Phân tích gen ftsZ - xác định vật chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ theonella swinhoei

Mục tiêu nghiên cứu bài viết nhằm xác định vật chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ Theonella swinhoei căn cứ trên kết quả phân tích gen ftsZ. Phương pháp: khuếch đại gen ftsZ từ ADN toàn phần của T. swinhoei bằng cặp mồi đặc hiệu, giải trình tự và phân tích bằng chương trình BLAST và BioEdit - ClustalW.

PHÂN TÍCH GEN ftsZ - XÁC ĐỊNH VẬT CHỦ SẢN XUẤT HỢP CHẤT TỰ NHIÊN ONNAMIDE TỪ THEONELLA SWINHOEI Nguyễn Tú Anh*

TÓM TẮT

Mục tiêu: xác định v t chủ sản xuất hợp chất tự nhiên onnamide từ Theonella swinhoei căn

cứ trên kết quả phân tích gen ftsZ Phương pháp: khuếch đại gen ftsZ từ ADN toàn phần của

T swinhoei bằng cặp mồi đặc hiệu, giải trình tự và phân tích bằng chương trình BLAST và BioEdit - ClustalW Kết quả: phân tích trình tự nucleotid các ftsZ từ ADN toàn phần của

T swinhoei cho thấy có độ tương đồng từ 56 - 58% với gen ftsZ của loài Dehalococcoides ethenogenes thuộc ngành Chloroflexi Trình tự các gen ftsZ phân l p được có độ tương đồng

cao với nhau (  96%), nhưng không giống nhau hoàn toàn Kết luận: kết quả này đã đặt ra giả

thuyết có nhi u biến thể gen ftsZ từ những chủng vi khuẩn (VK) cộng sinh khác nhau để giải

thích hiện tượng tìm thấy nhi u hợp chất thuộc họ onnamide từ T swinhoei

* Từ khóa: Theonella swinhoei; Onnamide; Gen ftsZ, Chloroflexi; Vi sinh v t cộng sinh

Determination of the Producer of Onnamides from the Theonella Swinhoei Based on the ftsZ Gene

Summary

Objectives: To determine the producer of onnamides from the Theonella swinhoei based on the ftsZ gene Methods: Amplify the ftsZ gene from the metagenomic DNA of T swinhoei using the specific primers These PCR products were sent for sequencing and analyzed applying BLAST and BioEdit - ClustalW Results: Nucleotide sequence analysis showed that the amplicons from the metagenomic DNA of T swinhoei had the identity ranging from 56 to 58% with the ftsZ of Dehalococcoides ethenogenes, a member of the phylum Chloroflexi These cloned FtsZ amplicons shared high but not complete identities ( 96%) Conclusion: These results demonstrate the existence of multiple closely related ftsZ variants inside the metagenomic DNA of T swinhoei This might explain the presence of closely related onnamide variants, which could belong to distinct, diversified strains

* Key words: Theonella swinhoei; Onnamide; ftsZ gene; Chloroflexi; Symbiontic bacteria.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh v t biển, trong đó có Theonella

các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh

học cao Mặc dù v y, v t chủ th t sự

sản xuất những hợp chất này lại được cho là các VK cộng sinh với chúng Giả thuyết cộng sinh được đ xuất do công thức hóa học của các chất từ sinh v t biển và từ một số VK tương tự nhau [1, 2]

* Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh

Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tú Anh (nguyentuanhvn@gmail.com)

Ngày nhận bài: 01/02/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/03/2016

Ngày bài báo được đăng: 21/03/2016

Do VK cộng sinh rất khó nuôi cấy trong

đi u kiện phòng thí nghiệm, nên kỹ thu t

sinh học phân tử phân tích hệ gen toàn

phần, bao gồm ADN của sinh v t biển và

ADN của hệ VK cộng sinh được áp d ng

Một ví d điển hình, bằng kỹ thu t này,

v t chủ sản xuất hợp chất polyketid pederin

được xác định chính là VK Pseudomonas

sống cộng sinh với loài kiến ba khoang

Paederus fulcipes [3]

Từ T swinhoei, 22 loại onnamide thuộc

nhóm hợp chất polyketide - nonribosomal

peptide (PK-NRP) họ pederin được tìm thấy

(hình 1) Onnamide có hoạt tính kháng

khuẩn, kháng virut, đặc biệt có độc tính trên một số dòng tế bào ung thư ở ngưỡng picomolar [4] Vì v y, để hiểu rõ con đường sinh tổng hợp onnamide trong tự nhiên,

hệ gen toàn phần của T swinhoei ~ 32 Gbp

đã được chiết tách Khi phân l p gen PKS-NRPS (polyketide synthetase - nonribosomal peptide synthetase) chịu trách nhiệm sinh tổng hợp onnamide cũng đã bộc lộ được gen không phải onn - gen ftsZ nằm li n k

Phân tích trình tự nucleotid của ftsZ

giúp có nh n định v v t chủ sản xuất onnamide cũng như sự đa dạng của

nhóm hợp chất onnamide từ T swinhoei

Onnamide F Theopederin E

Theopederin D Theopederin F

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

được dùng để chiết tách ADN toàn phần

theo quy trình được Piel và CS mô tả [3]

* Khuếch đại gen ftsZ:

Dựa trên trình tự gen ftsZ phân l p

được ~ 883 bp, thiết kế cặp mồi đặc hiệu

gồm mồi xuôi 5’ CGC TGC GAC GTA

CCC AAC C 3’ và mồi ngược 5’ CGT

CAT CGG ACA TAG GCG TAA C 3’

Thành phần phản ứng PCR khuếch đại

gen ftsZ gồm 2, 5 µl buffer 10 X ThermoPol;

0,5 µl dNTPs 10 mM; 0,25 µl BSA 100 X;

0,25 µl mồi xuôi 50 µM; 0,25 µl mồi ngược

50 µM; 0,125 µl Hot-start polymerase; 0,5

µl ADN toàn phần; nước cất vừa đủ 25 µl

Chương trình phản ứng PCR gồm 35 chu

k : biến tính ADN ở 95oC/30 giây, bắt cặp

mồi ở 62oC/60 giây, kéo dài ở 72oC/60 giây

Để chuẩn bị tạo dòng sản phẩm PCR bằng

kỹ thu t TA cloning, trong chương trình

PCR, giai đoạn kéo dài cuối cùng tiến hành

trong 10 phút Nhờ v y, các nucleotide A

tự dộng được thêm vào đầu 3’ của gen

ftsZ, tạo đầu t n cùng 3’-A Phát hiện sản

phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên

gel agarose 1%

* Tạo dòng đoạn gen ftsZ bằng kỹ thuật

TA cloning:

Sử d ng vector tạo dòng pBluescript

SK II (-), cắt bằng enzym cắt giới hạn

EcoRV Tiếp theo, tạo T-vector có đầu t n

cùng 3’-T bằng cách bổ sung dTTP theo phản ứng: 15 µl vector pBluescript SK II (-)

đã cắt bằng EcoRV; 2 µl buffer 10 X ThermoPol; 0,5 µl dTTP 100 mM; 2 µl Taq

polymerase; ủ ở 72oC trong 2 giờ

Các sản phẩm ADN được tinh sạch sau khi chạy điện gi trên gel agarose và

sử d ng bộ kít QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)

Ghép nối sản phẩm PCR có đầu 3’-A

và vector 3’-T bằng enzym T4 ligase Sau

đó đưa vào tế bào E coli XL1 blue bằng

phương pháp thẩm điện Chọn tế bào được biến nạp bằng sàng lọc khuẩn lạc

VK trắng/xanh

* Chiết tách ftsZ từ E coli:

ftsZ từ tế bào E coli biến nạp được

chiết tách và gửi giải trình tự tại Công ty GATC Biotech (giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động theo phương pháp Sanger)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ

BÀN LUẬN

1 Phân tích trình tự ftsZ của fosmid

pTSSH2

Trong quá trình tìm kiếm gen mã hóa

onnamide từ ADN toàn phần của T swinhoei,

đã phát hiện đoạn gen ftsZ nằm li n k gen onnI trên fosmid pTSSH2 FtsZ là

protein thuộc họ tubulin - like có ở VK, đóng vai trò trong quá trình phân chia tế bào VK và có tính bảo tồn cao (hình 2)

[5]

onn genes

ftsZ mã hóa protein tubulin-like cần thiết cho

quá trình phân chia vi khuẩn

© 2011 E Fischer-Friedrich

các gen không mã hóa cho onnamide, đoạn không màu: gen ftsZ (b) FtsZ (mũi tên)

trong quá trình phân chia tế bào VK

2 Phân tích trình tự ftsZ từ ADN toàn

phần của T swinhoei

Do có nhi u hợp chất onnamide hiện

diện trong T swinhoei, vì v y giả thuyết

m i v t chủ chịu trách nhiệm sản xuất

một loại onnamide được đặt ra Với m c

đích tìm hiểu sự đa dạng của trình tự

gen ftsZ tồn tại trong hệ ADN toàn phần,

biến nạp để thu ftsZ Đặt tên 5 trình tự

thu nh n: pTA1-1 - pTA1-5 Phân tích

bằng BLAST cho thấy cả 5 trình tự

nucleotide đ u mã hóa cho protein FtsZ

của Dehalococcoides ethenogenes, thuộc

ngành Chloroflexi với tỷ lệ tương đồng

56 - 58% Tiếp t c so sánh trình tự ftsZ từ

nghiên cứu với 23 trình tự ftsZ của VK khác

có độ tương đồng cao nhất Những VK này

thuộc 03 ngành Firmicutes, Cyanobacteria

và Chloroflexi; trong đó ftsZ phân l p được

thuộc ngành Chloroflexi Phân tích này đã cung cấp bằng chứng v chủ nhân th t

sự của hợp chất onnamide là VK ngành Chloroflexi Chloroflexi gồm những VK không lưu hu nh màu l c, có khả năng tự dưỡng - nghĩa là sản xuất chất hữu cơ từ CO2 và các chất vô cơ có trong môi trường dưới xúc tác của ánh sáng Vì v y, Chloroflexi còn được xếp vào nhóm VK quang hợp [6] Nhóm VK này thấy nhi u ở động v t sống trên cạn, sinh v t biển và đặc biệt

ở hệ VK cộng sinh với bọt biển với tỷ lệ 22% [7] Nh n định này phù hợp với nghiên cứu của Bewley và CS cho rằng

các chất chuyển hóa của T swinhoei không

có nguồn gốc từ Cyanobacteria hay tế bào của bọt biển [8]

Tiếp t c so sánh những trình tự

nucleotid này với trình tự ftsZ tìm thấy

trên fosmid pTSSH2 bằng chương trình

BioEdit - ClustalW Kết quả cho thấy 5

trình tự này tương đồng nhau và tương

đồng với trình tự ftsZ của pTSSH2 với tỷ

lệ khá cao (≥ 96%), tuy nhiên không có

trình tự nào giống nhau hoàn toàn (bảng

1) Kết quả trên đã chứng minh sự tồn tại

của các biến thể ftsZ trong hệ gen toàn

phần T swinhoei Đi u này giúp giải thích

hiện tượng từ T swinhoei có nhi u hợp

chất onnamide và m i hợp chất do những

VK khác nhau sản xuất

Bảng 4: So sánh các trình tự ftsZ

Trình

Trình

Tỷ lệ tương đồng (%)

1

1

1

1

1

2

2

2

2

3

3

3

4

4

5

pTA1-1

pTA1-1

pTA1-1

pTA1-1

pTA1-1

pTA1-2

pTA1-2

pTA1-2

pTA1-2

pTA1-3

pTA1-3

pTA1-3

pTA1-4

pTA1-4

pTA1-5

2

3

4

5

6

3

4

5

6

4

5

6

5

6

6

pTA1-2 pTA1-3 pTA1-4 pTA1-5 FtsZ của pTSSH2 pTA1-3 pTA1-4 pTA1-5 FtsZ của pTSSH2 pTA1-4 pTA1-5 FtsZ của pTSSH2 pTA1-5 FtsZ của pTSSH2 FtsZ củapTSSH2

96

97

96

96

98

97

97

96

97

97

97

97

96

96

96

Kết quả phân tích trên tiếp t c cho

thấy thêm một khác biệt, đó là VK

kiến ba khoang P fulcipes và VK Chloroflexi

sản xuất onnamide từ bọt biển T swinhoei

Mặc dù pederin và onnamide có công thức hóa học tương tự nhau, nhưng VK sản xuất chúng lại thuộc hai ngành hoàn toàn khác nhau, Chloroflexi và Proteobacteria Đây có thể do hiện tượng chuyển gen ngang (Horizontal gene transfer - HGT) Trong tự nhiên, HGT thường xảy ra để truy n v t liệu di truy n giữa VK, ngay cả khi VK không thuộc cùng một chi Nhờ

v y, VK tăng khả năng thích nghi với đi u kiện môi trường sống thay đổi và di truy n tính trạng qua các thế hệ

KẾT LUẬN

Ngoài các gen onn mã hóa onnamide,

nhi u gen không mã hóa cho các PKS cũng đã được phân l p từ hệ gen toàn

phần của T swinhoe Trong số đó, ftsZ

mã hóa protein tubulin - like là một gen ứng viên ti m năng để nghiên cứu v v t chủ sản xuất onnamide do chúng có trình

tự bảo tồn cao giữa các VK Theo phân

tích này, v t chủ của ftsZ, cũng là v t

chủ sản xuất onnamide, thuộc ngành Chloroflexi Hơn nữa, việc phát hiện được nhi u biến thể của gen ftsZ từ VK khác nhau thuộc ngành Chloroflexi từ hệ gen

toàn phần của T swinhoei cũng là bằng

chứng củng cố cho giả thuyết có nhi u chủng VK khác nhau chịu trách nhiệm sản xuất onnamide So sánh hai hệ thống sản xuất PKS có cấu trúc tương tự nhau - nhóm gen mã hóa pederin và nhóm gen

mã hóa onnamide cho thấy chúng có nguồn gốc từ hai ngành VK hoàn toàn khác nhau, Proteobacteria cộng sinh với

loài kiến ba khoang P fuscipes và

Chloroflexi cộng sinh với loài bọt biển

T swinhoei

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Haygood MG, Schmidt EW, Davidson

SK, Faulkner DJ Microbial symbionts of marine

invertebrates: Opportunities for microbial

biotechnology J Mol Microbiol Biotechnol

1999, 1 (1), pp.33-43

2 Taylor MW, Radax R, Steger D, Wagner

M Sponge-associated microorganisms: Evolution,

ecology, and biotechnological potential Microbiol

Mol Biol Rev 2007, 71 (2), pp.295-347

3 Piel J, Hui D, Wen G, Butzke D, Platzer M,

Fusetani N et al Antitumor polyketide biosynthesis

by anuncultivatedbacterial symbiont of the

marine sponge Theonella swinhoei Proc Natl

Acad Sci USA 2004, 101, pp.16222-16227

4 Lee KH, Nishimura S, Matsunaga S,

Fusetani N, Horinouchi S, Yoshida M

Inhibition of protein synthesis and activation of stress-activated protein kinases by onnamide

A and theopederin B, antitumor marine natural products Cancer Sci 2005, 96 (6), pp.357-364

5 Corton JC, Ward JE Jr Lutkenhaus J

Analysis of cell division gene ftsZ (sulB) from Gram-negative and Gram-positive bacteria

J Bacteriol 1987, 169, p.1-7

6 Bacteriologists: Webster's Quotations, Facts and Phrases, ed I.G International 2008: ICON Group International, Inc

7 Proksch P, Muller WE G Frontier in

marine biotechnology Horizonbioscience 2006

8 Bewley CA, Holland ND, Faulkner DJ

Two classes of metabolites from Theonella swinhoei are localized in distinct populations

of bacterial symbionts Experientia 1996, 52 (7), pp.716-722.