Nghiên cứu với mục tiêu nhằm mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất thường về di truyền tế bào trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho người lớn trước và sau điều trị. Nghiên cứu thực hiện bệnh nhân chẩn đoán bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) người lớn từ 12/2009 đến 08/2012 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM.
Trang 1VÀ SAU ĐIỀU TRỊ BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO
NGƯỜI LỚN
Huỳnh Văn Mẫn*, Phan Thị Xinh*, Nguyễn Phương Liên*, Nguyễn Hà Thanh**, Nguyễn Tấn Bỉnh*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất thường về di truyền tế bào trong bệnh bạch cầu cấp dòng lympho người lớn trước và sau điều trị.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: bệnh nhân chẩn đoán bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL)
người lớn từ 12/2009 đến 08/2012 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP HCM có làm các xét nghiệm miễn dịch và di truyền trước và sau điều trị; phương pháp mô tả loạt ca.
Kết quả: 28 bệnh nhân có làm đầy đủ các xét nghiệm miễn dịch và di truyền trước và sau điều trị, tỷ lệ
BBCDL T là 32%, tỷ lệ BBCDL B là 68%, tỷ lệ BBCDL Ph+ là 32%. Tỷ lệ chuyển vị t(4;11) và hoặc MLL‐ AF4+ là 11%, t(1;19) và hoặc E2A‐PBX1+ là 0%, t(12;21) và hoặc TEL/AML+là 0%. Sau điều trị, nhóm Ph+: 5 bệnh nhân cả FISH và RT‐PCR đều âm tính, 2 bệnh nhân FISH âm nhưng RT‐PCR còn dương yếu, 2 bệnh nhân chưa đánh giá sau điều trị; nhóm Ph‐: Tồn lưu tế bào ác tính sau giai đoạn tấn công (MRD‐ minimal residual disease): 0,003%‐1.014% tùy vào loại LAP (leukemic associated phenotyping). Ba bệnh nhân có MLL‐ AF4+ được xét nghiệm lại RT‐ PCR sau điều trị cho kết quả âm tính 2 bệnh nhân.
Kết luận: Nghiên cứu bước đầu cho thấy kỹ thuật miễn dịch và di truyền giúp ích nhiều cho quá trình chẩn
đoán, phân loại và theo dõi điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.
Từ khóa: kỹ thuật miễn dịch, di truyền tế bào
ABSTRACT
IMMUNOPHENOTYPING AND GENETIC FEATURES BEFORE AND AFTER TREATMENT
ADULTS ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA
Huynh Van Man, Phan Thi Xinh, Nguyen Phuong Lien, Nguyen Ha Thanh, Nguyen Tan Binh
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 132 ‐ 136
Objective: The description of immunophenotyping and genetic abnormalities in the adult acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients before and after treatment.
Subjects and Methods: Patients diagnosed with adult ALL from 12/2009 to 08/2012 at the Blood
Transfusion and Hematology Hospital of HCMC have to do tests mmunophenotyping and genetic before and after treatment; method described case series.
Results: 28 patients have made full immunophenotyping and genetics before and after treatment, the proportion of T‐ ALL was 32%, the proportion of B‐ALL was 68%, the proportion of Ph + ALL was 32%. The rate of t (4; 11) and or MLL‐AF4 + was 11%, t (1; 19) and or E2A‐PBX1 + was 0%, t (12; 21) and or
TEL‐ AML + was 0%. After treatment, the Ph + group: 5 patients both FISH and RT‐PCR were negative, 2 patients with negative FISH, RT‐PCR weak positive, 2 patients have not evaluated; Ph‐
Trang 2groups: MRD (minimal residual disease) after the induction phase: 0, 003% ‐1,014% depending on the type of LAP (leukemic associated phenotyping); Three patients with MLL‐AF4 + after treatment gave negative results for 2 cases.
Conclusion: The study initially showed immunophenotyping and genetics much help for the diagnosis, classification and monitoring the treatment of ALL.
Keywords: immunophenotyping, genetic
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) là một
rối loạn ác tính của tế bào đầu dòng lympho B
và T. Cũng giống như các bệnh máu ác tính
khác, khảo sát những bất thường nhiễm sắc thể
(NST), gen và dấu ấn miễn dịch tại thời điểm
chẩn đoán rất quan trọng cho phân loại dòng,
phân nhóm tiên lượng, giúp lựa chọn phác đồ
điều trị thích hợp và là dấu ấn để theo dõi tồn
lưu tế bào ác tính trong quá trình điều trị (4). Tại
Bệnh viện truyền máu ‐ huyết học TP HCM,
chúng tôi tiến hành khảo sát các bất thường
nhiễm sắc thể và gen bằng phương pháp FISH
(Fluorescence in situ hybridization) và RT‐PCR
(Reverse transcription polymerase chain
reaction), đặt biệt là nhiễm sắc thể Philadelphia
(Ph+) trong BCCDL B để chọn phác đồ điều trị
và theo dõi điều trị. Đối với trường hợp BCCDL
B Ph‐ và BCCDL T thì chúng tôi theo dõi bằng
kỹ thuật tế bào dòng chảy (Flow cytometry‐
FCM).
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát
Mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch, bất
thường về di truyền tế bào trong bệnh BCCDL
người lớn trước và sau điều trị.
‐Mục tiêu cụ thể
+ Mô tả đặc điểm dấu ấn miễn dịch bệnh
BCCDL người lớn trước và sau điều trị trong
nhóm nghiên cứu.
+ Mô tả đặc điểm bất thường về di truyền tế
bào trong BCCDL người lớn trước và sau điều
trị trong nhóm nghiên cứu.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu
Mô tả loạt ca.
Đối tượng nghiên cứu
+ Tiêu chuẩn chọn bệnh
Bệnh nhân được chẩn đoán BCCDL người lớn từ 09/2009 đến 07/2012 tại BV TMHH TP HCM thỏa các tiêu chuẩn:
‐ Có làm các xét nghiệm dấu ấn miễn dịch, sinh học phân tử
‐ Điều trị đặc hiệu theo phác đồ GRAALL
2005
+ Tiêu chuẩn loại trừ
‐ Không điều trị đặc hiệu theo phác đồ GRAALL 2005
‐ Không làm các xét nghiệm dấu ấn miễn dịch, sinh học phân tử
Phương pháp nghiên cứu
Thu thập số liệu dựa vào hồ sơ bệnh án
trước và sau điều trị.
Tiêu chuẩn đánh giá
đánh giá lui bệnh dựa vào tiêu chuẩn của Hiệp hội chống ung thư quốc tế –UICC/WHO bằng lâm sàng, huyết‐tủy đồ, xét nghiệm nhiễm sắc thể (FISH), và RT‐PCR, xét nghiệm tồn lưu tế bào ác tính bằng kỷ thuật tế bào dòng chảy.
Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm vi sinh SPSS 16.0 FOR WINDOW để xử lý và phân tích số liệu, với độ tin cậy 95%, ngưỡng P = 0.05 được chọn có ý nghĩa thống kê.
Trang 3Tổng cộng 28 bệnh nhân, tuổi bệnh nhân
trong nhóm nghiên cứu từ 17‐59, trung bình 36
tuổi. Tỷ lệ nam: nữ là 1:1.
Đặc điểm FISH và RT‐PCR
‐ Có 9 bệnh nhân (32%) có nhiễm sắc thể
Philadelphia (+), RT‐PCR cho kết quả 6 bệnh
nhân biểu hiện Minor BCR‐ABL (e1a2), 2 bệnh
nhân biểu hiện Major BCR‐ABL (b3a2), 1 bệnh
nhân biểu hiện cả Major BCR‐ABL (b2a2) và
Minor BCR‐ABL (e1a2).
‐ 3 bệnh nhân (11%) có t (4;11), một bệnh
nhân đa bội, một bệnh nhân có 3 NST 21, một
bệnh nhân có 4 NST12 và 4 NST 21.
‐ 13 bệnh nhân còn lại chưa phát hiện bất
thường.
Bảng 1: kết quả sinh học phân tử
Mã
bệnh
nhân
Giới Tuổi Kết quả lúc chẩn đoán Kết quả sau
điều trị FISH RT-PCR:
BCR-ABL
RT-PCR
BN 1 Nam 35 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-)
BN 2 Nam 55 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-)
BN 3 Nữ 21 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-)
BN 4 Nữ 49 Ph+ Major (b3a2) Ph- (+) yếu
BN 5 Nữ 25 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-)
BN 6 Nữ 41 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (+) yếu
BN 7 Nữ 28 Ph+ Minor (e1a2) Ph- (-)
BN 8 Nam 54 Ph+ Major (b3a2) Chưa làm
BN 9 Nam 58 Ph+ Major và
Minor (e1a2 và b2a2)
Chưa làm
BN 10 Nữ 51 3 NST 21
(12,5%) (-) Tử vong
BN 11 Nữ 42 t (4;11) MLL-AF4 (+) (-) (-)
BN 12 Nam 41 4NST
12,21
Chưa làm
BN 13 Nữ 36 t (4;11) MLL-AF4 (+) (-) (-)
BN 14 Nữ 54 t (4;11) MLL-AF4 (+) (-) (+)
BN 15 Nam 19 Đa bội Chưa làm
Đặc điểm dấu ấn miễn dịch
Bảng 2: kết quả dấu ấn miễn dịch
Mã bệnh
nhân
chẩn đoán
Kết quả sau điều trị (MRD)
Mã bệnh nhân
Giới Tuổi Kết quả lúc
chẩn đoán
Kết quả sau điều trị (MRD)
BN 3 Nữ 21 Pre-B/ CD 33+ Không làm
BN 4 Nữ 49 Common B Không làm
BN 5 Nữ 25 Common B Không làm
BN 6 Nữ 41 Common B Không làm
BN 7 Nữ 28 Common B Không làm
BN 8 Nam 54 Common B Không làm
BN 9 Nam 58 Common B Không làm
BN 10 Nữ 51 Pro-B Tử vong sau tấn
công
BN 11 Nữ 42 Pro-B 0.002% 0.010
%
BN 12 Nam 41 Common B 0.005% 0.038%
BN 13 Nữ 36 Mature B Tử vong sau tấn
công
BN 14 Nữ 54 Mature
B/CD13+ 0,013 1,42%
BN 15 Nam 19 Common B 0,007 0,026%
BN 16 Nam 33 Pre-T 0,001 0,002%
BN 17 Nam 34 Common T 0,001 0,005%
BN 18 Nữ 32 Pre-T 0,002 0,031%
BN 19 Nam 29 Common T 0,003 0,042%
BN 20 Nam 17 Common T 0.002% 0.024%
BN 21 Nữ 24 Common B 0.014% 0.59%
BN 22 Nam 23 Common T 0.005% 0.024
%
BN 23 Nam 24 Common T 0.003% 0.016%
BN 24 Nữ 23 Common B 0,004 0,041%
BN 25 Nam 47 Early T 0% 0.003%
BN 26 Nữ 59 Common T 0.045% 1.014%
BN 27 Nữ 37 Common B Chưa làm
BN 28 Nam 22 Commom B Chưa làm
Bảng 3: phân loại dưới nhóm theo dấu ấn miễn dịch
(DAMD)
Phân lớn bệnh nhân dòng B là Common B
và dòng T là Common T
Bảng 4: Tồn lưu tế bào ác tính dựa vào FCM
nhân N=15
Tỷ lệ
Trang 4≥1% (nguy cơ cao) 2 13,3%
Sau điều trị, tồn lưu tế bào ác (minimal
residue disease – MRD) tính dựa vào FCM chỉ
thực hiện ở bệnh nhân Ph‐ và kết quả chủ yếu ở
nhóm nguy cơ thấp.
BÀN LUẬN
* Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả
bệnh nhân BCCDL B đều làm RT‐PCR 4 tổ hợp
gen: BCR/ABL, E2A/PBX1, MLL/AF4 và
TEL/AML1; FISH 1 trong 4 chuyển đoạn t(9;22),
t(1;19), t(4;11), t(12;21) tương ứng để khẳng định
thêm. Bệnh nhân BCCDL T chúng tôi chưa triển
khai kỹ thuật sinh học phân tử vì những đột
biến ở dòng T tần suất thấp và phức tạp. Về
nhiễm sắc thể đồ, do kỹ thuật chưa hoàn chỉnh
nên nhiều trường hợp cấy không mọc vì vậy
chúng tôi không nêu kết quả ở đây. Kỹ thuật
real time PCR đánh giá sau điều trị chúng tôi
chưa triển khai được.
Tỷ lệ nhiễm sắc thể Ph+ khoảng 32%, tỷ lệ
t(4;11) khoảng 11%, tương đương với các nghiên
cứu khác và y văn(1,2,4). Vì số mẫu còn nhỏ nên
chúng tôi chưa gặp trường hợp nào t (1; 19) và t
(12; 21). Theo y văn tỷ lệ t(9;22) (ph+)
khoảng 25‐30%, t(4;11) khoảng 3‐7%, t (1; 19)
khoảng 2‐3% và t (12; 21) khoảng 0‐3%(8,4).
Tình trạng đa bội và các bất thường khác
chúng tôi chưa khảo sát bằng nhiễm sắc thể
đồ cho tất cả các trường hợp.
Sau điều trị, trong 9 bệnh nhân Ph+: 7 bệnh
nhân lui bệnh hoàn toàn về huyết tủy đồ, nhưng
bảy bệnh nhân FISH âm, 2 bệnh nhân RT‐PCR
còn dương, 2 bệnh nhân chưa hoàn tất điều trị
nên chưa đánh giá, 3 bệnh nhân có t(4;11) dương
cũng lui bệnh hoàn toàn về huyết tủy đồ, có 2
bệnh nhân FISH va RT‐PCR âm, một bệnh nhân
FISH âm, tuy nhiên RT‐PCR còn dương.
* Ứng dụng của kỹ thuật MFC trong việc
phát hiện MRD ở những bệnh nhân bệnh
BCCDL đạt lui bệnh về hình thái nhờ vào việc
xác định những kiểu dấu ấn bất thường được
gọi là những kiểu hình dấu ấn miễn dịch
(DAMD) liên quan đến bệnh bạch cầu gọi tắt là
LAP (Leukemia‐associated phenotypes), chỉ hiện diện trên tế bào bạch cầu ác tính và không hiện diện hoặc hiện diện không thường xuyên trên tế bào tạo máu bình thường. Kỹ thuật MFC cho phép phát hiện 1 tế bào ác tính/10.000 tế bào tuỷ xương bình thường(5,7,6,9).
Dựa vào các phương pháp luận khác nhau, người ta phân loại LAP như sau: kháng nguyên khác dòng (cross‐lineage), sự biểu hiện kháng nguyên không đồng bộ (asynchronous), sự hiện diện quá mức (overexpression), sự vắng mặt một kháng nguyên đặc hiệu của dòng (antigen absent expression), kháng nguyên lạc chỗ (etopic antigen expression), kiểu phát xạ bất thường (aberrant light‐scatter patters)(5,7,6,9).
Theo khảo sát của chúng tôi, tỷ lệ BCCDL B
là 68%, BCCDL T là 32%, và tỷ lệ dưới nhóm tương với các nghiên cứu khác(3,6,9,4).
Sau điều trị, 9 trường hợp Ph+ chúng tôi không khảo sát tồn lưu ác tính bằng tế bào dòng chảy, vì những trường hợp này đã được khảo sát bằng FISH và RT‐PCR. Có 2 trường hợp tử vong trong giai đoạn tấn công. Hai trường hợp chưa hoàn tất điều trị nên chưa khảo sát tồn lưu ác tính.
Có 15 trường hợp được khảo sát tồn lưu ác tính bằng kỷ thuật tế bào dòng chảy cho thấy 20% thuộc nhóm nguy cơ rất thấp, 60% thuộc nhóm nguy cơ thấp, 6,7% thuộc nhóm nguy cơ trung bình, 13,3% thuộc nhóm nguy cơ cao, không khác biệt so với các nghiên cứu khác(5,7,6).
Vì có độ nhạy cao, kỹ thuật PCR vẫn đang là công cụ chính để phát hiện số lượng nhỏ tế bào MRD hiện nay.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu bước đầu cho thấy kỹ thuật miễn dịch và di truyền giúp ích nhiều cho quá trình chẩn đoán, phân loại và theo dõi điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Chúng tôi đề nghị hoàn thiện kỷ thuật nhiễm sắc thể đồ, triển khai kỷ thuật real time PCR và nghiên cứu số mẫu lớn hơn, theo dõi thời gian sống, thời gian tái phát, để hoàn thiện hơn kỹ thuật sinh học
Trang 5tác chẩn đoán và điều trị bệnh bạch cầu cấp
dòng lympho.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
tế bào di truyền ở bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho tại
bệnh viện Bạch Mai”, Y học thực hành (783), số 9/2011, tr 121‐
123.
transcriptase‐polymerase chain reaction strategy for the
diagnostic molecular screening of chimeric genes: a clinical
evaluation on 170 patients with acute lymphoblastic
leukemia”, Haematologica,, 88 (3): 275‐279.
sự (2006), “Ứng dụng phương pháp miễn dịch trong chẩn
đoán phân loại một số thể bệnh của lơ xê mi cấp”, Y học thực
hành, 545, tr 90‐102.
91, 7th Edition, pp1321‐1342.
(2010), “Immaturity associated antigens are lost during
induction for T cell lymphoblastic leukemia: implications for
minimal residual disease detection”, Cytometry B Clin
Cytom, 78 (3): 139‐146.
Porwit‐MacDonald A, Gaipa G, van Wering E, van Dongen JJ (1999), “Immunophenotypical detection of minimal residual disease in acute leukemia”, Crit Rev Oncol Hematol; 32 (3): 175‐185.
Stetler‐Stevenson M (2010), “Minimal residual disease
leukemia/lymphoma”, Am J Clin Pathol, 133 (4): 592‐601.
“Standardized RT‐PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection
of minimal residual disease. Report of the BIOMED‐1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease
in acute leukemia”, Leukemia, 13 (12): 1901‐1928.
Ciudad J, Lucio P, Vazquez L, Garcia‐Sanz R, del Canizo MC, Fernandez‐Calvo J, Ramos F, Rodriguez MJ, Calmuntia MJ, Porwith A, Orfao A, San‐Miguel JF (2003), “Minimal residual disease in adolescent (older than 14 years) and adult acute
evaluation has high clinical value”, Blood, 101 (12): 4695‐4700.
Ngày nhận bài báo: 15 tháng 8 năm 2013 Ngày phản biện: 04 tháng 9 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013