Bài viết này trình bày quá trình giải trình tự, thu nhận chuỗi nucleotid, phân tích đặc điểm khung gen LMP-1 và thu nhận chuỗi gen ARN thông tin của 34 chủng EBV phân lập từ BN UTVMH ở Việt Nam. Trình tự nucleotid, đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của 34 chủng dựa vào dữ liệu gen ARN thông tin LMP-1 cũng được xây dựng, so với các chủng thế giới nhằm xác định phân nhánh của EBV Việt Nam.
Trang 118
PHÂN TÍCH CẤU TRÚC GEN LMP-1 VÀ MỐI QUAN HỆ
NGUỒN GỐC PHẢ HỆ CỦA 34 CHỦNG VIRUT EPSTEIN-BARR
TỪ BỆNH NHÂN UNG THƢ VÒM HỌNG Ở VIỆT NAM
Lê Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn** Nguyễn Đình Phúc***; Lê Thanh Hòa****
TÓM TẮT
Tách chiết ADN tổng số chứa hệ gen Epstein-Barr virut (EBV) từ mẫu mô sinh thiết của 64 BN được chẩn đoán ung thư vòm mũi họng (UTVMH) ở 3 miền Bắc Trung Nam (Việt Nam) Bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi LPMP1F/LMP1R, thu nhận, dòng hóa và giải trình tự 34 sản phẩm PCR Trình tự nucleotid của 34 chuỗi gen LMP-1 có độ dài biến động từ 1.238 - 1.337 bp Kết quả phân
tích gen LMP-1 của 34 chủng này cho thấy có 3 exon và 2 intron trong khung gen của LMP-1, trong
đó exon 1 là 268 bp; intron là 76 - 78 bp; exon 2 là 87 bp; intron 2 là 76 -77 bp và exon 3 có độ biến động độ dài cao nhất từ 728 - 827 bp Kích thước ARN thông tin từ 1.083 - 1.182 bp, mã hóa protein LMP-1 có độ dài 353 - 387 a.a So sánh đối chiếu với các chủng quốc tế đã được đăng ký trong Ngân hàng Gen cho thấy, 34 chủng nghiên cứu này của Việt Nam có độ đồng nhất cao nhất với chủng China 1 (Trung Quốc) và 3 chủng khác (NPC1, NPC2, NPC3) của Việt Nam Phân tích phả
hệ cho thấy 34 chủng nghiên cứu thuộc về 3 nhóm, trong đó, nhóm I: 20/34 thuộc về nhóm gồm các chủng di truyền China 1, nhóm I: 9/34 thuộc về nhóm các chủng di truyền China 2, Alaska và North Carolina và nhóm III: 5/34 thuộc về nhóm các chủng di truyền Med+ và Med-
* Từ khóa: Ung thư vòm mũi họng; EBV; Exon; Intron; LMP-1, Phả hệ
STRUCTURE OF LMP-1 AND PHYLOGENETIC ANALYSIS OF 34 EBV STRAINS ISOLATED FROM NASOPHARYNGEAL CARCINOMA
PATIENTS IN VIETNAM SUMMARY
Genomic DNAs of Epstein-Barr virus were extracted from biopsy tissue of 64 patients with nasopharyngeal carcinoma Of 64 templates using PCR with primers LPMP1F/LMP1R, 34 products were successfully obtained, cloned and sequenced The entire LMP-1 sequence for 34 isolates was between 1,238 and 1,337 bp There were 3 exons and 2 introns inside the LMP1 frame of which, exon 1 was 268 bp, itron 1 was 76 -78 bp, exon 2 was 87 bp, intron 2 was 76 - 77 bp and exon 3 was variable, between 728 and 827 bp The full length of mRNA varied between 1,083 and 1,182
bp, encoding for 353 - 387 amino acid Comparative analysis revealed that 34 EBV strains of the Vietnamese patients have highest identity and homology with China 1 (China) and 3 others of Vietnam (NPC1, NPC2, NPC3) Phylogenetic tree showed that there were 3 groups, including group
I of 20/34 strains clustered with the China 1; group II with 9/34 belonging to the China 2, Alaska and
NC (North Carolina); and group III of 5/34 strains with the Med + and Med-
* Key words: Nasopharyngeal carcinoma; EBV; Exon; Intron; LMP-1; Phylogeny
* Bệnh viện Quân y 103
** Học viện Quân y
*** Viện Tai Mũi Họng Trung ương
**** Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam
Người phản hồi (Corresponding): Lê Thanh Hà (lethanhhash@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 24/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 12/02/2014
Ngày bài báo được đăng: 25/02/2014
Trang 221
ĐẶT VẤN ĐỀ
Epstein-Barr virut (EBV) là một loại
Herpesvirut thuộc họ Herpesviridae, tồn
tại trong cơ thể người và thường không
gây ra các triệu chứng lâm sàng EBV có
tỷ lệ nhiễm cao trong cộng đồng và hầu
như tất cả mọi người đến tuổi trưởng thành
đều có khả năng mang EBV (Adham và CS,
2012; Ai và CS, 2012; Young, Rickinson,
2004) Trạng thái nhiễm tiềm tàng EBV
là hiện tượng đặc trưng ở loại virut này,
khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng chuyển
sang dạng hoạt động và làm tăng nguy
cơ mắc một số bệnh như ung thư dạ dày,
UTVMH và u lympho Burkitt (Kondo và
CS, 2012)
Nhiễm tiềm tàng EBV là hiện tượng
khởi đầu cho quá trình tiến triển ung thư
(Kondo và CS., 2012) Sự truyền nhiễm
EBV chủ yếu đặc trưng bởi biểu hiện của
những gen tiềm tàng, bao gồm EBNA-1,
LMP-1, LMP-2 và EBER (Junker, 2005)
Trong các gen và protein ảnh hưởng đến
sự tiến triển thành ung thư, LMP-1 có vai
trò đặc biệt quan trọng, được chứng minh
có khả năng đơn phương gây ung thư
trên chuột thực nghiệm (Shair và CS,
2008) LMP-1 chính là gen tiềm ẩn đầu
tiên của EBV được phát hiện có chức
năng chuyển đổi và thay đổi kiểu hình của
dòng tế bào lympho B
Sản phẩm ARN thông tin của LMP-1 là
kết quả ghép-nối (splicing) của 3 chuỗi
exon 1, 2 và 3, chịu trách nhiệm tổng hợp
protein LMP-1 (Ai và CS., 2012) Protein
LMP-1 có phân tử lượng 63 kDa, cấu tạo
từ khoảng 386 axít amin, chia thành 3
vùng: i) Vùng N tận (từ axít amin 1 - 23): có
vai trò gắn phần gốc của protein LMP-1
vào nguyên sinh chất tế bào; ii) Vùng 6 nhóm axít amin kỵ nước nằm ở giữa và liên quan đến chức năng tự liên kết; iii) Vùng C tận (từ axít amin 187 - 386): chứa
các con đường dẫn truyền tín hiệu chính gây chuyển dạng và thay đổi kiểu hình tế bào lympho B Nếu loại bỏ đoạn này của LMP-1, sẽ làm EBV mất khả năng gây biệt hóa tế bào lympho B Kỹ thuật phân tích gen xác định được ba vùng chức năng riêng biệt trong đầu tận cùng C của LMP-1 gọi là CTAR (C-terminal activator regions), bao gồm CTAR1, CTAR2 và CTAR3 (Young, Rickinson, 2004)
EBV được phân chia thành 7 nhánh chính đại diện 7 nhóm di truyền, bao gồm Raji, China 1, China 2, Alaska, Med+, Med- (Mediterranean) và NC (North Carolina), phân lập theo vùng địa lý, nhưng hiện nay
có xu hướng xâm nhập xuyên quốc gia (Mainou, Raab-Traub, 2006)
Bài báo này trình bày quá trình giải trình tự, thu nhận chuỗi nucleotid, phân tích đặc điểm khung gen LMP-1 và thu nhận chuỗi gen ARN thông tin của 34 chủng EBV phân lập từ BN UTVMH ở Việt Nam Trình tự nucleotid, đặc điểm
cấu trúc phân tử gen LMP-1 và mối quan
hệ nguồn gốc phả hệ của 34 chủng dựa vào dữ liệu gen ARN thông tin LMP-1 cũng được xây dựng, so với các chủng thế giới nhằm xác định phân nhánh của EBV Việt Nam
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
34 chủng EBV phân lập từ mô sinh thiết khối u của 64 mẫu bệnh phẩm từ BN
Trang 322
dựa vào triệu chứng lâm sàng và kết quả
giải phẫu bệnh lý) tại Bệnh viện Tai Mũi
Họng TW
2 Phương pháp nghiên cứu
* Tách chiết ADN tổng số:
Sử dụng bộ kit tách chiết ADN tổng số
(Hãng BIONEER, Hàn Quốc) hoặc QIAGEN
(Mỹ) để tách chiết ADN tổng số chứa hệ
gen của EBV từ 64 mẫu bệnh phẩm
UTVMH Tách chiết và tinh sạch ADN hệ
gen của EBV theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đo hàm lượng ADN bằng quang phổ kế (Spectrophotometer)
* Thực hiện phản ứng PCR đối với gen LMP-1:
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi LMP1-F và LMP1-R để phát hiện gen
trình tự trực tiếp hoặc sau khi dòng hóa
Bảng 1: Trình tự nucleotid cặp mồi LMP1-F/LMP1-R và điều kiện phản ứng PCR
C 1 phút,
* Dòng hoá sản phẩm, tách dòng, giải trình và phân tích trình tự:
Sản phẩm PCR đoạn gen LMP-1 của các mẫu sau khi tinh sạch được dòng hoá vào
plasmid vector pCR2.1 (Invitrogen Inc.) Chọn lọc khuẩn lạc và tách chiết ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình của Hãng Bioneer (Hàn Quốc) Trình tự nucleotid của ADN của
plasmid tái tổ hợp mang khung gen LMP-1 được giải trình trên máy tự động ABI-3100
AssemblyLIGN1.9, MacVector 8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu bằng chương trình GENEDOC2.6, xác lập cây phả hệ bằng chương trình MEGA5.0 (Tamura và CS, 2011)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Kết quả phân tích đặc điểm gen LMP-1
Toàn bộ 64 mẫu mô sinh thiết UTVMH được tách chiết ADN tổng số Sử dụng ADN
tổng số này làm khuôn để chạy PCR với cặp mồi LMP1-F và LMP1-R (bảng 1) Kết quả: 34/64 mẫu cho sản phẩm PCR chứa toàn bộ gen LMP-1, 30 mẫu còn lại không phát hiện được LMP-1 (phản ứng PCR âm tính) (hình 1)
một số mẫu UTVMH trên thạch agarose 1%
Trang 48
hạn HindIII); (-): Đối chứng õm; (+): Đối chứng dương; Cỏc mẫu ký hiệu S5, S7, S11, S16, H2, S9, S18, H9,S1, B4, B5, B6, B9, B10, B12, E61, H12, M12, M14: sản phẩm PCR của cỏc mẫu UTVMH tương ứng)
Sản phẩm PCR của 34 mẫu EBV được
dũng húa và giải trỡnh tự để phõn tớch đặc
điểm cấu trỳc gen LMP-1 cũng như phõn tớch
nguồn gốc phả hệ Xỏc định giới hạn exon
và intron bằng phương phỏp so sỏnh đối
chiếu chuỗi nucleotid của toàn bộ khung
gen LMP-1 với ARN thụng tin của một chủng
Trung Quốc, chủng China 1 (AY337723),
cú độ dài 1.116 bp Khi đối chiếu, phần
intron 1 và intron 2, sẽ được xỏc định dựa
trờn khoảng trống tạo ra giữa chuỗi
nucleotid của cỏc chủng và phần exon 1, 2
và 3 xỏc định trước và sau intron 1 và intron 2 Đối với exon 3, trỡnh tự nucleotide biến đổi giữa cỏc chủng Đõy là đặc điểm cần khai thỏc để phõn tớch biến đổi di truyền (phõn tử) giữa cỏc chủng Với phương phỏp xỏc định như vậy, chỳng tụi tiến hành thu thập chuỗi nucleotid exon của từng chủng và ghộp lại để thu nhận toàn bộ chuỗi nucleotid của ARN thụng tin từng chủng Kết quả tổng hợp cấu trỳc
Việt Nam được trỡnh bày ở bảng 2
Bảng 2: Đặc điểm cấu trỳc gen và protein LMP-1 của 34 chủng EBV Việt Nam
Ký
hiệu
chủng
N-ớc/
Lãnh thổ
phân lập
Toàn bộ khung gen (bp)
độ dài ARN thông tin (bp)
độ dài protein LMP1 (aa)
độ dài
độ dài
(bp)
độ dài
độ
(bp)
Trang 523
Toàn bộ khung gen LMP-1 của 34 chuỗi
nghiên cứu có kích thước dao động từ
1.238 - 1.337 bp, exon 1: 268 bp, itron
1: 76 - 78 bp, exon 2: 87 bp, intron 2:
76 - 77 bp và exon 3: 728 - 827 bp
Từ đó, ARN thông tin sau khi ghép 3 exon
với nhau, có độ dài từ 1.083 - 1.182 bp
mã hóa cho protein LMP-1 là 353 - 387 a.a
suy diễn
2 Kết quả phân tích mối quan hệ
phả hệ nguồn gốc của EBV dựa vào
trình tự gen LMP-1
Bằng chương trình GENEDOC 2.6 và
MEGA 5.0, ARN thông tin của gen LMP-1
(nucleotid và axít amin) các chủng Việt
Nam và thế giới được sử dụng để phân
tích phả hệ và xác lập mối quan hệ của
chúng Để phân tích mối quan hệ phả hệ
nguồn gốc của chủng EBV được phân lập trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng
hàng Gen, bao gồm các chủng đại diện Âu-Mỹ (Raji, Alaska, Med-, Med+, NC),
một số chủng đại diện phân lập ở các nước châu Á (China 1, China 2) và một
số chủng của Việt Nam (NPC1, NPC2, NPC3) Kết quả cho thấy:
EBV trong nghiên cứu (20/34), bao gồm các chủng phân lập ở miền Bắc (ký hiệu
là HN, EB và HP), miền Trung (ký hiệu là MT) và miền Nam (ký hiệu là S) thuộc
về nhóm chủng di truyền China 1 (Trung Quốc) cùng với một chủng Việt Nam nghiên cứu trước đây (NPC1, NPC2, NPC3)
Trang 624
các chủng China 2, Alaska và NC
các chủng Med+ và Med-
Mặt khác, trình tự nucleotid của 34
chủng trong nghiên cứu này cùng với 10
chủng sử dụng tham khảo đưa vào chương
trình GENEDOC 2.6 để phân tích đồng
nhất (identity) về thành phần nucleotid
và tương đồng (homology) về axít amin
Khi so sánh giữa 34 chủng trong nghiên
cứu này với 7 chủng quốc tế (Raji, Alaska, Med -, Med+, NC, China 1, China 2), kết quả cho thấy mức độ đồng nhất trung bình cao nhất với chủng China 1 (gần 95% về nucleotid và 94% về axít amin) Bên cạnh
đó, 34 chủng nghiên cứu đều có sự đồng nhất cao với 3 chủng khác của Việt Nam (NPC1, NPC2, NPC3) đã đăng ký trong Ngân hàng Gen: > 94% về nucleotid và khoảng 93% về axít amin (tương đương với chủng China 1)
Trang 78
cơ sở trình tự ARN thông tin chuỗi gen LMP-1 về thành phần nucleotid và amino axít
neighbour-joining, sử dụng độ tin cậy 1000 bootstrap) Chỉ số trên các nhánh biểu hiện
độ tin cậy của phương pháp; các chủng của thế giới đại diện cho các nhánh di truyền của EBV được đóng khung)
KẾT LUẬN
- Kích thước toàn bộ khung gen LMP-1
của 34 chuỗi nghiên cứu là 1.238 - 1.337
bp, từ đó, ARN thông tin có độ dài 1.083 -
1.182 bp, protein LMP-1 là 353 - 387 a.a,
exon 1 là 268 bp, itron 1 là 76 - 78 bp,
exon 2 là 87 bp, intron 2 là 76 - 77 bp và
exon 3 là 728 - 827 bp
gia xây dựng phả hệ, 20/34 chủng thuộc
về nhóm I gồm các chủng di truyền China 1;
9/34 thuộc về nhóm các chủng di truyền
China 2, Alaska và NC; 5/34 thuộc về
nhóm các chủng di truyền Med+ và Med-
đồng nhất cao nhất cả về nucleotid và
axít amin với chủng China 1 (Trung Quốc)
và 3 chủng khác của Việt Nam (NPC1,
NPC2, NPC3)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Adham M, Kurniawan AN et al
Nasopharyngeal carcinoma in Indonesia:
epidemiology, incidence, signs and symptoms
at presentation Chin J Cancer 2012, 31 (4),
pp.185-196
2 Ai J, Xie Z, Liu C, Huang Z and Xu J
Analysis of EBNA-1 and LMP-1 variants in
diseases associated with EBV infection in
Chinese children Virology Journal 2012,
9 (13), pp.1.743-1.751
3 Junker AK Epstein-Barr Virus Pediatrics
in Review 2005, 26 (3), pp.79-84
4 Kondo S, Wakisaka N, Muramatsu M et
al Epstein-Barr virus latent membrane protein
1 induces cancer stem/progenitor-like cells in nasopharyngeal epithelial cell lines Virology
Journal 2012, 85 (21), pp.11255-11264
5 Shair HY, Schnegg CI and Traub NR
Epstein-Barr virut latent membrane protein-1 effects on plakoglobin, cell growth and migration
Cancer Res 2008, 68 (17), pp.6997-7005
6 Young LS and Rickinson AB
Epstein-Barr virus: 40 years on Nature Review 2004, 4,
pp.757-768
7 Mainou BA, Raab-Traub N LMP1 strain
variants: biological and molecular properties
J Virol 2006, 80 (13), pp.6458-6468
8 Tamura K, Peterson D, Peterson N,
Stecher G, Nei M, Kumar S) MEGA5: molecular
evolutionary genetics analysis using maximum likeli-hood, evolutionary distance and maximum
parsimony methods Mol Biol Evol 2011, 28,
pp.2731-2739
Trang 826