Xác định đột biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1 ở bệnh nhân ung thư võng mạc

Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ở trẻ. Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon 10, 14, 20. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20. 49 bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu.

Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu

Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn

Ngày nhận: 18/9/2018

Ngày được chấp thuận: 11/10/2018

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN MỘT SỐ EXON TRỌNG ĐIỂM CỦA GEN RB1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÕNG MẠC

Vũ Đức Anh 1 , Trần Huy Thịnh 1 , Phạm Trọng Văn 1,2 , Phạm Hồng Vân 2 , Tạ Thành Văn 1 , Trần Vân Khánh 1

1 Trường Đại học Y Hà Nội; 2 Bệnh viện Mắt Trung ương

Ung thư võng mạc là một trong những khối u ác tính thường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, bệnh gây nên do đột biến gen RB1 làm mất hoặc giảm chức năng của protein RB1 Ở nước đang phát triển như Việt Nam, phần lớn các trường hợp đều phát hiện muộn và trẻ thường phải khoét bỏ nhãn cầu, thậm chí

đe dọa tính mạng của trẻ Phát hiện đột biến gen RB1 trên các bệnh nhân ung thư võng mạc là tiền đề quan trọng giúp phát hiện người lành mang bệnh và chẩn đoán trước sinh nhằm giảm tỷ lệ tử vong, tỷ lệ mù lòa ở trẻ Đột biến trên gen RB1 thường là đột biến điểm và gặp nhiều ở một số exon trọng điểm trong đó có exon

10, 14, 20 Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: xác định đột biến gen RB1 trên exon 10, 14, 20 49 bệnh nhân ung thư võng mạc được lựa chọn nghiên cứu Kỹ thuật giải trình tự gen được áp dụng để xác định đột biến điểm trên exon 10, 14 và 20 5/49 (10,2%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến, trong đó 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Trp680Cys và 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile trên exon 20, 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Tyr452Phe trên exon 14, và 1 bệnh nhân phát hiện 2 đột biến: p.Tyr452Phe và p.Val455Glu trên exon 14 Bệnh nhân còn lại phát hiện đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 trên exon 10 Tất cả các đột biến đều là đột biến dị hợp và là đột biến chưa từng được công bố

Từ khóa: Ung thư võng mạc, gen RB1, đột biến gen

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư võng mạc là một bệnh lý ác tính

thường gặp nhất tại ổ mắt ở trẻ sơ sinh và trẻ

nhỏ, với tần suất thường gặp từ

1/15.000-1/18.000 trẻ được sinh ra, bệnh liên quan tới

đột biến ở gen RB1 [1 - 3] Đột biến gây bệnh

trên gen RB1 làm giảm hoặc thậm chí mất

chức năng của protein pRB, từ đó dẫn tới mất

kiểm soát quá trình nhân lên của tế bào, dẫn

tới mất khả năng kiểm soát phân bào và hình

thành khối u tại võng mạc [4]

Các nghiên cứu đã công bố có trên 900

đột biến gen RB1 là cơ sở dữ liệu quan trọng

cho tư vấn di truyền và cho biết đặc điểm giữa

mối quan hệ kiểu gen và kiểu hình của bệnh

Gần 40% đột biến gen RB1 tái diễn và tập trung tại 16 điểm bao gồm 12 đột biến vô nghĩa (nonsense), 02 đột biến sai nghĩa (missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing) Những đột biến còn lại nằm rải rác dọc gen RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon 9, 10,

14, 17, 18, 20 và 23 [2 - 6] Việc phát hiện ra đột biến gen RB1 là cơ sở cho việc phát triển

và triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ cho chẩn đoán trước sinh, đồng thời quản lý tốt những người mang gen nhằm giảm

tỷ lệ biến chứng và tỷ lệ tử vong ở trẻ [7 - 9] Ung thư võng mạc là một bệnh lý hiếm gặp, tuy nhiên số lượng bệnh nhân tới khám

và điều trị tại Bệnh viện Mắt Trung ương ngày càng tăng Năm 2005 chỉ có 14 bệnh nhân được phát hiện và chẩn đoán trong vòng 1 năm, tuy nhiên tới năm 2013 con số đó đã tăng lên 52 trẻ tới khám và điều trị [10]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến

ung thư võng mạc còn rất ít, chủ yếu là các

nghiên cứu về lĩnh vực lâm sàng nên các

nghiên cứu về gen liên quan tới ung thư võng

mạc còn chưa nhiều, thông tin còn hạn chế

Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài nhằm mục tiêu xác định đột

biến trên một số exon trọng điểm của gen RB1

ở bệnh nhân ung thư võng mạc

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng

49 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư

võng mạc tại Bệnh viện Mắt Trung ương dựa

trên lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh hoặc

có kết quả giải phẫu bệnh là ung thư võng

mạc, bệnh nhân và gia đình đồng ý tham gia

nghiên cứu

2 Phương pháp

- Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch

chống đông bằng EDTA

- Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA

tổng số được tách chiết từ máu toàn phần

bằng phenol-chloroform-isopropanol (25:24:1)

- Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để

khuếch đại exon 10, 14 và 20 của gen RB1

với 3 cặp mồi được thiết kế

- Thành phần phản ứng PCR (thể tích

20µl) gồm: nước cất PCR 11,9 µl; buffer 10X

2,0 µl; 2,5 mM dNTP, 0,5 µM mồi xuôi và

ngược, 0,5U Taq polymerase, 3,0µl DNA

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC/5

72oC/30 giây], 72oC/5 phút Bảo quản mẫu ở

10oC

Kỹ thuật giải trình tự gen: các sản phẩm

PCR sẽ được tiến hành giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100 Genetic Analyzer Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISM TM 3100 – Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI

Trình tự được so sánh trên ngân hàng gen:

DNA (NG_009009.1) bằng phần mềm CLC

3 Đạo đức nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu trong Y học Bệnh nhân và gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia Bệnh nhân và gia đình được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác

sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân được đảm bảo bí mật

III KẾT QUẢ

1 Kết quả xác định khuếch đại exon 10,

14 và 20 của gen RB1

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 10, 14

và 20 của gen RB1 để khuếch đại DNA sau tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân Hình 1 là hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 10 của gen RB1

Sản phẩm PCR thu được chỉ có 1 băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 291 bp không có sản phẩm phụ Sản phẩm khuếch đại PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự tiếp theo

Hình 1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 của gen RB1

(+) mẫu đối chứng dương; (-) mẫu chứng âm; (1-9) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker (100bp)

2 Kết quả xác định đột biến gen RB1

Sản phẩm PCR được giải trình tự gen để xác định đột biến Kết quả cho thấy 5/49 (10,2%) bệnh nhân phát hiện đột biến, trong đó 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Trp680Cys và 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Glu692Val_Leu693Ile trên exon 20, 1 bệnh nhân phát hiện đột biến p.Tyr452Phe trên exon 14 và 1 bệnh nhân khác phát hiện 2 đột biến p.Tyr452Phe và p.Val455Glu trên exon 14 Bệnh nhân còn lại phát hiện đột biến p.Thr345Arg frameshift X6 trên exon 10

Bảng 1 Kết quả xác định đột biến trên 3 exon 10, 14, 20 gen RB1

MK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (+) (-)

291 bp

Mã

bệnh

nhân

Đột biến Thay đổi

protein

Thể đột biến Exon Loại đột biến

Chú thích

RB57 c.1357 A > T

c.1366 T > A

p.Tyr452Phe p.Val455Glu

Dị hợp

Dị hợp

14

14

Missense Missense

New New RB68 c.2077_2079 AAC

> TTA

p.Glu692Val_

Missense: đột biến sai nghĩa; Deletion: đột biến mất nucleotid;

New: đột biến mới chưa được công bố

Hình 2 Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 của bệnh nhân mã số RB57

Kết quả trên cho thấy bệnh nhân RB57 phát hiện 02 đột biến dị hợp tử trên cùng exon 14 Cả

02 đột biến này đều là dạng đột biến sai nghĩa Đột biến tại vị trí c.1357 A > T làm biến đổi acid

amin Tyrosin vị trí 452 thành Phenylalanin, đột biến tại vị trí c.1366 T > A làm thay đổi acid amin

Valin vị trí 455 thành Glutamat

Hình 3 Hình ảnh giải trình tự đột biến exon 14 của bệnh nhân mã số RB79

Giải trình tự phát hiện bệnh nhân RB79 có đột biến mất đoạn c.1033delCT làm mất 2

nucleotid C và T Đột biến tại vị trí này làm thay đổi acid amin thứ 345 từ Threonin thành Arginin

dẫn tới tạo mã kết thúc sớm (stop codon) sau 6 codon kế tiếp

muộn với tình trạng biến chứng phải khoét bỏ

nhãn cầu và tiên lượng tử vong cao gây hậu

quả nặng nề cho gia đình và xã hội Việc phát

hiện ra đột biến gen RB1 là cơ sở cho việc

phát triển và triển khai các kỹ thuật sinh học

phân tử phục vụ cho chẩn đoán trước sinh,

đồng thời quản lý tốt những người mang gen

bệnh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa và thương tật ở

trẻ Các nghiên cứu về các đột biến gene

cũng đã và đang được tiến hành, cung cấp

những thông tin dữ liệu cho ngân hàng gene

RB1 (http://rb1-lsdb.d-lohmann.de/) và công

bố có trên 900 đột biến gen RB1 là cơ sở dữ

liệu quan trọng cho tư vấn di truyền và cho

biết đặc điểm giữa mối quan hệ kiểu gen và

kiểu hình của bệnh Gần 40% đột biến gen

RB1 tái diễn và tập trung tại 16 điểm bao gồm

12 đột biến vô nghĩa (nonsense), 02 đột biến

sai nghĩa (missense), 03 đột biến vị trí nối (splicing) Những đột biến còn lại nằm rải rác

dọc gen RB1 và tỷ lệ gặp cao nhất ở các exon

9, 10, 14, 17, 18, 20 và 23 [2; 3] Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên 3 trong số các exon có tỷ lệ gặp đột biến cao để xác định đột biến là exon 10,

14, 20

Tỷ lệ phát hiện đột biến trong nghiên cứu của chúng tôi trên 3 exon (exon 10, 14, 20) chiếm 10,2% (5/49) tương đồng với nghiên cứu tại Trung Quốc (8,2%, n = 85), hay nghiên cứu tại Tây Ban Nha, Colombia, Cuba (10,3%,

n =107), tuy nhiên thấp hơn so với nghiên cứu tại Singapore năm 2017 là 23,7% (n = 59), có

sự khác nhau đó có thể do sự khác biệt về địa

lý và chủng tộc [11 - 13]

Hình 4 Phân bố đột biến phát hiện được ở 49 bệnh nhân trên toàn bộ 27 exon gen RB1

Nghiên cứu phát hiện một đột biến mất

đoạn c.1033delCT dẫn tới lệch toàn bộ trình

tự khung sau đột biến tại exon 10 Đột biến tại

vị trí này làm thay đổi acid amin thứ 345 từ

Threonin thành Arginin dẫn tới tạo mã kết thúc

sớm (stop codon) sau 6 codon kế tiếp Đột

biến điểm gây tạo mã kết thúc này xảy ra ngay

tại vùng N-terminal, từ đó không thể tiếp tục

dịch mã tạo thành các vùng có chức năng

quan trọng của protein pRB Tuy chưa tiến

hành được các thử nghiệm RNA hay invivo để

xác định mức độ ảnh hưởng của đột biến tới

khả năng gây bệnh, nhưng rất có thể đột biến c.1033delCT là đột biến tiềm năng gây ung thư võng mạc ở bệnh nhân RB79

Các đột biến còn lại chủ yếu là đột biến sai nghĩa (missense) chiếm tỷ lệ 5/6 (83,3%), trong đó có 03 đột biến dị hợp tử trên cùng exon 14 Đột biến tại vị trí c.1357 A > T làm biến đổi acid amin Tyrosin vị trí 452 thành Phenylalanin gặp ở 2 bệnh nhân, 2 acid amin này đều thuộc nhóm acid amin chưa gốc nhân thơm, sự ảnh hưởng có thể không rõ và cần phải kiểm chứng thêm Còn đột biến tại vị trí

c.1366 T > A làm thay đổi acid amin vị trí 455

Valin (không phân cực, kỵ nước) thành

Glutamat (phân cực, tích điện âm) Sự thay

đổi này có thể ảnh hưởng tới đặc tính của

chuỗi protein, dẫn đến mất khả năng tương

tác của vùng A domain và protein LXCXE,

giống như một số thay đổi tương tự đã được

công bố trước đó [11; 12] Tương tự đột biến

c.2041 G > T trên exon 20 ở bệnh nhân RB29

thay làm thay đổi bộ ba mã hóa cho acid amin

Tryptophan (chứa nhân thơm) tại vị trí 680 trở

thành bộ ba Cystein (phân cực, không tích

điện) và đột biến trên exon 20 c.2077 - 2079

AAC > TTA làm thay đổi 2 acid amin liền kề:

Glutamat (tích điện âm) thành Valin (không

phân cực, kỵ nước) và Leucin thành Isoleucin

(cùng nhóm) tại vị trí 692 và 693 tương ứng

cũng có thể làm thay đổi sự tương tác của

vùng B domain với protein LXCXE Tuy nhiên

nghiên cứu mới là bước đầu xác định đột biến

trên ba exon, vẫn rất cần các thử nghiệm sâu

hơn để xác định được chính xác mức độ gây

bệnh của từng đột biến và cần thêm những

nghiên cứu trên toàn bộ các exon còn lại với

cỡ mẫu lớn hơn, từ đó có thể mở rộng tìm đột

biến trên các thành viên gia đình của các bệnh

nhân đã được phát hiện đột biến Đó cũng là

điều kiện thuận lợi cho các tư vấn di truyền

sau này

V KẾT LUẬN

Đã phát hiện 5/49 (10,2%) bệnh nhân

được phát hiện có đột biến Tất cả các đột

biến đều là đột biến dị hợp và là đột biến chưa

được công bố Đặc biệt đã phát hiện được đột

biến c.1033delCT (p.Thr345Arg frameshift X6)

Leucin thành Isoleucin tại vị trí 692 và 693 tương ứng

Lời cảm ơn

Nghiên cứu được hỗ trợ với kinh phí của

đề tài khoa học cấp Bộ Y tế ”Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bệnh ung thư võng mạc và xác định yếu tố di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử” và sự giúp đỡ của cán

bộ Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bishop JO, Madson EC (1975)

Retino-blastoma: Review of the current status Surv

Ophthalmol, 19, 342 ‑ 66

2 Mallipatna A, Marino M, Singh AD

(2016) Genetics of Retinoblastoma Asia Pac

J Ophthalmol (Phila), 5(4), 260 - 264

3 Jose R.V (2005) RB1 gene mutation up

-date, a meta-analysis based on 932 reported mutations available in a searchable database,

BMC Genetics, 6, 53

4 Sugano K, Yoshida T, Izumi H et al (2004) Outpatient clinic for genetic counseling

and gene testing of retinoblastoma Int J Clin

Oncol 9, 25 - 30

5 Lohmann D.R, Brandt B, Hopping W

et al (1996) The spectrum of RB1 germ-line

mutations in hereditary retinoblastoma Am J

Hum Genet, 58, 940 - 949

6 Alonso J, Frayle H, Menéndez I et al (2005) Indentification of 26 new constititional

RB1 gene mutationsin Spanish, Colombian,

and Cuban retinoblastoma patients Hum

Mu-8 Sampieri K, Hadjistilianou T, Mari F et

al (2006) Mutational screening of the RB1

gene in Italian patients with retinoblastoma

reveals 11 novel mutations J Hum Genet, 51,

209 - 216

9 Rushlow D, Piovesan B, Zhang K et al

(2009) Detection of mosaic RB1 mutations in

families with retinoblastoma Hum Mutat 30,

842 - 851

10 Nguyễn Ngân Hà, Phạm Trọng Văn,

Phạm Thị Minh Châu và cộng sự (2016)

Dịch tễ học lâm sàng u nguyên bào võng mạc

ở miền bắc Việt Nam (2004 - 2013) Tạp chí

Nghiên cứu y học, 102(4), 129 - 136

11 Ming-yan He, Yu An, Yi-jin Gao et al

(2013) Screening of RB1 gene mutations in

Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype–

phenotype correlations Molecular Vision 20,

545 - 552

12 Alonso J, Frayle H, Menéndez I et al (2005) Identification of 26 New Constitutional

RB1 Gene Mutations in Spanish, Colombian,

and Cuban Retinoblastoma Patients Hum

Mutat, 25(1), 99

13 Swati T, Raman S, Gangadhara S et

al (2017) Mutation spectrum of RB1

muta-tions in retinoblastoma cases from Singapore with implications for genetic management and

counselling PLoS ONE 12(6), e0178776

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178776

Summary

MUTATION ANALYSIS IN KEY REGION OF RB1 GENE IN PATIENTS

WITH RETINOBLASTOMA

Retinoblastomas are one of the most common intraocular malignant tumors in infants and

young children They are caused by a mutation in the RB1 gene that results in the loss or

deacti-vation of the RB1 protein In developing countries like Vietnam, most cases are diagnosed in later

stages that are life-threatening, requiring enucleation Detection of RB1 mutations in patients with

retinoblastoma is an important for identifying healthy carriers and conducting prenatal diagnosis to

reduce mortality and blindness in children Mutations in the RB1 are often point mutations and are

common in some key exons including 10, 14, 20 The study was conducted with the purpose of

identifying RB1 mutations on exon 10, 14, 20 This study is composed of 49 patients with retino-blastomas Mutations in exon 10, 14 and 20 of the RB1 gene were identified by direct sequencing

Different mutations were found in 5/49 (10.2%) patients One patient was detected with mutation p.Trp680Cys and a second patient with p.Glu692Val_Leu693Ile mutation on exon 20 A third patient was detected with p.Tyr452Phe mutation on exon 14 and a fourth patient was detected with 2 mutations: p.Tyr452Phe and p.Val455Glu on exon 14 The fifth patient was detected with mutant p.Thr345Arg frameshift X6 on exon 10 All mutations were mutant heterologous These findings are novel and have not been reported in prior publications

Keywords: Retinoblastoma, RB1 gene, mutation