Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu pidotimod tổng hợp tại Việt Nam. Đối tượng và phương pháp: sử dụng trang thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 17025.
Trang 1XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ NGUYÊN LIỆU PIDOTIMOD
TỔNG HỢP TẠI VIỆT NAM
Quách Thị Hà Vân*; Nguyễn Hồng Hải* Nguyễn Hải Nam**; Trần Việt Hùng***
TãM T¾T
Mục tiêu: xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu pidotimod tổng hợp tại Việt Nam Đối tượng và phương pháp: sử dụng trang thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu được hiệu chuẩn theo
ISO/IEC 17025 Phương pháp nghiên cứu theo DĐVN IV Kết quả: đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm nghiệm nguyên liệu pidotimod, bao gồm: chỉ tiêu chất lượng chung cho nguyên liệu làm thuốc (cảm quan, độ trong và màu sắc dung dịch, pH, năng suất quay cực, điểm chảy, hàm lượng nước, giới hạn kim loại nặng) và các chỉ tiêu riêng cho pidotimod
(định tính, định lượng, giới hạn dung môi tồn dư, tạp chất liên quan) Kết luận: tiêu chuẩn kiểm
nghiệm đã xây dựng là cơ sở để kiểm tra chất lượng nguyên liệu đồng thời là tài liệu pháp lý quan trọng trong hồ sơ xin đăng ký sản xuất và phân phối
* Từ khóa: Pidotimod; Tiêu chuẩn cơ sở
Studying the Basic Standards of Pidotimod Synthetic Materials in Vietnam
Summary
Objectives: To construct basic standards pidotimod synthetic materials in Vietnam Subjects and methods: Research using the equipment and chemicals for research were calibrated according
to ISO/IEC 17025 The construction method according to Vietnamese Pharmacopoeia IV criteria Results: Have built basic standards and testing methods pidotimod raw materials, including following criteria: overall quality indicators for drug materials (organoleptic, clarity and color solution,
pH, Yield rotation, melting point, water content, heavy metal limits) and specific targets pidotimod (qualitative, quantitative, residual solvent limits, related substances) Conclusion: Standard tests have built the basis for checking the quality of materials is also an important legal document in the application for registration in production and distribution
* Key words: Pidotimod; Basic standard
ĐẶT VẤN ĐỀ
Pidotimod là thuốc có tác dụng tăng
cường miễn dịch, được tổng hợp từ cuối
những năm 1980 [1] Pidotimod làm tăng 100% tế bào lympho T, tăng 133% tác dụng của tế bào NK trên những đối tượng bị giảm miễn dịch Trên một số người tình nguyện,
* Học viện Quân y
** Trường Đại học Dược Hà Nội
*** Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW
Người phản hồi (Corresponding): Quách Thị Hà Vân (quachhavan@gmail.com)
Ngày nhận bài: 25/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/11/2015
Ngày bài báo được đăng: 04/12/2015
Trang 2pidotimod còn làm tăng số lượng bạch cầu
đa nhân và đại thực bào [2] Tuy nhiên,
cho đến nay, pidotimod chưa được sản xuất
ở trong nước
Trường Đại học Dược Hà Nội đã xây
dựng được quy trình tổng hợp và tinh chế
pidotimod đạt độ tinh khiết trên 98,0% Để
nguyên liệu này được đưa vào sản xuất
nhằm tạo ra các dạng bào chế thích hợp,
có kết quả điều trị và an toàn, chất lượng
của nguyên liệu là vấn đề được quan tâm
hàng đầu Vì vậy, chúng tôi tiến hành xây
dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu pidotimod
tổng hợp tại Việt Nam [3]
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu và thiết bị
* Nguyên liệu:
Pidotimod tổng hợp tại Bộ môn Hóa
dược, Trường Đại học Dược
* Chất chuẩn: pidotimod (chuẩn nhà sản
xuất SICHUAN TONGSHENG AMINO ACID
CO., LTD cung cấp, hàm lượng 99,0%)
* Thiết bị, hóa chất: dùng cho nghiên cứu
đã được hiệu chuẩn theo ISO/IEC 1702
2 Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp định lượng:
- Phương pháp xây dựng quy trình định
lượng:
+ Căn cứ vào điều kiện hiện có của
phòng thí nghiệm và tài liệu tham khảo,
cố định các điều kiện: cột sắc ký: Rp 18 -
5 µm (4,6 x 250 mm), nhiệt độ cột 30 oC,
tốc độ dòng 1,0 ml/phút, detector UV, thể
tích bơm mẫu 20 l
+ Khảo sát các điều kiện sau:
Bước sóng: ghi phổ trong khoảng bước sóng 200 - 500 nm, từ đó xác định bước sóng hấp thụ cực đại
Pha động: dung dịch đệm acetonitril (dung dịch đệm: hòa tan 0,5 g natri heptan-1-sulfonat trong 1.000 ml dung dịch kali dihydo phosphate 0,01M Chỉnh
pH về 1,5 bằng axít phosphoric 85%) Dựa trên tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát hệ pha động khác nhau với tỷ lệ khác nhau của dung môi acetonitril để đảm bảo khả năng phân tách tốt và có thời gian lưu hợp lý nhất trong mẫu phân tích
- Phương pháp thẩm định quy trình định lượng:
Sau khi lựa chọn điều kiện sắc ký, thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn của USP30 với độ đặc hiệu, độ thích hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ đúng,
độ lặp lại, độ chính xác trung gian
Hàm lượng (%) pidotimod tính theo chế phẩm khan được tính theo công thức sau:
a mt
m S
C
) 100 ( 100
Trong đó:
ST ; SC: diện tích của pidotimod trên sắc
ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn
mT ; mC: lượng cân của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg)
C: hàm lượng chuẩn (%)
a: hàm lượng nước trong chế phẩm (%)
* Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn
cơ sở của nguyên liệu pidotimod:
- Phương pháp định tính:
+ Phương pháp phổ hồng ngoại: theo DĐVN IV, phụ lục 4.2 Phổ hồng ngoại
Trang 3của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng
ngoại của pidotimod chuẩn
+ Phương pháp HPLC theo DĐVN IV,
phụ lục 4.1 Dung dịch thử (phần định
lượng) phải cho píc chính có thời gian lưu
tương ứng với thời gian lưu của píc chính
trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
- Tạp chất liên quan:
Phương pháp HPLC (DĐVN IV, phụ
lục 5.3)
+ Điều kiện sắc ký: như phần định lượng
+ Chuẩn bị mẫu: chuẩn bị dung dịch
dung môi pha mẫu, mẫu chuẩn và mẫu
thử tương tự như phần định lượng
+ Tiến hành: tiêm các dung dịch trên
vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký với
thời gian gấp 4 lần thời gian lưu của píc
chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử
+ Yêu cầu: trên sắc ký đồ thu được
của dung dịch thử: diện tích của bất kỳ
píc phụ nào, ngoài píc chính, không được
lớn hơn diện tích píc chính trong sắc ký
đồ thu được của dung dịch đối chiếu (0,5%)
Tổng diện tích các píc, ngoài píc chính,
không được lớn hơn 3 lần diện tích píc
chính trong sắc ký đồ thu được của dung
dịch đối chiếu (1,0%) Bỏ qua píc tương
ứng với mẫu trắng và píc nào có diện
tích nhỏ hơn 0,05 lần diện tích píc chính
trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch
đối chiếu
- Phương pháp xác định giới hạn dung
môi tồn dư:
+ Xác định tồn dư dung môi ethanol và
dicloromethan:
Ethanol: không > 5.000 ppm
Dicloromethan: không > 600 ppm
Phương pháp: thử theo DĐVN IV, phụ lục 10.14, xác định dung môi tồn dư Tiến hành bằng phương pháp sắc ký khí (DĐVN IV, phục lục 5.2) với kỹ thuật tiêm
pha hơi tĩnh (static head-space injection)
+ Xác định tồn dư dung môi triethylamin: Triethylamin: không > 320 ppm
Phương pháp sắc ký khí (DĐVN IV, phụ lục 5.2) với kỹ thuật tiêm pha hơi tĩnh
(static head-space injection)
+ Điều kiện sắc ký:
Cột DB-624 (30 m x 0,53 mm, 3 µm) hoặc cột tương đương
Nhiệt độ cột: 450C trong 5 phút, tăng với tốc độ 80C/phút đến 900C, tiếp tục tăng với tốc độ 200C/phút đến 2000C và giữ ở nhiệt độ này trong 2 phút
Detertor FID: 2500C
Buồng tiêm chia dòng: 2200
C
Tỷ lệ chia dòng 1:5
Khí mang: nitrogen, tốc độ dòng 4,2 ml/phút
+ Điều kiện tiêm hơi pha tĩnh (headspace): Thông số hoạt động: nhiệt độ cân bằng (oC): 80; thời gian cân bằng (phút): 30; nhiệt độ dòng chảy (oC): 110; khí mang: nitrogen; thời gian điều áp (giây): 60; thể tích tiêm (ml): 1
- Chuẩn bị dung dịch:
+ Dung dịch chuẩn: cân 0,100 g triethylamin vào bình định mức 100 ml đã
có sẵn khoảng 10 ml dimethyl sulfoxid, vừa đủ bằng dimethyl sulfoxid đến vạch, lắc kỹ Hút chính xác 2,0 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml, vừa đủ bằng dimethyl sulfoxid đến vạch, lắc đều Hút chính xác 2,0 ml vào lọ headspace
20 ml, nắp kín
Trang 4+ Dung dịch thử: cân 0,250 g chế phẩm
vào vào lọ headspace, thêm chính xác
2,0 ml dimethyl sulfoxid, nắp kín, lắc xoáy
30 giây
- Tiến hành:
Độ ổn định của hệ thống sắc ký: tiêm
1 ml pha hơi của dung dịch chuẩn, độ lệch
chuẩn tương đối của diện tích píc thu được
từ 3 lần tiêm chuẩn, không được lớn hơn
15%
Tiêm riêng biệt 1 ml pha hơi của dung
dịch thử và dung dịch chuẩn theo điều
kiện nêu trên (mỗi dung dịch tiêm 2 lần),
ghi sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích
píc triethylamin
Yêu cầu kết quả: diện tích píc trung bình
của píc tương ứng với píc triethylamin trên
sắc ký đồ của dung dịch thử không được
lớn hơn diện tích píc triethylamin trung
bình trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
- Phương pháp định lượng:
Phương pháp HPLC đã xây dựng ở trên
Các phương pháp xác định về cảm
quan, độ tan, hàm lượng nước, độ trong
và màu sắc dung dịch, pH, điểm chảy,
góc quay cực, kim loại nặng thử theo
DĐVN IV
KÕT QU¶ NGHIªN CøU
1 Kết quả xây dựng quy trình định
lƣợng và thẩm định quy trình định lƣợng
* Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký:
Dựa vào đặc tính của pidotimod, qua
tham khảo tài liệu và khảo sát thực tế,
chúng tôi tiến hành sắc ký theo điều kiện
sau: cột: Rp 18 - 5 µm (4,6 x 250 mm);
detector: 210 nm; tốc độ dòng: 1,0 ml/phút;
thể tích tiêm: 20 µl; nhiệt độ cột: 300
C;
pha động: dung dịch đệm acetonitril (95:5) (dung dịch đệm phosphat: hòa tan 0,5 g natri heptan-1-sulfonat trong 1.000 ml dung dịch kali dihydro phosphat 0,01M Chỉnh pH về 1,5 bằng axít phosphoric 85%)
* Kết quả thẩm định quy trình định lượng:
- Độ đặc hiệu:
+ Trên sắc ký đồ mẫu trắng: không xuất hiện píc nào có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pidotimod trên sắc ký đồ mẫu chuẩn
+ Trên sắc ký đồ mẫu thử: cho một píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pidotimod trên sắc ký đồ mẫu chuẩn Thời gian lưu của pidotimod khoảng 6,9 phút Như vậy, phương pháp có độ đặc hiệu để định lượng nguyên liệu pidotimod
- Độ thích hợp của hệ thống:
Bảng 1: Độ thích hợp hệ thống
(phút)
Diện tich píc (mAu)
Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc: RSD = 0,06 (≤ 2,0%); hệ số đối xứng:
T = 1,14 (≤ 1,5); số đĩa lý thuyết: N = 3.500 (≥ 2.000) Như vậy, hệ thống đạt yêu cầu
để phân tích pidotimod
Trang 5- Độ tuyến tính: khảo sát sự tương quan giữa y (tổng diện tích píc) và x (nồng độ) bằng phương pháp bình phương cực tiểu, kết quả cho thấy hệ số r2 = 0,9993 (→ r = 0,9996), chứng tỏ có sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic (bảng 2, hình 1)
Bảng 2: Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ pidotimod
STT Mẫu Lƣợng cân chuẩn
(mg)
Nồng độ pidotimod (mg/ml)
Diện tích píc (mAu.s)
Hệ số tương quan: 0,9996; hệ số góc: 37972; hệ số chắn (intercept): -117.34; %Y: 1,3%
Hình 1: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc
Trang 6- Độ đúng:
Bảng 3:
Mẫu Lƣợng chuẩn thêm vào
(mg)
Diện tích píc pidotimod
Lƣợng tìm lại (mg) % hồi phục
Tỷ lệ % thu hồi nằm trong khoảng 98,0 - 102,0% và RSD < 2%, phương pháp định lượng pidotimod đạt yêu cầu về độ đúng
- Độ lặp lại:
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
STT Lƣợng cân thử (mg) Diện tích píc (mAU.s) % định lƣợng (theo khan)
Diện tích píc trung bình của mẫu chuẩn 9408,2 (mAu.s) RSD < 2%, chứng tỏ phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ lặp lại
Trang 7- Độ chính xác trung gian:
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian
STT
Kiểm nghiệm viên 1 Lƣợng cân chuẩn: 50,3 mg Diện tích píc trung bình mẫu chuẩn: 9408,2
(mAu.s)
Kiểm nghiệm viên 2 Lƣợng cân chuẩn: 50,5 mg Diện tích píc trung bình mẫu chuẩn: 9425,5
(mAu.s)
Lượng cân thử
(theo khan)
Lượng cân thử (mg)
Diện tích píc
% định lượng (theo khan)
Trung bình: 99,6%
RSD: 0,46%
Trung bình: 99,5%
RSD: 0,34%
Kết quả định lượng trung bình 12 mẫu thử: 99,5%; RSD (n = 12): 0,40%
RSD < 2% (n = 12), chứng tỏ phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ chính xác
trung gian
2 Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu pidotimod
* Tính chất:
Bảng 6: Kết quả xác định tính chất nguyên liệu pidotimod
Độ tan:
+ Nước
+ Dimethyl formamid
+ Ethanol
+ Methanol
Tan Tan Khó tan Khó tan
Tan Tan Khó tan Khó tan
Tan Tan Khó tan Khó tan Như vậy, mức chỉ tiêu đặt ra để xác định tính chất vật lý là: cảm quan: bột kết tinh
màu trắng hoặc trắng ngà Độ tan: tan trong nước và dimethyl formamid, khó tan trong
ethanol và methanol
* Định tính:
- Phương pháp phổ hồng ngoại ở cả 3 lô (313, 413, 513) đều cho kết quả giống
nhau: phổ IR của mẫu thử và chuẩn trùng nhau, cực đại hấp thụ trong phổ của mẫu
thử hoàn toàn tương ứng về vị trí như phổ của chất chuẩn
Trang 8- Phương pháp HPLC ở cả 3 lô (313, 413, 513) đều cho kết quả giống nhau: từ kết quả trong phần định lượng, tại thời gian lưu tR = 7,0 phút, trên sắc ký đồ mẫu thử có
1 píc trùng với pic trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn
* Hàm lượng nước:
Bảng 7: Kết quả xác định hàm lượng nước của nguyên liệu pidotimod
X ± SD = 0,13 ± 0,01 (%) Hàm lượng nước của pidotimod 0,13 ± 0,01% (không quá 0,5%) Từ kết quả trên và dựa vào tính chất pidotimod dễ tan trong nước, chỉ tiêu đưa ra cho tiêu chuẩn hàm lượng nước của pidotimod không quá 0,5%
* Độ trong và màu sắc dung dịch:
Tiến hành đánh giá trên 3 lô sản xuất đều cho kết quả giống nhau Dung dịch thử trong và không có màu đậm hơn màu của dung dịch mẫu VN6, đặt ra mức chỉ tiêu xác định độ trong và màu sắc dung dịch là dung dịch phải trong và không được đậm màu hơn dung dịch màu mẫu VN6
* pH:
Bảng 8: Kết quả xác định pH của nguyên liệu pidotimod
X ± SD = 2,17 ± 0,02
pH của dung dịch pidotimod từ nguyên liệu tổng hợp 2,17 ± 0,02 Từ kết quả thu được
và tham khảo tài liệu, chỉ tiêu đặt ra xác định pH là 2,0 - 3,0
Trang 9* Điểm chảy:
Bảng 9: Kết quả xác định điểm chảy của nguyên liệu pidotimod
C)
Điểm chảy của pidotimod là 194,5 ± 0,16oC, phù hợp trong khoảng nhiệt độ nóng chảy của chất chuẩn pidotimod (194 - 198oC) Từ kết quả trên và tham khảo tài liệu, mức chỉ tiêu đặt ra xác định điểm chảy là 193 - 195oC
* Góc quay cực:
Bảng 10: Kết quả đo góc quay cực riêng của pidotimod
Mẫu
Lô 313 (a = 0,12%) Lô 413 (a = 0,13%) Lô 513 (a = 0,14%)
m pi
)
m pi
m pi
)
(TB) ± SD = -138,2 ± 0,3o Góc quay cực của các mẫu là -138,2o
± 0,3o, phù hợp trong khoảng góc quay cực của chất chuẩn pidotimod (-138o đến -142o) Từ kết quả trên và tham khảo tài liệu, mức chỉ tiêu đặt ra xác định góc quay cực của pidotimod là -137o đến -141o
* Kim loại nặng:
Ở cả 3 lô (313, 413, 513) đều cho kết quả giống nhau Màu của ống thử nhạt hơn màu của ống chuẩn Màu của ống chuẩn nhạt hơn màu của ống kiểm tra Nguyên liệu pidotimod tổng hợp được đạt yêu cầu về giới hạn kim loại nặng Từ đó, mức chỉ tiêu đặt ra xác định giới hạn kim loại nặng của dung dịch không được quá 20 ppm
Trang 10* Tạp chất liên quan:
Ở cả 3 lô (313, 413, 513) đều cho kết quả giống nhau: không xuất hiện tạp Tuy nhiên, mức cho phép đặt ra của từng tạp không quá 0,5%, tổng tạp không quá 1,0%
* Giới hạn dung môi tồn dư:
- Xác định tồn dư dung môi ethanol và dicloromethan: ở cả 3 lô (313, 413, 513) đều cho kết quả giống nhau: không xuất hiện píc của dung môi tồn dư Tuy nhiên, mức giới hạn đặt ra cho phép khi xác định dung môi tồn dư DCM là không được quá 600 ppm, ethanol không quá 5.000 ppm
- Xác định tồn dư dung môi triethylamin: ở cả 3 lô (313, 413, 513) đều cho kết quả giống nhau: không xuất hiện píc của dung môi tồn dư Tuy nhiên, mức giới hạn đặt ra cho phép khi xác định dung môi tồn dư TEA không được quá 320 ppm
* Định lượng:
Bảng 11: Kết quả định lượng pidotimod
mt St X% mt St X% mt St X%
50,2 9532 50,2 9622,6 100,5063 51,9 9746,2 98,46288 49,6 9458,7 99,98949 50,2 9532 51,1 9481,4 97,2873 51,1 9531,2 97,79829 50 9414 98,72082 50,2 9532 50,9 9524,2 98,11046 50,8 9613,7 99,22736 50,3 9629,7 100,3805 50,2 9532 51,9 9680,5 97.79913 51,3 9675,1 98,88779 51,7 9529,4 96,64504 50,2 9532 51,1 9725,3 99,78992 50,5 9539,4 99,04539 51,2 9525,8 97,55198 50,2 9532 50,4 9507 98,90484 51,7 9554,8 96,90264 50,2 9645,5 100,7455
Trung bình 98,73299 98,38739 99,00555
X ± SD 98,70865 ± 1,25
Hàm lượng pidotimod trong nguyên liệu tổng hợp đạt hàm lượng cao (> 98,0%) Như vậy, quy trình tổng hợp và tinh chế tốt, ổn định Từ đó, mức yêu cầu đưa ra cho chỉ tiêu hàm lượng pidotimod là chế phẩm phải chứa từ 96,0 - 102,0% C9H12N2O4S, tính theo chế phẩm khan
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được
tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm
nghiệm nguyên liệu pidotimod tổng hợp
tại Việt Nam, bao gồm các chỉ tiêu: chỉ
tiêu chất lượng chung cho nguyên liệu
làm thuốc (cảm quan, độ trong và màu
sắc dung dịch, pH, năng suất quay cực, điểm chảy, hàm lượng nước, giới hạn kim loại nặng) và các chỉ tiêu riêng cho pidotimod (định tính, định lượng, giới hạn dung môi tồn dư, tạp chất liên quan) Các phương pháp thử khả thi, kỹ thuật tương đối phổ biến, có thể thực hiện được ở các đơn vị kiểm nghiệm thuốc Tiêu chuẩn