Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào (TB) dòng chảy. Phương pháp: thử nghiệm các quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch của các labo khác nhau, phát hiện các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp. Sau đó hoàn thiện và thử nghiệm quy trình hoàn chỉnh.
Trang 1NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CỦA QUY TRÌNH NHUỘM RỬA VÀ CỐ ĐỊNH MẪU BỆNH PHẨM ĐẾN VIỆC HOÀN THIỆN XÉT NGHIỆM XẾP LOẠI MIỄN DỊCH
BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY
Lê Xuân Hải*; Nguyễn Triệu Vân*
TÓM TẮT
Mục tiêu: tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp
loại miễn dịch bằng kỹ thu t phân tích tế bào (TB) dòng chảy Phương pháp: thử nghiệm các
quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch của các labo khác nhau, phát hiện các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp Sau đó hoàn thiện và
thử nghiệm quy trình hoàn chỉnh Kết quả: đã tìm ra các bước cần cải tiến quy trình xử lý mẫu
bệnh phẩm để cải thiện chất lượng xét nghiệm như: phá hồng cầu trước khi ủ kháng thể; rửa
bỏ kháng thể thừa trước khi phân tích; sử d ng dung dịch cố định và bảo quản TB Kết luận: để
tăng cường chất lượng xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng phương pháp TB dòng chảy cần áp
d ng một số thay đổi trong quy trình nhuộm rửa, cố định và bảo quản mẫu
* Từ khóa: Bệnh bạch cầu; Xếp loại kiểu hình miễn dịch; Đếm tế bào dòng chảy
Study on Affecting Factors of Staining, Washing and Fixing of Blood Samples to Complete Immmunophenotyping by Flow Cytometry Technic
Summary
Objectives: To optimize the process of staining, washing and fixing of samples that are used in immunophenotyping by flow cytometry Methods: To perform the procedure of immunophenotyping
in various samples to identify factors affecting the procedure of handling samples and the completed procedure is developed and tested afterward Results: some improvements in the procedure help enhance the test quality including lysing erythrocytes before incubating, washing off excess antibodies before testing, fixing and preserving procedure Conclusion: It is needed
to apply some improvement in staining, washing, fixing and preserving sample procedure for ensuring a good sample quality of immunophenotyping
* Key words: Leukemia; Immunophenotyping; Flow cytometry.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh bạch cầu cấp (BCC) (Lơ-xê-mi
cấp) là một bệnh ung thư máu thường
gặp trong chuyên khoa huyết học TB ung thư có thể phát triển từ các TB gốc tạo máu chưa biệt hóa hoặc các TB đã biệt hóa thành dòng tủy hoặc dòng lympho
* Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương
Người phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hai (hailexuan@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 20/12/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2016
Ngày bài báo được đăng: 23/03/2016
Trang 2Việc xác định chính xác dòng TB, giai
đoạn phát triển của TB có giá trị trong chẩn
đoán, theo dõi, tiên lượng, xếp loại và lựa
chọn phác đồ đi u trị phù hợp Trước năm
1976, việc chẩn đoán và xếp loại bệnh
BCC hoàn toàn dựa vào hình thái học và
hóa học TB theo tiêu chuẩn của FAB Cuối
th p kỷ 1990, WHO đã công nh n dấu ấn
miễn dịch TB là một tiêu chuẩn chẩn đoán
bắt buộc, h trợ xếp loại chính xác các
bệnh lý tăng sinh ác tính có liên quan đến
TB tạo máu Ngày nay, trên thế giới, việc
nh n biết các dấu ấn miễn dịch TB bằng kỹ
thu t TB dòng chảy đã trở thành xét
nghiệm thường quy nhằm h trợ xác định
chính xác dòng TB ác tính và xếp loại dưới
nhóm của bệnh, góp phần định hướng đi u
trị và tiên lượng bệnh trước đi u trị Việc áp
d ng kỹ thu t này ở Việt Nam đã được tiến
hành một vài năm, tuy nhiên đây là một kỹ
thu t xét nghiệm có độ đặc hiệu và đòi hỏi
độ chính xác cao, dễ dẫn tới dương tính giả
hoặc âm tính giả nếu các thao tác không
phù hợp Vì v y, một khía cạnh quan trọng
của kỹ thu t TB dòng chảy là tìm ra một
quy trình xét nghiệm ổn định nhất, phù hợp
nhất đối với đi u kiện c thể của m i phòng
xét nghiệm Chúng tôi thực hiện nghiên
cứu này với m c tiêu: Phát hiện một số yếu
tố ảnh hưởng của quy tr nh nhuộm, r a và
cố định mẫu bệnh phẩm nhằm cải tiến và
hoàn thiện xét nghiệm xếp loại theo kiểu
h nh miễn dịch BCC bằng phương pháp
phân tích TB dòng chảy
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tư ng nghiên cứu
Các quy trình xử lý bệnh phẩm làm xét
nghiệm xếp loại miễn dịch đã công bố trên
thế giới
2 Phương pháp nghiên cứu
* Thiết lập quy tr nh xếp loại miễn dịch
sơ bộ cho bệnh BCC:
Dựa trên tài liệu của các nhóm nghiên cứu khác nhau v xếp loại miễn dịch trong bệnh BCC và dựa trên các panel xếp loại BCC tham khảo từ các Hội nghị Quốc tế, đồng nghiệp trong và ngoài nước, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình xét nghiệm xếp loại miễn dịch sơ bộ
* Áp dụng sơ bộ quy tr nh xếp loại miễn dịch trên xét nghiệm thực tế:
Dựa trên quy trình xét nghiệm đã thiết
l p, tiến hành áp d ng trên thực tế Tổng kết các mặt ưu điểm và hạn chế của kết quả thu được
* Hoàn thiện quy tr nh xét nghiệm xếp loại miễn dịch:
Dựa trên kết quả thu được sau khi áp
d ng, tiến hành một số đi u chỉnh trong quy trình, có so sánh trước và sau khi thay đổi để đưa ra nh n định:
- So sánh giữa ly giải hồng cầu trước khi ủ kháng thể với ly giải hồng cầu sau khi ủ kháng thể
- Rửa mẫu so với không rửa mẫu sau khi ủ với kháng thể
- So sánh giữa sử d ng dung dịch cố định TB để bảo quản TB với không sử
d ng dung dịch bảo quản TB
* Thu thập kết quả, so sánh và đánh giá các kết quả thu được:
- Thu th p kết quả có được khi xếp loại miễn dịch theo quy trình ban đầu và quy trình có sửa đổi
Trang 3- Đánh giá, so sánh kết quả khi thực
hiện quy trình ban đầu với kết quả khi
thực hiện với quy trình có thay đổi ở một
bước nhất định
- Thống nhất áp d ng một số thay đổi
có hiệu quả để có một quy trình tối ưu
nhất
* Vật liệu nghiên cứu:
- Bệnh phẩm nghiên cứu: 10 mẫu máu
ngoại vi chống đông EDTA của 10 người
khỏe mạnh (m i mẫu 2 ml)
- Hóa chất, sinh phẩm: dung dịch PBS,
dung dịch phá hồng cầu NH4Cl, dung dịch
formaldehyde 40%, sodium azide dạng
bột, huyết thanh bào thai bê, bộ kháng
thể gắn chất màu hu nh quang
- Thực hiện trên máy đếm TB dòng chảy
Navious (Hãng Beckmann Coulter)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Xây dựng quy trình sơ b cho xét
nghiệm xếp loại miễn dịch BCC
Qua tham khảo các quy trình xử lý
mẫu và xét nghiệm xếp loại miễn dịch của
tài liệu khác nhau trên thế giới [2, 3, 4, 5],
chúng tôi nh n thấy một số điểm chung
như sau:
- Mẫu sử d ng xếp loại miễn dịch là
máu hoặc dịch hút tủy xương chống đông
bằng EDTA
- Dung dịch phá hồng cầu NH4Cl
- Dung dịch pha loãng bệnh phẩm PBS
- Bệnh phẩm cần được ủ với kháng
thể trong đi u kiện tối, nhiệt độ 40C trong
30 phút để đảm bảo gắn kết hoàn toàn
- Ly tâm ở tốc độ 500 g/5 phút để thu cặn và loại bỏ dịch nổi chứa các kháng thể thừa
Với các dữ kiện như trên, chúng tôi xây dựng quy trình sơ bộ dùng cho xử lý mẫu
và xét nghiệm xếp loại kiểu hình miễn dịch như sau:
Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương hoặc máu toàn phần), kháng thể pha sẵn, dung dịch PBS 1X, dung dịch lysing, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, máy Vortex
Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể tương ứng vào ống nghiệm
Bước 3: hút 100 μl bệnh phẩm vào ống xét nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện tối, 40
C trong 30 phút
Bước 5: thêm 1 ml dung dịch ly giải hồng cầu vào ống nghiệm
Bước 6: tiếp t c ủ trong 10 phút Bước 7: trộn đ u ống nghiệm bằng máy Vortex, đưa ống nghiệm vào máy đọc kết quả
2 Áp dụng thử nghiệm quy trình xét nghiệm xếp loại iểu hình miễn dịch
Với quy trình xét nghiệm sơ bộ trên, chúng tôi áp d ng trên hệ thống máy Navious-Beckman Coulter với 10 bệnh phẩm của người bình thường, các dấu ấn miễn dịch được phối hợp như sau:
HLA-DRFITC - CD34PE - CD45ECD CD13FITC - CD33PE - CD45ECD CD3FITC - CD19PE - CD45ECD - CD2PC5 CD15FITC - CD117PE - CD45ECD CD20FITC - CD22PE - CD45ECD
Trang 4Phân tích kết quả thu được khi nhuộm
các dấu ấn trên với bệnh phẩm dựa trên
quần thể TB đã khẳng định tính chính
xác của kháng nguyên biểu hiện, quần
thể dòng hạt dương tính mạnh với CD15,
CD13, CD33; quần thể lympho dương
tính với CD2, CD3, CD19, HLA-DR, CD20,
CD22; quần thể mono dương tính với
HLA-DR, CD33; các dấu ấn đặc trưng của
m i dòng thì âm tính trên các dòng còn
lại (ví d : CD19 âm tính trên dòng hạt,
CD15 âm tính trên dòng lympho) Kết
quả bước đầu như sau:
Dương tính giả: 3/10 mẫu (30%); âm
tính giả: 0 mẫu (0%)
Quy trình xét nghiệm trên đã cơ bản
đảm bảo khả năng gắn các kháng thể lên
b mặt TB với tỷ lệ âm tính giả 0% Tuy
nhiên, tỷ lệ dương tính giả của các dấu
ấn khá cao, tới 30%, do kháng thể thừa
bám không đặc hiệu trên b mặt TB Bên
cạnh đó, còn một số vấn đ liên quan đến
xử lý mẫu như hiện tượng cặn xơ, hạt
mỡ, hồng cầu tồn đọng gây tắc kim và
gây nhiễu trong quá trình phân tích
3 Hoàn thiện quy trình xếp loại iểu hình miễn dịch
* Ly giải hồng cầu:
Qua áp d ng sơ bộ quy trình ban đầu, chúng tôi nh n thấy việc ly giải hồng cầu ở cuối quy trình không đảm bảo chất lượng xét nghiệm Với cách ly giải hồng cầu này, các ống mẫu tồn dư nhi u cặn xơ, hạt mỡ, cửa sổ phân tích lẫn nhi u quần thể rác hoặc hồng cầu chưa tan hoàn toàn lẫn vào
TB có nhân, dễ dẫn đến sai lệch kết quả Một số phòng xét nghiệm trên thế giới áp
d ng phương pháp ly giải hồng cầu, thu cặn bạch cầu trước khi ủ kháng thể Phương pháp này có thể giúp tránh được ảnh hưởng của hóa chất ly giải hồng cầu đối với kháng thể sau ủ Chúng tôi cải tiến quy trình trên bằng cách chuyển bước ly giải hồng cầu vào trước khi thu được cặn bạch cầu để ủ với kháng thể
So sánh hiệu quả của quy trình này với quy trình nêu trước đó, kết quả như sau:
Bảng 1: So sánh kết quả giữa 2 quy trình ly giải hồng cầu trước và sau ủ
Ly giải hồng cầu sau hi ủ
(n = 10)
Ly giải hồng cầu trước hi ủ
(n = 10)
Quần thể mảnh vỡ hồng cầu, cặn bẩn
Việc phá hồng cầu trước khi ủ bệnh phẩm với kháng thể giúp loại bỏ được cặn bẩn, hạt mỡ trong ống xét nghiệm Đi u này cải thiện chất lượng bệnh phẩm khi phân tích trên máy, không bị lẫn các mảnh hồng cầu tồn dư hoặc rác với TB có nhân Ngoài ra, việc phá hồng cầu trước khi ủ cũng cải thiện hiện tượng tắc kim khi chạy máy
Trang 5* R a bệnh phẩm sau ủ kháng thể:
Một nguyên nhân khác gây nên hiện
tượng dương tính giả khi phân tích TB
dòng chảy là do thừa kháng thể trong quá
trình ủ Khi lượng kháng thể thừa so với
số TB đưa vào, chúng có thể bám không
đặc hiệu lên TB với ái lực thấp và cho tín
hiệu dương tính đối với cảm biến của
máy đếm, gây sai lệch kết quả Để giải
quyết vấn đ này, chúng tôi bổ sung
bước rửa bệnh phẩm sau khi ủ bằng
cách: thêm 2 ml PBS vào h n hợp sau ủ,
ly tâm 500 g/5 phút, hút dịch nổi và tái
huy n dịch lại bằng 1 ml PBS
Bảng 2: So sánh kết quả giữa 2 quy
trình có rửa và không rửa kháng thể
Kh ng rửa háng thể
Có rửa háng thể
Mức độ t p trung của
(* Các dấu ấn thường có hiện tượng
dương tính giả gồm CD22, CD20, CD15)
Việc rửa kháng thể thừa sau khi ủ với
bệnh phẩm là bước quan trọng, giúp tối
ưu hóa kết quả phân tích trên máy đếm
TB dòng chảy
Qua 2 bước cải tiến trên, chúng tôi
đưa ra quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm
xếp loại kiểu hình miễn dịch hoàn thiện
như sau:
- Kỹ thu t xử lý mẫu trước khi xếp loại
kiểu hình miễn dịch:
Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương
hoặc máu toàn phần), kháng thể pha sẵn,
dung dịch PBS 1X, dung dịch ly giải hồng
cầu, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, máy
Vortex
Bước 2: ủ bệnh phẩm với dung dịch ly giải theo tỷ lệ 1/15 trong 10 phút
Bước 3: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn bạch cầu
Bước 4: tái huy n dịch cặn bằng 2 ml dung dịch PBS 1X
Bước 5: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn bạch cầu
- Kỹ thu t ủ kháng thể xếp loại kiểu hình miễn dịch:
Bước 1: tái huy n dịch cặn bằng dung dịch PBS 1X, pha loãng đảm bảo nồng độ
106 bạch cầu/μl dung dịch (theo số đếm bạch cầu)
Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể tương ứng vào ống nghiệm
Bước 3: hút 100 μl dung dịch bạch cầu
đã chuẩn bị vào ống xét nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex
Bước 4: ủ h n hợp trên trong đi u kiện tối, 40C trong 30 phút
Bước 5: thêm 2 ml PBS vào h n hợp sau ủ, ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn bạch cầu đã gắn kháng thể Bước 6: thêm 1 ml dung dịch PBS 1X vào ống nghiệm, trộn đ u bằng máy Vortex, đọc kết quả sau khi chạy máy
* Bảo quản bệnh phẩm bằng dung dịch
cố định TB:
Một vấn đ khó khăn là bệnh phẩm chỉ
có thể lưu giữ trong vòng 48 giờ Sau thời gian này, TB có xu hướng thoái hóa, vón
t lại và không còn đảm bảo tính chính xác khi phân tích Vì v y, chúng tôi áp
d ng phương pháp bảo quản bệnh phẩm bằng cách sử d ng dung dịch cố định TB
và dung dịch bảo quản TB pha chế theo công thức tham khảo từ nhi u tài liệu nghiên cứu
Trang 6Dung dịch cố định TB: thành phần gồm
có formaldehyde 1% pha trong dung dịch
PBS
Dung dịch bảo quản TB: thành phần
gồm có sodium azide 1%, huyết thanh
bào thai bê 10% pha trong dung dịch PBS
* Kỹ thuật cố định và bảo quản bệnh
phẩm:
Bước 1: chuẩn bị ống nghiệm chứa
107 bạch cầu đã xử lý phá hồng cầu,
dung dịch cố định, dung dịch bảo quản
Bước 2: ly tâm ống có bệnh phẩm, tốc
độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn
Bước 3: thêm 2 ml dung dịch bảo quản,
ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn
Bước 4: thêm 2 ml dung dịch cố định,
ủ trong 15 - 30 phút, 4oC
Bước 5: ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn
Bước 6: thêm 2 ml dung dịch bảo quản,
ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn
Bước 7: tái huy n dịch trong 2 ml dung dịch bảo quản, lưu ở nhiệt độ 4oC, đi u kiện tối
Bảng 3: So sánh chất lượng mẫu xếp loại kiểu hình miễn dịch giữa có bảo quản và
không bảo quản
Tình trạng TB trong ống chứa mẫu sau 48 giờ Đông vón (10/10) TB phân tán đ u trong huy n dịch (10/10)
Phân tích xếp loại
kiểu hình miễn dịch
48 giờ
M t độ TB Nghèo TB (9/10) Giàu TB (10/10) Phân tách các
quần thể
Không phân tách được (4/10) Phân tách tốt (10/10) Tín hiệu các
dấu ấn
Hầu hết âm tính (4/10)
Kết quả âm tính và dương tính chính xác (10/10)
96 giờ
Phân tách các quần thể
Không phân tách được (10/10) Phân tách tổt Tín hiệu các
dấu ấn Âm tính (9/10)
Kết quả âm tính và dương tính chính xác (10/10)
7 ngày
M t độ TB Nghèo TB (10/10) Giàu TB (9/10) Phân tách các
quần thể
Không phân tách được (10/10) Phân tách tốt (10/10) Tín hiệu các
dấu ấn Âm tính (10/10)
Kết quả âm tính và dương tính chính xác (10/10)
Như v y, việc áp d ng quy trình bảo quản TB đã giúp lưu giữ được bệnh phẩm trong thời gian dài mà vẫn đảm bảo chất lượng Đây là yếu tố hết sức quan trọng vì nhi u trường hợp bệnh nhân cần lưu bệnh phẩm để phân tích vòng 2 với các dấu ấn đặc hiệu, quy trình bảo quản TB đã giúp giải quyết tốt vấn đ trên
Trang 7* Quy tr nh xếp loại miễn dịch hoàn chỉnh:
Qua các bước hoàn thiện trên, chúng
tôi thiết l p được quy trình phân loại miễn
dịch hoàn chỉnh bao gồm các bước cơ
bản sau:
- Bước xử lý mẫu bệnh phẩm bằng ly
giải hồng cầu
- Bước ủ và rửa kháng thể trước khi
phân loại miễn dịch
- Bước cố định và bảo quản bệnh phẩm
KẾT LUẬN
Thông qua các thử nghiệm, hoàn thiện
và kết quả thu được khi ứng d ng quy
trình xếp loại kiểu hình miễn dịch, chúng
tôi rút ra kết lu n:
- Đã xây dựng thành công quy trình xử
lý mẫu bệnh phẩm dùng cho xét nghiệm
xếp loại kiểu hình miễn dịch
- Các cải tiến then chốt trong quy trình gồm: ly giải hồng cầu trước khi ủ kháng thể, rửa bỏ kháng thể thừa trước khi phân tích trên máy TB dòng chảy, áp d ng dung dịch cố định và bảo quản TB
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Polysciences, Inc Flow-Fix, 1% Flow Fix
paraformaldehyde Fixative Kit Technical data Sheet 2011, 810, pp.1-4
2 Santa Cruz Biotechnology, Inc Flow
cytometry protocol 2012, pp.1-3
3 eBioscience Cell preparation for flow
cytometry Flow Cytometry - Best protocols
2013, pp.1-3
4 eBioscience Staining cell surface antigen
for flow cytometry Flow Cytometry - Best protocols 2013, pp.1-5
5 eBioscience RBC lysis Flow Cytometry -
Best protocols 2013, pp.1-4