Bài viết nghiên cứu tiến hành trên 16 mẫu máu không bảo quản được xử lý ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 16 tuần, hoặc đun ở 1000C. Tiến hành tách chiết ADN bằng hạt từ tính, nhân gen GADPH, điện di kiểm tra sản phẩm PCR.
Trang 168
TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH ADN TỪ CÁC MẪU BỊ PHÂN HỦY
TRONG THỰC NGHIỆM
Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang*
Nguyễn Minh Hải**; Ngô Trường Giang*
TÓM TẮT
Nghiên cứu tiến hành trên 16 mẫu máu không bảo quản được xử lý ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian 2 tuần, 4 tuần, 8 tuần và 16 tuần, hoặc đun ở 1000
C Tiến hành tách chiết ADN bằng hạt từ tính, nhân gen GADPH, điện di kiểm tra sản phẩm PCR Kết quả: các phản ứng PCR cho sản phẩm đặc trưng Như vậy, tách chiết ADN bằng hạt từ tính, các mẫu ADN bị biến tính một phần có đủ chất lượng ổn định, đủ điều kiện để có thể tiến hành các phân tích tiếp theo
* Từ khoá: Nhận dạng cá thể; Mini STRs; Tách triết, tinh sạch ADN
DNA EXTRACTION AND PURIFICATION FROM
EXPERIMENTALLY DEGRADED SAMPLES
SUMMARY
The study was carried out on 16 blood samples, which were not preserved for different period of time: 2 weeks, 8 weeks and 16 weeks in condition of 37 0 C temperature with 100% humidity, and in boiling water for 30 minutes, 2 hours, 4 hours and 5 hours DNA was extracted using both normal kit and magnetic particle based DNA IQ, Promega kit DNA samples were evaluated using Nano Drop 1000 DNA amplification for mini STR analysis was conducted using PowerPlex S5, Promega, USA Results: all mini STR markers were successfully amplified and informative thus it can be used for individual identification in case of samples partially degraded
* Key words: Individual identification; Mini-STRs; DNA extraction and purification
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong lĩnh vực ADN pháp y, nhiều
trường hợp mẫu bị biến tính sau một
thời gian nhất định hoặc bị biến tính do các tác nhân lý hóa khác nhau [3, 4] Chính vì vậy, việc tách chiết ADN đóng vai trò quan trọng để thu được mẫu ADN
* Học viện Quân y
** Viện Y học Hàng không
Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tranvankhoa@gmail.com)
Ngày nhận bài: 8/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/10/2013
Ngày bài báo được đăng: 7/11/2013
Trang 270
có đủ chất lượng và số lượng cho quá
trình phân tích tiếp theo (PCR) [2] Để
đánh giá, lựa chọn phương pháp tách
chiết ADN phù hợp, chúng tôi tiến hành
xử lý các mẫu máu trong những điều
kiện và thời gian khác nhau [1]
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
16 mẫu máu nghiên cứu được lấy và
chống đông bằng EDTA 5 ml/mẫu Chia
mẫu máu làm 2 lô: có biến tính và không
biến tính Cách thức xử lý như sau: mẫu
máu đối chứng: Không xử lý gì, bảo
quản ở nhiệt độ -800C cho đến khi tách
chiết Mẫu xử lý: tạo mẫu ADN biến
tính một phần bằng cách để mẫu trong
môi trường với thời gian dài (không bảo
quản) Xử lý tạo mẫu ADN biến tính
thực nghiệm theo mô hình của Dixon và
CS 2006 [3]: để mẫu ở môi trường 370
C với độ ẩm 100% trong thời gian 2 tuần,
8 tuần, 16 tuần Tạo mẫu ADN biến tính
một phần bằng tác nhân nhiệt độ ở 1000C
trong 30 phút, 2 giờ, 4 giờ và 5 giờ
2 Vật liệu nghiên cứu
Nhóm hóa chất dùng cho tách chiết
ADN: QIAamp ADN blood Mini Kit,
ADN-IQ system, promega Nhóm hóa
chất dùng cho PCR: đệm enzyme Taq
polymerase 10X, MgCl2 25 mM, dNTPs
5 mM, Taq polymerase 5 U/µl, nước cất khử ion và khử trùng, nhóm hóa chất dùng cho điện di agarose, đệm TBE, ethidium bromide Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng nhân gen và phân tích mini STR: powerplex S5 - promega, POP-4™ polymer (P/N 4352755), Hi-DiTM formamide (P/N 4311320), máy
ly tâm (Mikro 200 - Hittich, Đức), máy PCR 9700 (ABI, Mỹ), bộ điện di agarose: nguồn 300V, bể điện di (biorad, Mỹ), buồng thao tác PCR, block gia nhiệt, máy khuấy từ, máy định lượng Nanodrop, máy điện di mao quản 3130XL
3 Phương pháp nghiên cứu
* Tách chiết ADN:
Tách chiết bằng QIAamp ADN blood mini kit đối với mẫu không biến tính theo quy trình của nhà sản xuất
Tách chiết bằng ADN-IQ system,
promega đối với mẫu biến tính theo quy
trình như sau [5]:
+ Bước 1: chia nhỏ phần máu cho vào ống nghiệm
+ Bước 2: thêm lysis buffer, ủ 700
C trong 30 phút để hoà tan mẫu
+ Bước 3: ly tâm để loại bỏ bớt tạp chất
+ Bước 4: thêm hạt từ tính để tạo phức hợp "hạt từ tính-thành phần tích điện (-)"
Trang 371
+ Bước 5: đặt ống nghiệm vào giá từ
tính để lọc lấy phức hợp
+ Bước 6: rửa nhiều lần bằng wash
buffer để thu phức hợp "hạt từ tính -
ADN"
+ Bước 7: để khô ở nhiệt độ phòng để
loại bớt nước
+ Bước 8: thêm elution buffer và ủ ở
650C trong 5 phút để tách ADN ra khỏi
hạt từ tính
+ Bước 9: thu dung dịch ADN
Sau khi thu được mẫu ADN, chúng
tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ
tinh khiết của sản phẩm bằng phương
pháp định lượng trên máy đo quang phổ
Nanodrop
* Phương pháp định tính, định lượng
ADN:
Sản phẩm ADN thu được sau quá
trình tách chiết được định lượng trên
máy Nanodrop ở bước sóng 260/280 nm
nhằm kiểm tra độ tinh sạch 5 μl mỗi
mẫu ADN sau tách chiết cũng được điện
di trên gel agarose để kiểm tra chất lượng
ADN Những mẫu có nồng độ thấp tiến
hành nhân gen GADPH và điện đi để
đánh giá khả năng nhân gen với cặp mồi
F-5’CCCCACACACATGCACTTACC-3’;
R-5’CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’
* Phản ứng PCR nhân gen mini STR:
Thành phần phản ứng PCR: Powerplex S5 5X Master Mix 5 µl, Power Plex S5 10X Primer Pair Mix 2,5 µl, ADN khuôn 0,25 - 0,50 ng, nước cất vừa đủ 25 µl [6]
Nhân gen trên máy PCR 9700 (ABI -
Mỹ) theo chu trình nhiệt
NHIỆT ĐỘ THỜI GIAN SỐ CHU KỲ
96oC 2 phút 1 chu kỳ
94oC 30 giây
30 chu kỳ
60oC 2 phút
72oC 90 giây
60oC 45 phút 1 chu kỳ
Điện di mao quản tự động trên hệ thống máy giải trình tự AB 3130XL, phân tích alen: thêm 1 µl sản phẩm PCR hoặc 1 µl của PowerPlex® S5 Allelic Ladder Mix Biến tính 95 trong 3 phút, sau đó để ngay trong đá 3 phút trước khi tra mẫu điện di
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Kết quả tách chiết ADN
Đối với lượng máu, do hàm lượng ADN lớn nên khi tách xong, tiến hành kiểm tra nồng độ ADN trên máy Nano Drop, điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm trong dung dịch EtBr 10 µg/ml, sau đó quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm
Trang 472
Bảng 1: Kết quả đo nồng độ và độ
tinh sạch ADN tách từ 16 mẫu máu không
bị biến tính
MẪU
NỒNG
ĐỘ
ADN
(µg/µl)
A
260 /A
280 MẪU
NỒNG
ĐỘ ADN (µg/µl)
A
280
Từ kết quả trên ta thấy, nồng độ ADN
khá cao, tỷ số A260/A280 là chỉ số để đánh
giá độ tinh sạch của ADN, nằm trong
khoảng 1,6 - 1,8: chứng tỏ ADN có độ
sạch cần thiết cho nghiên cứu phân tích
tiếp theo Với các mẫu này, chúng tôi
cũng điện di agarose kiểm tra cho thấy
kết quả tốt (hình 1) Như vậy, cũng có
thể đánh giá quy trình tách chiết ADN
không bị biến tính, có thể khẳng định
dùng kit thông thường hoàn toàn tốt
Hình 1: Ảnh điện di kiểm tra ADN trên
gel agarose 0,8% với các mẫu không biến
tính được tách bằng kit thông thường
Bảng 2: Kết quả đo nồng độ tinh
sạch ADN tách chiết từ 16 mẫu máu biến tính do nhiệt độ 1000C trong 5 giờ
MẪU
NỒNG
ĐỘ ADN (µg/µl)
NỒNG
ĐỘ ADN (µg/µl)
A 260 /A 280
1 1,57 1,63 9 1,67 1,60
2 2,29 1,78 10 2,64 1,66
3 3,01 1,76 11 3,39 1,81
4 1,48 1,62 12 2,22 1,75
5 1,77 1,92 13 1,86 1,81
6 2,89 1,75 14 3,33 1,85
7 2,61 1,93 15 1,55 1,64
8 2,90 1,90 16 2,23 1,72 Mặc dù mẫu bị biến tính thu được nồng độ thấp hơn các mẫu không bị biến tính, nhưng vẫn đảm bảo tinh sạch Đối với mẫu máu bị biến tính một phần bằng thực nghiệm, tiến hành tách chiết thu ADN bằng hạt từ tính Sau tách chiết, điện di gel agarose kiểm tra không thấy xuất hiện băng Để đánh giá khả năng nhân gen, chúng tôi sử dụng mồi GAPDH
để nhân gen này, sản phẩm PCR có kích thước 97 bp Dưới đây là hình ảnh điện
di kiểm tra sản phẩm sau PCR
Hình 2: Ảnh điện di mẫu biến tính tách
bằng kit thông thường
Trang 573
Từ trái sang phải: chứng âm, chứng
dương, marker ADN 100 bp, 2 mẫu biến
tính 8 tuần: 1 mẫu (+), 1 mẫu (-), mẫu
biến tính nhiệt 30 phút (+), 3 mẫu biến
tính nhiệt 5 giờ đều (-)
Hình 3: Ảnh điện di mẫu biến tính tách
bằng hạt từ tính
Từ trái sang phải: chứng âm, chứng
dương, marker ADN 100 bp Hàng trên:
các mẫu biến tính 8 tuần và biến tính
nhiệt 5 giờ; hàng dưới: các mẫu biến tính
nhiệt 5 giờ
Hình 4: Ảnh điện di mẫu biến tính tách
bằng hạt từ tính
Từ trái sang phải: chứng âm, chứng dương, marker ADN 100 bp Hàng trên: các mẫu biến tính 8 tuần; hàng dưới các mẫu biến tính 16 tuần
2 Kết quả bước đầu xác định kiểu gen của các locus STR trên máy giải trình tự gen
Với các mẫu ADN thu được, tiến hành phản ứng nhân gen để xác định khả năng nhân gen và phân tích mini STR Sử dụng
bộ kit nhân gen Powerplex S5 PCR Amplification kit Đây là bộ kit cho phép đồng khuếch đại và phát triển 5 locus bao gồm cả D8S1179, D18S51, FGA và TH01 Đối với các mẫu này, sau khi chạy điện di kết quả thu được xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2 Phần mềm này
sẽ so sánh kích thước các băng ADN thu được ở mẫu nghiên cứu với những băng tương ứng trên thang alen chuẩn và cho kết quả chi tiết về kiểu gen của từng locus như hình minh họa ở hình sau
Hình 5: Hình ảnh điện di của mẫu số 2
không bị biến tính
Trang 674
Hình 6: Ảnh điện di của mẫu số 2 bị
biến tính một phần do nhiệt độ
Các locus mang kiểu gen dị hợp tử sẽ
có hai băng có kích thước khác nhau,
còn các locus có kiểu gen đồng hợp tử
thì thu được một băng duy nhất
Khi tiến hành điện di huỳnh quang
với mẫu số 02 không bị biến tính, thu
được các thang alen đặc trưng cho từng locus ở từng dye khác nhau, đem so sánh với thang alen chuẩn sẽ xác định được kiểu gen Nhìn vào hình 5 thấy các locus Amello, D18S51, TH01, FGA là dị hợp
tử khi thực hiện điện di xuất hiện 2 băng khác nhau, còn locus D8S1179 là đồng hợp tử khi tiến hành điện di xuất hiện một băng duy nhất Tiến hành điện di tương tự mẫu số 02 bị biến tính do nhiệt
độ thể hiện ở hình 6, thấy kích thước của băng điện di thấp hơn so với kích thước điện di của mẫu không bị biến tính nhưng vẫn có thể xác định được kiểu gen Qua phân tích, chúng tôi thu được bảng số liệu gồm kiểu gen các alen của từng locus của mẫu không bị biến tính,
bị biến tính do nhiệt độ và bị biến tính
do môi trường (số liệu trình bày chung cho các điều kiện biến tính)
Bảng 3: Kiểu gen dựa trên marker mini STR của 16 mẫu
Trang 775
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11)
Kết quả nghiên cứu này với mẫu bình thường và mẫu bị biến tính trong những điều kiện khác nhau đều thu được thông tin cần thiết Như vậy, có thể kết luận phương pháp tách chiết đối với những mẫu bị biến tính hoàn toàn tốt Một số tác giả
đã sử dụng tách bằng hạt từ cũng cho kết quả tốt [1] Các locus gen có tỷ lệ dị hợp tử cao, bước đầu có thể đánh giá khả năng nhận dạng trên mẫu nghiên cứu
KẾT LUẬN
Qua tách chiết và đánh giá chất lượng
16 mẫu ADN bị phân huỷ một phần thực
nghiệm, chúng tôi rút ra kết luận: sử
dụng phương pháp tách chiết bằng hạt từ
tính đối với mẫu ADN bị phân huỷ một
phần có thể thu được mẫu ADN đủ điều
kiện để cho phân tích mini STR trong
công tác nhận dạng cá thể
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Barbara Haak, Andrea Porsche, Kai
Vollack, Peter Zimmermann, Werner Pflug
Evaluation of a semi-automated, magnetic
bead-based DNA extraction method for genetic
fingerprinting of forensic casework samples
Forensic Science International: Genetics
Supplement Series 1 2008, pp.35-36
2 Carracedo A and Lareu MV Proceedings
of the ninth international symposium on human indentification Madison WI: Promega corporation 1998, pp.89-107
3 Dixon LA, Dobbins AE, Pulker HK et al
Analysis of artificially degraded DNA using STRs and SNPs - results of a collaborative European (EDNAP) exercise Forensic Science International 2006, 164, pp.33-44
4 Madisen L, Hoar DI, Holroyd CD, Crisp M, ADN Hodes ME DNA Banking:
the effects of storage of blood and isolated DNA on the integrity of DNA Am Z Med Genet 1987, 27, p.379
5 Promega Technical Bullentin for use
with DNA IQ
6 Promega Technical manual PowerPLexS5
System