrite) trên
các neuron thần kinh trên mô hình nuôi cấy tế
bào(2), điều này cũng mở ra thêm một hướng
nghiên cứu mới về mối liên quan giữa protein
FoxG1 và hội chứng West Nếu hiện tượng tăng
sinh sợi trục và sợi nhánh của các neuron thần
kinh được khẳng định trên mô hình động vật
thực nghiệm thì có thể nói rằng bức tranh toàn
cảnh về cơ chế bệnh sinh của hội chứng West
càng lúc càng sáng tỏ và từ đó chúng ta sẽ tìm
được những chiến lược phù hợp trong việc đều
trị hội chứng này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Toldo I, Donà M, Murgia A, Boniver C, Sartori S (2014) 14q12
duplication including FOXG1: is there a common
age-dependent epileptic phenotype? Brain Dev 36(5):402–407
A (2010) Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote
neuronogenesis Stem Cells Dayt Ohio 28(7):1206–1218
Transfer Springer
null, Pinard null (1994) Infantile spasms: a pathophysiological hypothesis Semin Pediatr Neurol 1(2):83–89
Dimos JT, Lemischka IR, Studer L, Temple S (2009) Bmi-1 cooperates with Foxg1 to maintain neural stem cell self-renewal in the forebrain Genes Dev 23(5):561–574
mammalian cells by tetracycline-responsive promoters Proc Natl Acad Sci U S A 89(12):5547–5551
Bujard H (1995) Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells Science 268(5218):1766–1769
controls the proliferation and differentiation of neocortical progenitor cells through independent mechanisms J Neurosci Off J Soc Neurosci 22(15):6526–6536
North Am 36(2):311–329
required for specification of ventral telencephalon and region-specific regulation of dorsal telencephalic precursor proliferation and apoptosis Dev Biol 283(1):113–127
neuronogenesis and hippocampal morphogenesis to the dorsomedial pallium J Neurosci Off J Soc Neurosci 25(17):4435–4441
12 Pontrelli G, Cappelletti S, Claps D, et al (2014) Epilepsy in patients with duplications of chromosome 14 harboring FOXG1 Pediatr Neurol 50(5):530–535
Neuroscience 158(1):253–259
FoxG1 haploinsufficiency results in impaired neurogenesis in the postnatal hippocampus and contextual memory deficits Hippocampus 16(10):875–890