Bài viết tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm lipid tế bào bạch cầu người bằng phẩm màu sudan B dùng trong xét nghiệm để phân loại dòng tế bào ung thư máu. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
Trang 160
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA pH DUNG DỊCH ĐỆM
VÀ NỒNG ĐỘ SUDAN B ĐỐI VỚI PHẢN ỨNG
NHUỘM LIPID BẠCH CẦU NGƯỜI
Trần Văn Tính*
TÓM TẮT
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nhuộm màu lipid bạch cầu người bằng sudan B Quy hoạch
hóa thực nghiệm theo mô hình mặt hai nhân tố: pH (X 1 ) và nồng độ sudan B (X 2 ); hàm mục tiêu
là điểm nhuộm lipid (Y) bằng phần mềm Modde 5.0 Phương trình hồi quy thu được: Y = 362,7
+ 5,2 x X 1 -10.5 x X 2 - 26,3 x X 1
2 (R2 = 0,985 với p > 0,95) và điều kiện nhuộm tối ưu: Nồng độ sudan B là 0,20% pha trong dung dịch đệm với pH = 7,42 Hiệu suất nhuộm tốt nhất trong điều
kiện tối ưu tìm được 95,10 ± 1,0% (p = 0,95)
* Từ khóa: Nhuộm hóa học tế bào; Nhuộm sudan B; Nhuộm lipid
EFFECT OF pH AND B SUDAN SOLUTION ON LIPID STRAINING OF HUMAN LEUKOCYTE
SUMMARY
Trang 261
A research was conducted on the optimal conditions for the lipid of human leukocyte with sudan
B solution Experiments were designed by response surface modeling with two factors: pH (X 1 ) and sudan B concentrate (X 2 ) to target lipid score function; Regression equation presents dependence
of lipid score on two factors quoted above as: Y = 362.7 + 5.2 x X 1 -10.5 x X 2 - 26.3 x X 12 (R 2 = 0.985 with p > 0.95) and the optimal conditions of the lipid staining as: pH = 7.42, sudan B 0,20% The best efficiency of the lipid staining in the above optimal conditions is found to be 95.10 ± 1.0% (p = 0.95)
* Key words: Cytochemistry; Sudan B staining; Lipid staining
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lipid có trong tế bào bạch cầu người là
este của axít béo với ancol Xác định các
lipid này bằng phản ứng màu với nhiều
loại phẩm màu: dầu đỏ, scharlach R,
rodamin B, nile blue, sudan Cơ chế của
phản ứng màu rất khác nhau, bao gồm khuếch tán vật lý đơn thuần hoặc liên kết hóa học trực tiếp Trong các loại thuốc nhuộm, sudan là một nhóm phẩm nhuộm được ưa chuộng để nhuộm lipid
từ vàng (sudan III) đến đen (sudan B) [3]
* Bệnh viện 19-8
Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Tính (tranvantinh@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 17/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/07/2014
Ngày bài báo được đăng: 11/08/2014
Đối với máu ngoại vi, phản ứng nhuộm
sudan B cho kết quả bạch cầu hạt dương
tính mạnh, monoxit dương tính yếu,
lymphoxit và hồng cầu âm tính Trong tủy
xương bình thường, các tế bào dòng tủy
dương tính từ tiền tủy bào đến tế bào
trưởng thành, dòng monoxit chỉ dương
tính ở tế bào trưởng thành; mẫu tiểu cầu
và tiểu cầu dương tính ở các giai đoạn
Trong nhiều trường hợp mắc bệnh bạch
cầu cấp, có thể phân biệt tương đối rõ
dòng tủy và những dòng tế bào khác bằng
kết quả nhuộm sudan B Kết quả dương
tính sudan B của mẫu bệnh phẩm thường
cho kết quả dương tính với kỹ thuật nhuộm
peroxydase Chính vì vậy, kết quả nhuộm
sudan B là một trong những tiêu chuẩn
được ứng dụng để phân loại thể bệnh
trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB [2]
Chayen (1968) cho rằng, mức độ bắt màu chọn lọc của các thuốc nhuộm đối với lipid phụ thuộc rất nhiều vào bản chất lipid và đặc tính của thuốc nhuộm, thuốc điều trị, hormon và điều kiện tiến hành nhuộm [3] Phản ứng nhuộm sudan B nói riêng và nhuộm lipid nói chung có thể cho kết quả tương đối khác nhau trong từng điều kiện cụ thể Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra điều kiện tối ưu để tiến hành phản ứng, nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt
kỹ thuật, nâng cao chất lượng nhuộm và giảm chi phí là vấn đề có ý nghĩa khoa học
và thực tiễn cần thiết Mục tiêu của công
trình này: Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình
nhuộm lipid tế bào bạch cầu người bằng
Trang 362
phẩm màu sudan B dùng trong xét nghiệm
để phân loại dòng tế bào ung thư máu
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng, dụng cụ và hóa chất
nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu: bạch cầu lấy
từ máu của người khoẻ mạnh có chứa
lipid Máu sau khi lấy từ tĩnh mạch, tiến
hành dàn 14 tiêu bản không qua chống
đông, để khô trong điều kiện tự nhiên và
cố định ngay
* Dụng cụ: máy ủ nhiệt CW-20G 0 - 500C,
kính hiển vi Nikon với độ phóng đại 1.000
lần, pipet tự động của Hãng Thermo kèm
đầu côn 0,2, 1,0 và 10 ml của Hãng Gilson
* Hóa chất: sudan B (Hãng
Sigma-Aldrich); phenol (Hãng Sigma-Sigma-Aldrich);
axít citric 99,5% (Hãng Sigma-Aldrich);
formaldehyd 37% ACS 99,5% (Hãng
Sigma-Aldrich); ethanol 96% (Hãng
Sigma-Aldrich); aceton ACS 99,5% (Hãng
Sigma-Aldrich); Giemsa (Hãng Sigma-Aldrich)
- Pha chế thuốc thử:
+ Dung dịch cố định tiêu bản:
++ Dung dịch citrat: 25 ml (lấy từ dung
dịch 18 mmol axÝt citric + 9 mmol natri citrat
và 12 mmol NaCl trong 1 lít)
++ Acetone 99,5%: 65 ml
++ Focmaldehyd 37%: 8 ml
+ Dung dịch đệm phenol-phosphat với
pH được pha theo bảng 1: phenol 16% và
0,1 M
+ Dung dịch nhuộm sudan pha theo bảng 1 trong ethanol 96% và đệm phenol-phosphat ở trên theo tỷ lệ 6:4
+ Dung dịch nhuộm nhân: Giemsa
2 Phương pháp nghiên cứu
* Thiết kế thực nghiệm:
Thí nghiệm được thiết kế theo mô hình khảo sát mặt mục tiêu (Response Surface
(The Central Composite Face - CCF) 2 nhân tố trên phần mềm MOD5 Mỗi nhân
tố gồm 3 mức: ở tâm (d = 0), ở đỉnh (1)
và ở mặt (d) Mô hình gồm 11 thí nghiệm:
4 thí nghiệm ở đỉnh, 4 thí nghiệm điểm sao nằm ở mặt không gian mỗi nhân tố
và 3 thí nghiệm lặp ở tâm Thiết kế quy hoạch hóa thực nghiệm gồm 2 biến là pH dung dịch đệm (X1) và nồng độ sudan B
nhân tố này lên hàm mục tiêu (Y) là điểm nhuộm tuân theo phương trình:
Y = b 0 + b 1 X 1 + b 2 X 2 + b 1 (X 1 )2 + b 2 (X 2 )2 + b 12 X 1 X 2 Các điều kiện mã hóa để nhập dữ liệu
vào chương trình phần mềm (bảng 1):
Bảng 1: Ký hiệu và mức mã hóa thực
nghiệm
* Kỹ thuật tiến hành nhuộm:
Trang 463
định tiêu bản ở trên với thời gian 30 giây
Sau đó, gói và đưa các tiêu bản vào hộp
(thời gian bảo quản có thể kéo dài 2 tháng
[8])
- Nhúng tiêu bản vào dung dịch nhuộm
sudan ở trên với nồng độ và pH khác nhau
theo quy hoạch thực nghiệm ở bảng 1 trong
30 phút Sau đó, rửa tiêu bản dưới vòi
nước 5 phút, để khô
10% trong 15 phút và để khô
- Đọc tiêu bản dưới vật kính dầu với độ
phóng đại 1.000 lần
Các vùng có chứa lipid trong nguyên
sinh chất bạch cầu sẽ xuất hiện hạt bắt
màu đen Đối với dòng tủy tế bào càng
trưởng thành, mức độ dương tính càng
mạnh Đối với dòng lympho bình thường
âm tính
Đánh giá bạch cầu trung tính dương tính thành 5 mức độ:
Độ 0: không có hạt bắt màu đen
Độ 1: ít hạt trên nguyên sinh chất, hạt mịn nhỏ, không có hạt trên nhân tế bào
Độ 2: nhiều hạt to trên nguyên sinh chất, không có hạt trên nhân tế bào
Độ 3: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào, nền xấu
Độ 4: nhiều hạt to trên toàn bộ tế bào, nền đẹp
Công thức tính điểm nhuộm: ∑Y (điểm) = Y0 x 0 + Y1 x 1 + Y2 x 2 + Y3 x 3 + Y4 x 4 Như vậy, phản ứng nhuộm sẽ đạt tối
ưu khi toàn bộ tế bào bạch cầu trung tính dương tính ở độ 4, tổng điểm tối đa 400
và hiệu suất đạt 100%
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 2: Kết quả thực nghiệm nhuộm sudan theo theo mô hình khảo sát mặt mục tiêu
Trang 564
Nhập kết quả vào phần mềm Modde 5.0 qua xử lý, được phương trình hồi quy:
* Độ tin cậy thống kê của các biến số:
Bảng 3: Hệ số và độ tin cậy thống kê của các hệ số
Chạy chương trình tối ưu thu được điều kiện tối ưu với pH = 7,419 và nồng độ sudan
là 0,20 g%, khi đó dự đoán điểm nhuộm đạt 376,1 Kết quả tối ưu hóa được trình bày ở bảng 4 và hình 1, hình 2
Trang 665
Bảng 4: Tối ưu hóa theo phương trình
hồi quy
Hình 1: Sơ đồ đường đồng mức mặt tối ưu
Hình 2: Mặt tối ưu thực nghiệm
Để khẳng định điều kiện tối ưu thu được
ở trên sẽ cho hiệu suất nhuộm cao nhất,
đã tiến hành nhuộm 3 thí nghiệm
Bảng 5: Kết quả thí nghiệm lặp lại ở
điều kiện tối ưu
Sau khi xử lý dữ liệu bằng chương trình
thống kê SPSS 18, thu được khoảng giới
hạn hiệu suất nhuộm trung bình khá cao:
95,10% ± 1,0 (p = 0,95)
Hình 3: Hình ảnh nhuộm lipid bạch cầu ở
điều kiện tối ưu với sudan B
BÀN LUẬN
- Về pH dung dịch đệm:
pH của dung dịch nhuộm có vai trò quan trọng trong phản ứng nhuộm, quyết định tốc độ khuếch tán và giữ nguyên hình thái của tế bào cũng như lipid ở trạng thái
tự nhiên Để phản ứng xảy ra tốt nhất, dung dịch sudan B được pha chế trong môi trường có độ pH trung tính hoặc kiềm nhẹ, phenol có trong dung dịch đóng vai trò như chất cố định màu [4] Kết quả thu được của nghiên cứu (pH = 7,42) tương đương với công bố của Hayhoe, Sheehan và Storey (pH = 7,4) [1, 3, 4]
- Nồng độ của sudan B:
Nồng độ sudan B quyết định khả năng khuếch tán từ dung môi vào tổ chức mỡ
Sudan B nhuộm màu lipid theo 2 cơ chế:
khuếch tán vật lý đơn thuần và liên kết hóa học 2 nhóm amino của sudan B phản
Trang 766
ứng với các nhóm axít của lipid Nồng độ
sudan B (0,20 g%) tối ưu thu được nhỏ
hơn 18,9 lần so với kết quả của Hayhoe
[1, 3, 4]
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu thực nghiệm theo mô
hình khảo sát mặt mục tiêu 2 biến số, đã
tìm được điều kiện tối ưu của phản ứng
nhuộm sudan B: pH dung dịch đệm nhuộm
bằng 7,419 và nồng độ sudan B là 0,2%
Quy trình tìm được đạt hiệu suất nhuộm
95,10% ± 1,0 (p = 0,95), tạo điều kiện để
có thể triển khai rộng kỹ thuật này trong
phòng xét nghiệm huyết học ở Việt Nam
với giá thành thấp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Viện Huyết học-Truyền máu Kỹ thuật xét
nghiệm Huyết học-Truyền máu NXB Y học Hà Nội 1984
2 Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al
Proposals for the classification of the acute leukaemias, French-American-British (FAB)
co-operative group J Haematol 1976, 33 (4),
pp.451-458
3 F.G.J Hayhoe & D Quaglino Haematological
cytochemistry, Churchill Livingstone, London
1994
4 Sir John V Dacie; S.M Lewis Practical
Haematology Longman Group Ltd, Hong Kong
1994