Ứng dụng kỹ thuật FISH (fluorescent in situ hybridization) trong chẩn đoán đột biến gen elastin gây hội chứng williams‐beuren

Bài viết có nội dung trình bày về: Ứng dụng kỹ thuật FISH (fluorescent in situ hybridization) trong chẩn đoán đột biến gen elastin gây hội chứng williams‐beuren. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.

HYBRIDIZATION) TRONG CHẨN ĐOÁN ĐỘT BIẾN GEN ELASTIN  

GÂY HỘI CHỨNG WILLIAMS‐BEUREN  

 Nguyễn Thị Băng Sương *  

TÓM TẮT

Mở đầu: Hội chứng Williams‐Beuren (WBS) là bệnh di truyền trội do đột biến mất đoạn gen Elastin nằm ở 

locus 7q11.23 trên trên nhiễm sắc thể số 7. Hội chứng gây ra nhiều tổn thương, đặc biệt là ở hệ tim mạch. Chẩn  đoán xác định bệnh có ý nghĩa quan trọng trong tiên lượng các dị tật cũng như định hướng điều trị cho bệnh  nhân. Ở Việt Nam, việc ứng dụng phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán xác định WBS còn rất hạn  chế. 

Mục tiêu: Chẩn đoán đột biến gene elastin (ELN) gây hội chứng Williams bằng kỹ thuật FISH. 

Đối  tượng  và  phương  pháp  nghiên  cứu: Những bệnh nhân được chẩn đoán Williams‐Beuren trên lâm 

sàng với vẻ mặt điển hình và các tổn thương tim mạch đặc hiệu cũng như đã có kết quả dương tính với phản  ứng MLPA. Tiến hành kỹ thuật FISH để xây dựng quy trình.   

Kết quả: Tất cả các bệnh nhân đều dương tính với phản ứng FISH.  

Kết luận: Như vậy kỹ thuật FISH là phương pháp sinh học phân tử có thể ứng dụng trong chẩn đoán xác 

định WBS ở Việt Nam. 

Từ khóa: 7q11.23, FISH, MLPA, vi mất đoạn, Williams‐Beuren. 

ABSTRACT 

APPLICATION OF FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION FOR DIAGNOSIS OF MUTATIONS 

IN ELASTIN GENE WHICH CAUSE WILLIAMS‐BEUREN SYNDROME 

Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 4 ‐ 2013: 24 ‐ 28 

Introduction: Williams‐Beuren syndrome (WBS) is the dominant genetic disease caused by a mutation in 

Elastin  gene  which  locates  in  7q11.23  of  region  on  chromosome  7.  Most  of  mutations  is  deletion.  Syndrome  caused many injuries, especially in the cardiovascular system. In many countries, FISH has been used for genetic  diagnosis of William‐Beuren syndrome. 

Objectives: Diagnosis of mutations in Elastin gene by fluorescent in situ hybridization technique.  

Patients  and  methods:  Five  patients  were  diagnosed  William‐Beuren  based  on  clinical  and  subclinical 

diagnostic results. In addition, DNA of all these patients were analysed by multiplex ligation‐dependent probe  applification technique and we found that their Elastin gene were deleted. Design FISH procedure to diagnose  William‐Beuren syndrome. 

Results: All five patients were positive with FISH reaction, their Elastin gene showed mutations. 

Conclusions: We have successfully applied the FISH technique for the diagnosis of William-Beuren

syndrome

Keywords: 7q11.23, FISH, MLPA, deletion, Williams‐Beuren. 

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự  mất  đoạn  có  kích  thước  từ  1,55  đến 

1,85Mb  trên  nhiễm  sắc  thể  số  7,  liên  quan  đến  26‐28  gene,  được  cho  là  nguyên  nhân  gây  nên 

hội  chứng  Williams‐Beuren  (WBS,  Williams‐

Beuren  syndrome).  Ước  tính  trên  thế  giới  tỷ  lệ 

mắc  bệnh  là  1/10000  ca  sinh,  trong  đó  sự  mất 

đoạn 1,55Mb chiếm phần lớn. Gen Elastin, nằm 

giữa  vùng  mất  đoạn,  có  vai  trò  rất  quan  trọng 

trong chức năng của cơ thể. Sự đột biến làm mất 

đi gene này gây ra các dị tật đặc trưng nhất của 

hội  chứng  Williams‐Beuren  như  hẹp  trên  van 

động  mạch  chủ,  hẹp  động  mạch  phổi  ngoại  vi 

hay bất thường của động mạch nuôi cơ(2,12,13). 

Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về đột 

biến gene gây nên hội chứng WBS và phát triển 

các  phương  pháp  chẩn  đoán  sinh  học  phân  tử 

khác  nhau,  mỗi  phương  pháp  có  các  ưu  nhược 

điểm khác nhau(6,10,12).  

Ở  Việt  Nam,  những  nghiên  cứu  trên  hội 

chứng  WBS  vẫn  còn  hạn  chế.  Hiện  nay  tại  các 

trung  tâm  phẫu  thuật  tim  mạch  trong  cả  nước 

nói  chung  và  tại  thành  phố  Hồ  Chí  Minh  nói 

riêng,  bệnh  nhân  được  chẩn  đoán  hội  chứng 

Williams chỉ dựa vào các đặc điểm hình thể đặc 

trưng, nhất là khuôn mặt gợi ý, tính cách cởi mở 

và  đặc  biệt  là  tổn  thương  hẹp  trên  van  động 

mạch  chủ  và/hoặc  hẹp  động  mạch  phổi  chứ 

chưa có chẩn đoán phân tử chính xác. Mặc khác, 

những  trẻ  em  mắc  hội  chứng  Williams  nhưng 

không có biểu hiện tim mạch thì hầu như bị bỏ 

sót  chẩn  đoán.  Việc  chẩn  đoán  chính  xác  hội 

chứng  Williams  bằng  phương  pháp  sinh  học 

phân  tử  sẽ  giúp  nâng  cao  khả  năng  phát  hiện 

bệnh cũng như thiết lập cơ sở cho việc theo dõi 

lâu dài cũng như có những biện pháp tư vấn, hỗ 

trợ thích hợp. 

Tiêu  chuẩn  vàng  giúp  chẩn  đoán  bệnh  là 

phân  tích  phát  hiện  đột  biến  gen,  trong  đó  đột 

biến  gen  Elastin  là  nguyên  nhân  chủ  yếu  gây 

bệnh(11). Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã ứng 

dụng thành công quy trình chẩn đoán đột biến 

mất đoạn gen Elastin bằng kỹ thuật MLPA. Tuy 

nhiên một số tác giả cho rằng kỹ thuật FISH có 

giá trị đặc hiệu cao trong xác định đột biến gen 

Elastin.  FISH  là  một  kỹ  thuật  phân  tích  nhiễm 

sắc thể sử dụng các probe gene elastin chuẩn bị 

sẵn. Nếu một bệnh nhân có hai copy ELN (mỗi 

copy nằm trên một nhiễm sắc thể số 7) thì người  này  không  mắc  hội  chứng  Williams.  Nếu  một  người chỉ có một copy ELN thì được chẩn đoán  mắc  hội  chứng  này.  Gần  như  tất  cả  (98‐99%)  bệnh nhân mắc hội chứng Williams có mất đoạn  gene ELN cùng với 26 gene khác(4). 

Một khi tuổi thọ bệnh nhân mắc  hội  chứng  Williams được tăng lên thì khả năng kết hôn và  sinh  con  có  thể  xảy  ra.  Trong  trường  hợp  này  chẩn đoán xác định bằng phương pháp phân tủ 

sẽ  tạo  điều  kiện  cho  tư  vấn  di  truyền  và  chẩn  đoán  trước  sinh.  Xuất  phát  từ  nhu  cầu  thực  tế 

trên,  chúng  tôi  tiến  hành  đề  tài  “Ứng  dụng  kỹ 

thuật  FISH  (Fluorescence  In  Situ  Hybridization)  trong chẩn đoán đột biến gene elastin (ELN) gây hội  chứng Williams” 

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP  Đối tượng nghiên cứu 

Nhóm chứng 

10  nam  và  10  nữ  bình  thường,  tiền  sử  gia  đình không có ai mắc bệnh di truyền. 

Nhóm nghiên cứu 

5  bệnh  nhân  (2  nam  và  3  nữ)  được  chẩn  đoán mắc phải hội chứng Williams‐Beuren dựa  vào  các  triệu  chứng  lâm  sàng,  cận  lâm  sàng  và 

đã  được  xác  định  có  đột  biến  mất  đoạn  gen  Elastin bằng kỹ thuật MLPA. 

Phương pháp nghiên cứu 

Lấy mẫu xét nghiệm 

Lấy 5 ml máu ngoại biên trong ống nắp xanh 

lá cây chứa heparin. Tiến hành ly tâm thu bạch  cầu,  trữ  trong  dung  dịch  fixative  (3  methanol:1  acid acetic)  

Tiến hành kỹ thuật FISH  

Quy trình FISH được thực hiện theo hướng  dẫn của kit Vysis (Abbott). Theo đó các mẫu dò 

và mẫu được biến tính ở 73oC trong 5 phút và lai  qua  đêm  ở  37oC.  Sau  bước  rửa,  DAPI  được  sử  dụng như màu nền. Mẫu sẽ được quan sát dưới  kính hiển vi huỳnh quang Leika DM2000. Hiện  nay,  theo  hãng  sản  xuất,  các  probe  và  màu 

cam)/ LSI D7S486, D7S522 (màu xanh lá).  

Xử lý mẫu 

Nhược  trương  tế  bào  bằng  dung  dịch  KCL 

0,56%. 

Cố định tế bào bằng dung dịch Carnoy. 

Nhỏ  cặn  tế  bào  lên  lam  kính  sạch  đã  đánh 

dấu sẵn vùng lai. 

Biến  tính  DNA  đích  bằng  dung  dịch  biến 

tính Formamide 70%/2X SSC. 

Khử dung dịch biến tính bằng cồn 70%, 85%, 

100%. 

Tiến hành phản ứng lai giữa DNA dò với DNA 

đích và rửa sau lai 

Nhỏ 3 μl DNA dò lên vùng vừa lai đã được 

đánh dấu. 

Đậy  lá  kính  mỏng  lên  vùng  vừa  lai  và  dán 

viền xung quanh bằng dung kịch keo. 

Ủ tiêu bản ở 37°C qua đêm. 

Bỏ lá kính mỏng và lớp keo dán ra khỏi tiêu 

bản. 

Lần  lượt  rửa  tiêu  bản  trong  hai  dung  dịch 

rửa Formamide 50%/4X SSC và 2X SSC. 

Rửa sạch bằng dung dịch PBS pH7,4. 

Nhuộm, quan sát và phân tích tiêu bản 

Nhỏ  10  μl  thuốc  nhuộm  DAPI  lên  vùng  lai 

trên tiêu bản. Rửa bằng dung dịch PBS pH 7,4. 

Nhỏ  dung  dịch  DABCO  chống  bay  màu 

thuốc thuộm lên vùng lai, đậy lá kính mỏng lên 

và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. 

Đánh giá, phân tích kết quả lai theo chỉ dẫn 

của hãng sản xuất. 

KẾT QUẢ 

Nhóm  chứng  thực  hiện  phản  ứng  FISH 

đồng thời với mẫu bệnh nhân nhằm để so sánh. 

Trong đó nhóm chứng sẽ cho kết quả có 2 vị trí 

phát tín hiệu huỳnh quang màu cam và 2 vị trí 

phát  tín  hiệu  huỳnh  quang  màu  xanh  lá  (Hình 

1A).  Kết  quả  phản  ứng  FISH  của  5  bệnh  nhân 

dưới dạng hình ảnh được trình bày ở hình 1B.  

Hình 1: Kết quả FISH. A: Người bình thường, có hai 

huỳnh quang màu xanh và hai huỳnh quang màu đỏ;  B: Bệnh nhân bị đột biến mất đoạn gây hội chứng  Williams‐Beuren, chỉ xuất hiện hai huỳnh quang  màu xanh và một huỳnh quang màu đỏ. 

BÀN LUẬN 

Từ khi FISH ra đời, kỹ thuật này được ứng  dụng cho chẩn đoán các bệnh liên quan đến rối  loạn  nhiễm  sắc  thể.  So  sánh  với  các  phương  pháp ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử khác  như  real‐time  PCR,  microsatellite,  FISH  vẫn  là  tiêu chuẩn vàng được các phòng xét nghiệm trên  thế  giới  sử  dụng  làm  cơ  sở  để  kiểm  chứng  kết  quả.  Mặc  dù  FISH  là  một  phương  pháp  tốn  nhiều  công  lao  động,  đòi  hỏi  thời  gian  và  sự  tỉ 

mỉ, không thể tự động hóa được. Thêm vào đó,  các hóa chất sử dụng cho FISH cũng rất độc hại. 

biệt  là  đối  với  các  dạng  đột  biến  mất  đoạn  dài 

trên nhiễm sắc thể như ở hội chứng WBS(6,10). 

Một kỹ thuật khác cũng được  phát  triển  để 

chuẩn  đoán  WBS  là  real‐time  PCR  (hay  QPCR, 

PCR  định  lượng).  Đây  cũng  được  coi  là  một 

chiến lượng hay vì nguyên tắc không quá phức 

tạp,  thao  tác  cũng  đơn  giản  có  thể  tự  động 

hóa(7,14).  Tuy  nhiên,  thực  hiện  kỹ  thuật  này  cần 

thiết bị hiện đại, quá trình chuẩn hóa và thiết kế 

gặp nhiều khó khăn về kỹ thuật đặc biệt là trình 

tự  đặc  trưng.  Bên  cạnh  đó  số  lượng  phản  ứng 

cần  thiết  cho  một  xét  nghiệm  (thường  phải  sử 

dụng nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều vùng 

mục  tiêu  trên  vùng  Williams‐Beuren)  làm  cho 

giá thành của phương pháp này có thể tăng cao. 

Phương pháp sử dụng microsatellite cho độ 

nhạy khá cao cũng như có thể phán đoán được 

kích thước của trình tự bị mất và giá thành rẻ(5). 

Tuy  nhiên  phương  pháp  này  lại  có  thể  cho  kết 

quả âm tính giả do chỉ kiểm tra gián tiếp sự tồn 

tại của vùng gene mục tiêu. Vì vậy có thể bỏ sót 

một số trường hợp. 

Trong  nghiên  cứu,  chúng  tôi  đã  ứng  dụng 

thành công kỹ thuật FISH trong chẩn đoán WBS. 

Kết  quả  của  chúng  tôi  thu  được  cho  thấy  các 

bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng rất đặc trưng, 

cũng  như  đã  dương  tính  với  phản  ứng  MLPA  

đều  cho  kết  quả  có  đột  biến  mất  đoạn  gen 

Elastin.  Cả  5  bệnh  nhân  tham  gia  vào  nghiên 

cứu  đều  cho  kết  quả  giống  nhau  với  mất  đoạn 

gen Elastin trên một allen, đây là dạng mất đoạn 

điển hình ở các bệnh nhân WBS. Bệnh di truyền 

trội  trên  nhiễm  sắc  thể  thường  nên  chỉ  cần  đột 

biến  trên  1  allele  đã  biểu  hiện  kiểu  hình  đặc 

trưng  của  hội  chứng  WBS.  Điều  này  phù  hợp 

với các nghiên cứu của Bayes M và Dutra RL(0, 4).  

 Kết quả FISH đối với bố và mẹ của hai bệnh 

nhân  trong  số  5  bệnh  nhân  được  khảo  sát  cho 

kết quả âm tính (không được hiển thị), ở cả hai 

gia  đình,  người  bố  và  mẹ  đều  là  người  bình 

thường  không  mang  gen  bệnh.  Như  vậy  đột 

biến  ở  bệnh  nhân  là  đột  biến  tự  phát  sinh  chứ 

không  phải  do  di  truyền  từ  bố  hoặc  mẹ.  Điều 

này  cũng  hoàn  toàn  hợp  lý  với  cơ  chế  gây  ra  WBS, do sự sai hỏng trong quá trình tái tổ hợp  tương  đồng  ở  quá  trình  giảm  phân  tạo  giao 

tử(18,12). Tuy nhiên khi những người mắc phải hội  chứng này lớn lên, lập gia đình thì khả năng gây  bệnh cho  người  con  là  50%(11).  Do  vậy  cần  phải  chẩn đoán hội chứng WBS để có hướng điều trị  hợp lý, tránh xảy ra trường hợp đột tử do nguy 

cơ  tim  mạch,  cũng  như  giúp  quản  lý  sự  lan  truyền gen bệnh trong cộng đồng. 

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Từ những bàn luận ở trên chúng tôi kết luận  rằng  FISH  là  một  phương  pháp  cần  được  sử  dụng làm nền tảng cho các phương pháp khác ở  các  phòng  thí  nghiệm,  phù  hợp  với  điều  kiện  của  Việt  Nam  trong  chẩn  đoán  các  bệnh  di  truyền  nói  chung  và  bệnh  Williams‐Beuren  nói  riêng.  

Vì  những  nghiên  cứu  WBS  trên  quần  thể  người  Việt  Nam  là  chưa  rộng  rãi  nhưng  lại  rất  cần thiết, chúng tôi đề nghị cần có những nghiên  cứu  lớn  hơn,  trong  đó  sử  dụng  phương  pháp  FISH đề khảo sát là rất phù hợp. 

TÀI LIỆU THAM KHẢO  

(2003). Mutational mechanisms of Williams‐Beuren syndrome 

deletions. Am J Hum Genet, 73: 131‐51. 

syndrome: a genetic deletion disorder presenting clues to the 

hypersociability. CNS Spectr, 12: 903‐7. 

Jehee FS, Bertola DR, Kim CA (2012). Copy number variation 

in Williams‐Beuren syndrome: suitable diagnostic strategy for  developing countries. BMC Res Notes, 5, 13. 

Kim CA (2011). Detection of deletions at 7q11.23 in Williams‐ Beuren  syndrome  by  polymorphic  markers.  Clinics  (Sao  Paulo), 66: 959‐64. 

manifestations in 75 patients with Williams syndrome. J Med  Genet, 39: 554‐8. 

S,  Choudhury  U,  Bottani  A,  Antonarakis  SE,  Fryssira  H,  Dallapiccola  B,  Reymond  A  (2006).  Two  high  throughput  technologies  to  detect  segmental  aneuploidies  identify  new  Williams‐Beuren syndrome patients with atypical deletions. J  Med Genet, 43: 266‐73. 

8 Kozlowski  P,  Jasinska  AJ,  Kwiatkowski  DJ  (2008).  New 

applications  and  developments  in  the  use  of  multiplex 

ligation‐dependent  probe  amplification.  Electrophoresis,  29: 

4627‐36. 

Leonard  CO,  Carey  JC,  Keating  M,  Brothman  AR  (1995). 

Strong correlation of elastin deletions, detected by FISH, with 

Williams  syndrome:  evaluation  of  235  patients.  Am  J  Hum 

Genet, 57: 49‐53. 

number  variants  at  Williams‐Beuren  syndrome  7q11.23 

region. Hum Genet, 128: 3‐26. 

(2005).  Autosomal  dominant  inheritance  of  Williams‐Beuren 

syndrome  in  a  father  and  son  with  haploinsufficiency  for 

FKBP6. Clin Dysmorphol, 14: 61‐5. 

362: 239‐52. 

treatment  of  cardiovascular  disease  in  Williams‐Beuren  syndrome. J Clin Invest, 118: 1606‐15. 

determination  of  deletion  size  using  quantitative  real‐time  PCR. Int J Mol Med, 18: 799‐806.