Phát hiện đột biến gen p53 ở bệnh nhân ung thư vú qua nhuộm hoá mô miễn dịch và giải trình tự gen

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định tỉ lệ đột biến gen p53 (exon 5-8) ở bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú bằng phương pháp giải trình tự gen và sự biểu hiện protein p53 bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC). Phát hiện đột biến gen p53 ở bệnh nhân ung thư vú qua nhuộm hoá mô miễn dịch và giải trình tự gen

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN P53 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ

QUA NHUỘM HOÁ MÔ MIỄN DỊCH VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Đỗ Thị Thanh Thủy*, Hoàng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung*

TÓM TẮT

Mở đầu: Ung thư vú đứng hàng thứ ba trong các loại ung thư trên thế giới Tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ tử vong

thay đổi tùy từng quốc gia Ung thư vú liên quan đến nhiều loại biến đổi di truyền khác nhau ở tế bào sinh dưỡng, như đột biến ở gen sinh khối u và gen ức chế khối u Ngoài ra, yếu tố môi trường cũng tác động lên bệnh căn của ung thư vú Ngày nay, trong ung thư vú, các đột biến gen được nghiên cứu nhiều, nhất là ở gen ức chế khối u p53 với tỉ lệ gặp khoảng 30% Một số nghiên cứu đánh giá vai trò của đột biến gen p53 trong tiên lượng bệnh ung thư vú đã gây nhiều tranh cãi Nhiều nghiên cứu cũng đã cố gắng nhận diện giai đoạn phát sinh ung thư vú mà tại đó đột biến p53 ở các tế bào sinh dưỡng xảy ra Phối hợp phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch protein P53 và xác định đột biến gen p53 bằng phương pháp giải trình tự có thể giúp đánh giá được được mối tương quan giữa đột biến gen p53 với kiểu biểu hiện của protein P53, tiên lượng sống cũng như đưa ra phương pháp trị liệu thích hợp cho bệnh nhân

Mục tiêu: Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 (exon 5-8) ở bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú bằng phương pháp

giải trình tự gen và sự biểu hiện protein p53 bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC)

Phương pháp: Nghiên cứu cắt ngang trên 100 bệnh nhân được chẩn đoán carcinôm tuyến vú tại Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y Dược trong thời gian từ tháng 06/2008 đến tháng 6/2010 Sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch để xem xét sự tích tụ protein p53 trong nhân tế bào và kỹ thuật giải trình tự gen để xác định tình trạng đột biến gen p53 Phân tích mối tương quan giữa tình trạng đột biến gen p53 và tình trạng tích tụ protein p53 trong nhân tế bào

Kết quả: Trong các mẫu mô của bệnh nhân được chẩn đoán carcinoma tuyến vú, tỷ lệ biểu hiện tích tụ protein P53 trong nhân tế bào là 57% Gen p53 (exon 5 - exon 8) được phân tích bằng phương pháp giải trình tự,

tỉ lệ đột biến là 28%, đột biến xảy ở exon 5 chiếm tỉ lệ cao nhất (69,4%) Đột biến nhầm nghĩa chiếm tỉ lệ 91,6% Đột biến xảy ra chủ yếu ở vị trí thứ 1 và thứ 2 (100%) của mã di truyền 33% đột biến xảy ra trong vùng trình

tự bảo tồn của gen và 25% đột biến xảy ra trong vùng CpG Đột biến xảy ra ở codon 175 chiếm 5,6% Đột biến Tyr163Cys chiếm 14% Đột biến xảy ra cao nhất trong vùng L2/L3 (36%) và L1/S/H2 (17%) Sự tương đồng giữa đột biến gen p53 với sự tích tụ quá mức protein P53 trong nhân tế bào là 19% Tỉ lệ tương đồng giữa biểu hiện protein p53 và tình trạng đột biến gen p53 là 53% 33 % số mẫu có XN HMMD dương tính có sự biến đổi trình tự gen p53 và 68% số mẫu biến đổi gen p53 có XN HMMD dương tính Liên quan của biểu hiện protein P53 và đột biến gen p53 với các đặc điểm của carcinôm tuyến vú như nhóm tuổi, loại mô học, độ mô học, và tình trạng hạch đều không có sự khác biệt

Kết luận: Tỷ lệ biểu hiện tích tụ protein P53 trong nhân tế bào carcinôm tuyến vú (IHC) là 57% và tỉ lệ đột

biến gen p53 qua kỹ thuật giải trình tự là 28% Tỷ lệ tương đồng giữa biểu hiện protein p53 và tình trạng đột biến gen p53 là 53% 33 % số mẫu có XN HMMD dương tính có sự biến đổi gen p53 và 68% số mẫu có biến đổi gen p53 có XN HMMD dương tính

Từ khóa: Đột biến gen, biểu hiện gen, P53, carcinôm tuyến vú

* Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh

ABSTRACT

DETECTING P53 GENE MUTATIONS OF BREAST CANCER BY IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND

DIRECT SEQUENCING TECHNIQUES

Do Thi Thanh Thuy, Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung

* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 2 - 2011: 98 - 106

Background: Breast cancer is the third leading cancer on the world The incidence and the mortality rates

vary depending on countries Breast cancer is associated with types of somatic genetic alterations such as mutations in tumor suppressor genes and oncogenes Environmental agents have also affected to etiology of breast cancer Now, studies have paid attention on gene mutations, especially p53 gene mutations Some studies assessing the prognostic and predictive roles of p53 alterations in breast cancer have conflicting results Many studies try to identify the stages which breast cancer’s development and progression occur involving in mutations

of p53 gene in somatic cells Dectecting the pattern of p53 gene mutations in breast cancer by DNA sequencing and immunohistochemistry methods may be help to assess the correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation, the prognosis the survival as well as having suitable treatment for patients

Aims: - Identify the rate of p53 gene mutations (from exon 5 to exon 8) and p53 protein accumulation in the

tissues of breast diagnosed adenocarcinoma by immunohistochemistry and DNA sequencing - Determine the correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation in cell nuclei

Method: Cross Sectional Study on 100 patients who were diagnosed adenocarcinoma of breast at University

of Medicine and PharcmacyDepartment of Pathology, HCMC from June 2008 to June 2010 Using Immunohistochemistry and DNA sequencing methods to identify p53 protein accumulation and mutations of p53 gene Analysis of correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation in cell nuclei

Results: Overexpressions of p53 protein is 57% and p53 gene mutations is 28% inwhich mutations in exon

5 has highest rate with 69,4% Missense mutations has rate of 91,6% Mutated sites usually occufy at number 1 and number 2 of codon 33% mutations is in conserved region and 25% in CpG region Mutation at codon 175 is 5,6% and mutation at codon 163 (Tyr163Cys) is 14% Mutation at L2/L3 region is 36$ and L1/S/H2 region is 17% The rate of the samples with both p53 gene mutated and overexpression of p53 protein is 19% The correlation between p53 gene mutation status and p53 protein accummulation status is 53% 33% of samples which have IHC (+) has p53 gene mutation and 68% of samples which have p53 gene mutation has IHC (+) The relation between IHC (+), p53 gene mutation and the characteristics od breast cancer such as age group,types of histology, histological grade and nodular status are not significantly diffirent

Conclusion: Over expressions of p53 protein is 57% and p53 gene mutations is 28% The correlation

between p53 gene mutatin and p53 protein accummulation is: 33% of samples which have IHC (+) has p53 gene mutation and 68% of samples which have p53 gene mutation has IHC (+)

Key words: gene mutation, gene expression, p53, adenocarcinoma of breast

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú đứng hàng thứ nhất trong các

loại ung thư ở Việt Nam Tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ

tử vong thay đổi tùy từng quốc gia Mỗi năm có

hơn 1.000.000 trường hợp mới mắc bệnh được

chẩn đoán Mặc dù tỉ lệ mắc bệnh tăng trong

vòng 20 năm qua, nhưng tiên lượng của bệnh

được cải thiện nhiều vì được chẩn đoán sớm và

điều trị tích cực chống lại tình trạng di căn hệ thống Ung thư vú liên quan đến nhiều loại biến đổi di truyền khác nhau ở tế bào sinh dưỡng, như đột biến ở gen sinh khối u và gen ức chế khối u Ngoài ra, yếu tố môi trường tác động lên bệnh căn của ung thư vú Ngày nay, trong ung thư vú, các đột biến gen được nghiên cứu nhiều nhất là ở gen ức chế khối u p53 với tỉ lệ gặp

khoảng 30% Một số nghiên cứu đánh giá vai trò

của đột biến gen p53 trong tiên lượng bệnh ung

thư vú đã gây nhiều tranh cãi Nhiều nghiên

cứu cũng đã cố gắng nhận diện giai đoạn phát

sinh ung thư vú mà tại đó đột biến p53 ở các tế

bào sinh dưỡng xảy ra Hai phương pháp phân

tích đột biến gen p53 là giải trình tự gen p53 và

hóa mô miễn dịch (IHC) xem xét sự biểu hiện

protein p53 Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi

thực hiện giải trình tự gen p53 từ exon 5-8 là

vùng tập trung tỉ lệ đột biến cao nhất, đồng thời

phân tích sự biểu hiện protein p53 ở các bệnh

nhân này bằng phương pháp hóa mô miễn dịch

(IHC)

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Đối tượng nghiên cứu

100 bệnh nhân được chẩn đoán carcinôm

tuyến vú tại Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y

Dược trong khoảng thời gian từ tháng 06/2008

đến tháng 6/2010 với đầy đủ hồ sơ bệnh án

Phương pháp nghiên cứu

Kỹ thuật hoá mô miễn dịch về sự biểu hiện của

protein P53

Bệnh phẩm

Mẫu mô carcinôm tuyến vú được cố định

trong formol đệm trung tính từ 6 – 48 giờ và vùi

trong paraffin

Kháng thể được sử dụng

Kháng thể DO-7 của nhà sản xuất

DakoCytomation, Đan Mạch, với độ pha loãng 1/25

Đọc kết quả và đánh giá dưới kính hiển vi quang học

Về sự biểu hiện tích tụ quá mức protein

TP53, dựa vào tỷ lệ % nhân tế bào bắt màu và

đậm độ bắt màu: 0 (không bắt màu hoặc <10%

bắt màu); 1(+) (bắt màu nhạt > 10%); 2(+): (bắt

màu trung bình > 10%); 3(+): bắt màu đậm >

10%; Âm tính: 0; Dương tính: 1(+), 2(+), 3(+) với

chứng dương là mô carcinôm tuyến vú có mức

biểu hiện protein P53 đã biết dương tính (3+)

trước đó và chứng âm là không phủ kháng thể thứ nhất

Kỹ thuật giải trình tự phát hiện đột biến gen P53

Tách chiết DNA từ bệnh phẩm

Thu hoạch tế bào từ mô vùi nến bệnh phẩm carcinôm tuyến vú Sau khi đã được chẩn đoán giải phẫu bệnh, vùng mô ung thư được đánh dấu trên tiêu bản HE Đối chiếu với tiêu bản HE, đánh dấu vùng mô ung thư trên tiêu bản trắng và lấy vùng tế bào ung thư vào tube ly tâm 1,5ml

Tách chiết DNA từ mô CRC bằng QIAkit

PCR khuyếch đại đoạn gen p53 chứa exon 5-8:

GGTTGCAGGAGGTGCTTACA-3’ và p53g8R5’- GTGCTAGGAAAGAGGCAAGG-3 để khuyếch đại đoạn DNA chứa các exon 5-8 có kích thước 1741bp từ hệ gen DNA đã li trích

Thành phần phản ứng: 5 µl 10X PCR buffer, 5 µl 2,5 mM dNTP, 2,5 µl p53g5F2 (10µM), 2,5 µl p53g8R (10µM), 0,3 µl Takara Tag TM HS, 2,5 µg DNA

Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR trên gel agarose với thang chuẩn Ready-LoadTM 1 Kb Plus DNA Ladder để xác định kích thước của sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng kit GFX của QIAgen

PCR trước giải trình tự và kết tủa DNA bằng ethanol

Tiến hành PCR giải trình tự các sản phẩm PCR đã tinh sạch trên bằng 1 mồi xuôi hoặc 1 mồi ngược, tạo ra một lượng lớn các đoạn DNA chồng lắp nhau hơn kém nhau 1 nucleotid, có nucleotide cuối cùng gắn 1 chất bắt màu đặc hiệu sẽ phát huỳnh quang dưới đèn laser

Thành phần phản ứng PCR

4 µl Big Dye terminator V.3.1, 0.3 µl mồi (10

μM), 12,7 μl đệm giải trình tự 1X, 3 μl PCR đã

tinh sạch Các mồi dùng cho giải trình tự

P53g5F2-GGTTGCAGGAGGTGCTTACA,

P53,5-6R -CACTGACAACCACCCTTAAC, P53seq7F

– GGCCTCCCCTGCTTGCCACA, P53g8R –

TGCTAGGAAAGAGGCAAGG Toàn bộ sản

phẩm PCR giải trình tự này được thu lại theo

phương pháp kết tủa bằng ethanol và hòa tan

tủa DNA trong dung dich TE hay nước cất

Giải trình tự các sản phẩm PCR

Mỗi đoạn DNA khoảng 500-600bp được giải

trình tự 2 chiều bằng mồi xuôi và mồi ngược

trên máy ABI 3100 Genetic Analyser Kết quả

giải trình tự được đọc bằng chương trình

Sequencing Analysing v.2.5 Sau đó, dùng phần

mềm SeqCap để so với trình tự chuẩn

NC_000017.10 trên GenBank, xác định sự biến

đổi nucleotid thuộc exon nào, codon nào, là

SNP hay đột biến, là đột biến loại nào Các dữ

liệu đột biến được tra cứu theo dữ liệu của

IARC, dữ liệu về SNP của gen p53 được tra cứu

trên hệ thống dữ liệu của NCBI

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu

Tuổi

Nghiên cứu này khảo sát các bệnh nhân ung

thư vú từ 29 đến 74 tuổi, trung bình là 40,5 (±

9,9) tuổi, tập trung chủ yếu ở độ tuổi từ 30-39,

chiếm tỉ lệ 51%

Bảng 1 Tuổi của bệnh nhân nhóm nghiên cứu

Tuổi 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 ≥ 70 TC

Tỉ lệ % 8% 51% 29% 5% 5% 2% 100%

Hóa mô miễn dịch

Biểu hiện của protein P53 qua kết quả HMMD

Bảng 2 Biểu hiện của protein p53 qua kết quả

HMMD

Âm tính 43 43,0

Tổng cộng 100 100,0

Tỉ lệ không tích tụ protein p53 (âm tính) là 43% và tích tụ protein TP53 trong nhân là 57%,

tỷ lệ này cao hơn so với các nghiên cứu khác Zellars và cộng sự đánh giá sự biểu hiện P53 trên 1530 bệnh nhân carcinôm tuyến vú cho thấy

khác cho thấy tỉ lệ protein P53 (+) dao động

trong khoảng từ 18% - 51% (Bảng 3), nguyên

nhân được giải thích chủ yếu là do: sự khác biệt

về nhóm tuổi (trước và sau mãn kinh), giai đoạn lâm sàng (có và chưa di căn hạch), và sự khác biệt về độ nhạy của các kháng thể trong kỹ thuật

Bảng 3 So sánh tỷ lệ p53 (+) trong carcinôm tuyến

vú với các tác giả khác

Tác giả Cỡ mẫu Tỉ lệ protein p53 (+)%

Zellar và cộng sự(14) 1530 51 Sjogren và cộng sự(12) 315 20 Thor và cộng sự(13) 994 33

Khảo sát sự biến đổi trình tự của gen p53

Tỉ lệ đột biến gen p53

Bảng 4 Tỉ lệ đột biến exon 5, 6, 7, 8 ở gen p53

Đột biến gen p53 (exon 5-8) Số lượng Tỉ lệ %

Bảng 5 Tỉ lệ đột biến gen p53 của các nghiên cứu

khác

Nhóm nghiên cứu Năm Số mẫu

Số lượng đột biến

Tỉ lệ đột biến

Nghiên cứu này 2010 100 28 28% Jin-Woo Ryu(10) 2000 27 10 37% Alsner J.(1) 2000 315 74 25% IARC (9) 2009 14482 3662 25,3%

Theo bảng 4, tỉ lệ gen p53 bị đột biến trên các

exon 5, 6, 7, 8 chiếm tỉ lệ 28% Cho đến nay,

người ta nhận thấy tần xuất xuất hiện đột biến

trong các bệnh nhân ung thư vú, tần xuất đột

biến gen p53 được ghi nhận thay đổi từ 15 đến

71%(6,7,10) Sự khác biệt về tần xuất phát hiện đột

biến ở các nghiên cứu khác nhau tùy thuộc vào

việc tầm soát các nhóm dân số nghiên cứu khác

nhau, kỹ thuật khác nhau, hay việc giải trình tự

toàn bộ gen 53 hay chỉ nhắm vào vùng exon số 5

đến exon số 8, là nơi có tần suất đột biến cao

nhất… Theo nhiều nghiên cứu, tỉ lệ đột biến gen

p53 gặp khoảng 25-40% trong ung thu vú Tuy

vậy, có nghiên cứu chỉ tìm thấy 2,7% đột biến

lệ đột biến gen p53 gặp trong ung thư vú là

25,3% (bảng 3-5), tương đồng với nghiên cứu

của chúng tôi

Vị trí exon bị đột biến

Bảng 6 Đột biến ở từng exon 5 – 8 gen p53

Kết quả đột biến Exon 5-8 Số lượng Tỉ lệ %

Theo bảng 6, tỉ lệ đột biến gen p53 ở các exon

5, 6, 7, 8 lần lượt là 69%, 14%, 11% và 6% Tỉ lệ

đột biến p53 trên exon 5 xảy ra với tỷ lệ cao nhất

(69%) Nhiều tác giả cho rằng đột biến gen p53

nằm chủ yếu ở các exon 5, 6, 7 và 8, tỷ lệ này có

thể chiếm từ 80 đến 95% Đây là vùng có tính

bảo tồn cao, là vùng chức năng nơi các protein

điều hòa hoạt động gen bám vào và là vùng

bám DNA của protein P53 Chính vì vậy trong

nghiên cứu này, do kinh phí có hạn, chúng tôi

tập trung tìm đột biến gen p53 ở các exon 5-8

trong các mẫu mô vùi nến có kết quả giải phẫu

bệnh carcinôm tuyến vú Tuy nhiên, theo

Osborne R.J, tỷ lệ đột biến trên exon 5 dường

như không phải cao nhất so với các exon khác

đột biến gen p53 lại gặp ở exon 7 nhiều hơn

(70%) khi nghiên cứu trên mẫu ung thư vú ở của phụ nữ Hàn Quốc

Về các vị trí codon bị đột biến

Vị trí acid amin đột biến thường gặp nhất là Cys 135, Arg158, Tyr163, Asn239 với tỷ lệ lần lượt là 11%, 14%, 14%, và 6% Các vị trí acid amin đột biến thường gặp (hotspots) hay nằm trong vùng DNA dễ bị tổn thương (như vị trí cặp nucleotide CpG) hoặc là bộ mã di truyền mã hóa cho một acid amin chủ chốt trong vùng thực hiện chức năng sinh học của protein, hoặc

cả hai Phân bố đột biến ở các codon của gen p53

trong carcinôm tuyến vú tại các vị trí thường gặp tương tự với các loại ung thư khác Theo

Gly245, Arg248, Arg249, Arg273, và Arg282 trong tất cả các dạng ung thư Tuy nhiên, theo

chiếm khoảng 2% trong carcinôm tuyến vú, trong khi đó đột biến ở codon này trong các ung thư khác chỉ chiếm khoảng 1% Ngoài ngoại lệ này, các nghiên cứu trên toàn cầu đều cho thấy

sự khác biệt về đột biến gen p53 trong carcinôm

tuyến vú và các ung thư khác là không có ý nghĩa Trong nghiên cứu này, đột biến Arg 175

Arg175 là đột biến thường gặp và 90% đột biến này là dạng Arg175 His, còn đột biến trong nghiên cứu của chúng tôi tuy cũng rơi vào vị trí

175, nhưng từ Arg biến đổi thành Cys (2,8%) và Prolin (2,8%) Đột biến này có tính chọn lọc cao trong các bệnh ung thư ở người, là do protein P53 có chức năng cần thiết trong gấp xoắn ở vùng liên kết DNA đồng thời có khả năng đột biến cao của dinucleotid CpG được methyl hoá

không gặp các đột biến thường gặp khác như các tác giả nêu trên, tuy nhiên điều lưu ý là có đột biến 163 (Tyr (TAC) thành Cys (TGC)) chiếm

tỷ lệ 14%, và trong 5 trường đột có đột biến Tyr

163 thì có 4 trường hợp đột biến này đi kèm với

đột biến Cys 135 Tyr Ngoài ra, có 5 trường hợp

có đột biến tại Arg158 (tỷ lệ 14%), vậy liệu

chúng có phải là các đột biến thường gặp trong

bệnh nhân carcinôm tuyến vú tiên phát ở người

Việt Nam Tương tự như nghiên cứu của Coles

C trên 136 bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú với

41 trường hợp có đột biến p53, nhưng tác giả

cũng nhận thấy không có đột biến nào được gọi

là đột biến thường gặp như một số tác giả khác

đã nêu Như vậy, tỷ lệ đột biến trên các quần thể

khác nhau liệu có sự phân bố đột biến trên gen

p53 khác nhau?

Số lượng đột biến trên một mẫu bệnh phẩm

Bảng 7 Số lượng đột biến trên một mẫu bệnh phẩm

2 đột biến/1 mẫu

1 đột biến/1 mẫu 1 exon 2 exon Tổng

Số mẫu 20 6 (21%) 2 (8%) 28

Tì lệ % 71% 29% 100%

Theo Bảng 7 số mẫu bệnh phẩm vùi nến của

một bệnh nhân carcinôm tuyến vú chỉ mang 1 đột biến chiếm tỷ lệ 71%, mang 2 đột biến chiếm 29% (trong đó 2 đột biến trên cùng một exon chiếm 21% và 2 đột biến trên 2 exon chiếm 8%)

thậm chí 2 loại đột biến khác nhau, vừa đột biến điểm nhầm nghĩa vừa đột biến mất nucleotid hoặc thêm nucleotid

Các kiểu đột biến gen p53

Bảng 8 Phân loại các kiểu đột biến theo vị trí exon trên gen p53

Các dạng biến đổi Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 Số lượng Tỉ lệ %

Vùng trình tự bị đột biến

Các dạng biến đổi Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 Số lượng Tỉ lệ %

Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến thay thế gồm đột

biến nhầm nghĩa 91,6% và đột biến vô nghĩa

chiếm 2,8% so với tỷ lệ đột biến dịch khung

5,6% Kết quả của nghiên cứu này tương đồng

với nghiên cứu về tỷ lệ đột biến nhầm nghĩa ở

phụ nữ bị ung thư vú Nhật Bản cũng chiếm

93% Theo dữ liệu của IARC, tỷ lệ các loại đột

biến nhầm nghĩa, vô nghĩa, dịch khung lần lượt

là 73,6%, 7,67% và 8,85% Số liệu ở nghiên cứu

này có khác với số liệu của IARC (2009) có thể

do phạm vi nghiên cứu của đề tài chỉ giới hạn

trong vùng exon 5-8 của gen p53, ngược lại, dữ

liệu đột biến của IARC được tổng hợp trên các

nghiên cứu trên toàn bộ gen p53, cả vùng exon

và intron Tuy vậy cũng có nhiều tác giả đề cập

nghiên cứu của họ chỉ có khoảng >60% là đột

biến nhầm nghĩa

Trong Bảng 8, tỷ lệ đột biến điểm trên exon

5-8 gen p53 chiếm đến 100% Theo nghiên cứu

carcinôm tuyến vú, tỷ lệ đột biến điểm trong các

gen p53 bị đột biến là 95% Trong nghiên cứu

Nghiên cứu của chúng tôi có tỷ lệ đột biến điểm

cao hơn các tác giả khác, có lẽ do chỉ tập trung

giải trình tự ở vùng exon 5-8 Trong các loại đột

biến điểm, tỷ lệ đột biến tại G cao nhất, chiếm

39% so với các thành phần khác Tuy nhiên tỷ lệ

đột biến tại G và C cũng tương đồng với tỷ lệ

đột biến tại A và T Đột biến đồng hoán chiếm

tỷ lệ chính 69,4% so với đột biến dị hoán chiếm

25% Trong đó, tỷ lệ đột biến đồng hoán AG

là cao nhất chiếm 25%, trong khi đó ở ung thư

đại-trực tràng tỷ lệ đồng hoán G A chiếm 36%

Trong tỷ lệ đột biến dị hoán, tỷ lệ GT cao nhất

là 16,7% so với ung thư đại –trực tràng là 10%

về đột biến trong carcinôm tuyến vú Theo

hoán, tỷ lệ GA lại chiếm đa số (53%), và

không có đột biến dị hoán GT nào trong 62

trường hợp phụ nữ Nhật bị ung thư ống tuyến

vú

Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy ra ở vùng

CpG trong carcinôm tuyến vú chiếm tỷ lệ 25%, khác biệt so với trong carcinôm tuyến đại trực tràng, tỷ lệ đột biến ở vùng CpG là 58%

Vị trí nucleotid bị đột biến

Cũng theo Bảng 8, tỷ lệ nucleotid bị đột biến ở

vị trí thứ 1 và thứ 2 trong codon lần lượt là 25% và 75% Trong mã di truyền, vị trí nucleotid thứ nhất

và thứ hai có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp protein Vì vậy, khi đột biến xảy ra ở vị trí thứ 1 hay thứ 2 của codon, có nhiều khả năng sẽ làm thay đổi thành phần và cấu trúc của protein, phù hợp với tỷ lệ đột biến nhầm nghĩa chiếm 94%

Vùng trình tự bị đột biến

Trong Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy ra ở trong

vùng trình tự bảo tồn là 33% và ngoài vùng trình tự bảo tồn là 67% Đột biến trong vùng trình tự bảo tồn thứ tự là vùng II (16,7%), vùng III (8,3%) và vùng IV (8,3%) Số liệu này khác biệt so với nghiên cứu của Coles C (6), 68% đột biến nằm trong vùng bảo tồn, thứ tự vùng II (8%), vùng III (12%), vùng IV (23%) và vùng V

(25%)

Sự biến đổi protein P53

Acid amin bị biến đổi

Theo Bảng 8, codon mã hóa acid amin Arg bị

đột biến nhiều nhất, chiếm tỷ lệ 22% trong tổng

số đột biến, sau đó là codon mã hóa Cys 18% và Tyr 14%, còn các loại codon mã hóa cho các acid

amin khác có tỷ lệ đột biến không quá 9%

Nhóm acid amin bị đột biến

Theo Bảng 8, sự thay đổi acid amin cùng

nhóm, khác nhóm và mất acid amin của protein P53 lần lượt là 25,0%, 69,0% và 6,0%, acid amin

là thành phần cốt lõi của protein, bất kì sự thay đổi acid amin nào trên protein cũng ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein

Vùng protein chức năng bị đột biến

Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy ra ở vùng

chức năng là 53%, bao gồm vùng L1/S2-S2’ β, L2

và L3 tương ứng 17%, 28% và 8% Đây là những

vùng protein P53 liên kết với DNA và phân tử

Zn Tuy nhiên trong nghiên cứu này, không có

acid amin nào gắn trực tiếp với DNA hay Zn bị

đột biến

Sự tương đồng giữa đột biến gen p53 và

biểu hiện quá mức P53

Bảng 9 Sự tương đồng giữa đột biến gen p53 và

biểu hiện quá mức protein P53

SEQ HMMD Có đột biến

p53

Không đột biến p53

Tổng

Dương tính 19 (19%) 38 (38%) 57

Tổng 28 (28%) 72 (72%) 100 (100%)

Theo Bảng 9, sự tương đồng giữa đột biến

gen p53 với sự vượt mức biểu hiện protein p53

trên bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú là 19% Tỉ

lệ mẫu có XN HMMD (+), có đột biến gen p53 là

19% và tỉ lệ mẫu có XN HMMD (-), không có

đột biến p53 là 34%, như vậy, hai phương pháp

phát hiện biểu hiện protein p53 và biến đổi trình

tự gen p53 này có kết quả tương đồng là 53%

Như vậy, 33 % số mẫu có XN HMMD (+) có

sự biến đổi trình tự gen p53 (19/57) và ngược lại

68% số mẫu có biến đổi gen p53 có XN HMMD

(+) (19/28) Có 2 trường hợp đột biến kiểu dịch

khung (do mất hay thêm nucleotide) đều có XN

hóa mô miễn dịch (-), tương tự nghiên cứu của

Askmalm S M nhận thấy 83% mẫu có đột

biến gen p53 thì XN HMMD (+), nhưng chỉ có

61% khối u có XN HMMD (+) thì có đột biến gen

p53 Điều này chứng tỏ tình trạng biểu hiện

vượt mức protein p53 trong hóa mô miễn dịch

không tương đồng cao với kiểu gen p53 đột biến

Theo số liệu bảng 9, số mẫu được phát hiện

có mang đột biến gen p53 nhưng lại không có sự

biểu hiện vượt mức protein p53 chiếm 9,0%,

những trường hợp này có thể giải thích bằng

một trong nhiều các giả thiết như một số đột

biến gen tạo ra các protein ngắn nên không

được IHC phát hiện, hay gen p53 có đột biến

trong vùng exon 5-8 nhưng đồng thời còn có

những biến đổi ở các vùng khác làm cho protein

p53 không được biểu hiện trong tế bào…

Tương tự, số mẫu được phát hiện có sự biểu hiện vượt mức protein p53 nhưng lại không có

đột biến gen p53 trong vùng exon 5-8 chiếm 36%

Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là có các đột biến nằm ngoài vùng exon 5-8, có sự biến đổi của các yếu tố kiểm soát quá trình biểu hiện protein P53…

Liên quan của biểu hiện protein P53 và đột

biến gen p53 với các đặc điểm của carcinôm

tuyến vú như nhóm tuổi, loại mô học, độ mô học, và tình trạng hạch đều không có sự khác biệt

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy trong các mẫu mô của bệnh nhân được chẩn đoán carcinôm tuyến vú, tỷ lệ biểu hiện tích tụ protein P53 trong nhân tế bào carcinôm vú là

57% Gen p53 (exon 5 - exon 8) được phân tích

bằng phương pháp giải trình tự gen phát hiện

đột biến thì tỉ lệ đột biến gen p53 là 28%, đột biến

xảy ở exon 5 chiếm tỉ lệ cao nhất (69,4%) Đột biến nhầm nghĩa chiếm tỉ lệ 91,6% Đột biến xảy

ra chủ yếu ở vị trí thứ 1và thứ 2 (100%) của mã

di truyền 33% đột biến xảy ra trong vùng trình

tự bảo tồn của gen và 25% đột biến xảy ra trong vùng CpG Đột biến xảy ra ở codon 175 chiếm 5,6% Đột biến Tyr163Cys chiếm 14% Đột biến xảy ra cao nhất trong vùng L2/L3 (36%) và L1/S/H2 (17%)

Sự tương đồng giữa đột biến gen p53 với sự

quá mức biểu hiện protein P53 trên bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú là 19% Tỉ lệ tương đồng giữa biểu hiện protein p53 và tình trạng đột biến

gen p53 là 53% 33 % số mẫu có XN HMMD (+)

có sự biến đổi trình tự gen p53 và 68% số mẫu có

biến đổi gen p53 có XN HMMD (+)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Alsner J., et al., (2000),"Heterogeneity in the clinical phenotype

of TP53 mutations in breast cancer patients" Clinical Cancer

Reseach, 6: p 3923-3931

2 Andersson J, Larsson L, Klaar S, Holmberg L, Nilsson J, Inganäs M, Carlsson G, Ohd J, Rudenstam CM, Gustavsson B, Bergh J (2005): Worse survival for TP53 (p53)-mutated breast cancer patients receiving adjuvant CMF Ann Oncol 2005 May;16(5):743-8

3 Askmalm M.S., et al., (2004),"Mutation and accumulation of p53

related to results of adjuvant therapy of postmenopausal breast cancer

patients" Acta Oncologica, 43-43

4 Catalin M, (2009) "Large study documents how P53 mutations link to

high-grade breast cancer, poor outcomes" PHYSORG: p

www.physorg.com/news159374125.html

5 Cho Y., Gorina S., et al (1994), “Crystal structure of a p53 tumor

suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic

mutations”, Science 265, pp 346-355

6 Coles C., Condie A., (1992), “p53 Mutations in Breast Cancer”,

Cancer Res, 52; 5291-92

7 Feki A and Irminger-Finger I., (2004),"Mutational spectrum of

p53 mutations in primary breast and ovarian tumors" Critical

Reviews in Oncology/Hematology, 52: p 103-116

8 Hamroun D and Kato S., (2006),"The UMD TP53 Database and

Website: Update and Revisions" Human mutation, 27(1): p

14-20

9 http://www-p53.iarc.fr/

10 Ryu J.W., Lee M.C., and J WC, (2000),"Detecting p53 gene

mutation of breast cancer and defining differences between

silver staining PCR-SSCP and immunohistochemical staining." J

Korean Medical Sciences, 15(1): p 73-77

11 Sasa M., et al., (1994),"P53 alteration correlates with negative ER,

negative PGR, and high histologic grade in breast cancer" Journal

of Surgical Oncology, 56 (1): p 46-50

12 Sjogren S., Inganas M., Lindren A., Holmberg L., Bergh J., (1998),

“Prognostic and predictive value of c-erbB-2 overexpression in primary breast cancer, alone and in combination with other

prognostic markers”, Journal of Clinical Oncology, 16, pp 462-469

13 Thor A.D., Moore D.H., et al (1992), “Accumulation of p53 Tumor Suppressor gene protein: An independent marker of prognosis in breast cancer”, Journal of the National Cancer Institute, 84, pp 845-855

14 Williams C., et al., (1998),"Assessment of sequence-based p53 gene analysis in human breast cancer: messenger RNA in comparison with genomic DNA targets", Clinical Chemistry, 44(3): p 455-462

15 Zellars R.C., Hilsenbecck S.G., and et al (2000), “Prognostic value of p53 for local failure in mastectomy-treated breast cancer

patients”, Journal of Clinical Oncology, 18, pp.1906-1913