Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của phức hợp nanochitosan/PLA mang nifedipine (viết tắt là tổ hợp nifedipin-PLA) trên động vật thực nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN
CỦA PHỨC HỢP NANOCHITOSAN/PLA MANG NIFEDIPINE
TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
Cấn Văn Mão*; Nguyễn Minh Núi**
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của phức hợp nanochitosan/PLA mang
nifedipine (viết tắt là tổ hợp nifedipin-PLA) trên động vật thực nghiệm Đối tượng và phương
pháp: cho chuột uống thuốc và đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên tỷ lệ chết, các chỉ số huyết
học và sinh hóa chức năng gan, thận cũng như hình ảnh mô bệnh học về chức năng gan, thận
Kết quả: với độc tính bán cấp, liều LD50 được xác định có giá trị 700 mg/kg (613,94 ± 786,06) Với độc tính bán trường diễn, không khác biệt có ý nghĩa thống kê về các chỉ số về thể trạng chung, chức năng tạo máu, chức năng gan thận cũng như hình ảnh mô bệnh học giữa nhóm
không uống thuốc và nhóm uống tổ hợp PLA (p > 0,05) Kết luận: tổ hợp
PLA an toàn trên cơ thể sống Đây là tiền đề để tiếp tục nghiên cứu sử dụng tổ hợp nifedipine-PLA trong điều trị tăng huyết áp trên người
* Từ khóa: Nifedipine-PLA; Độc tính cấp, bán trường diễn; Động vật thực nghiệm
Study of Acute and Subchronic Toxicities of Nifedipine-Embedded Nanochitosan/PLA’s in Experimental Animals
Summary
Objectives: To assess acute and subchronic toxicities of a drug, named nifedipine-embeded nanochitosan/PLA in experimental animals Subjects and methods: After animals were administrated the drug, we asssed effects of the drug to rates of animal deaths, gerenal conditions of animals, the complete blood count, liver and kidney functions as well as histological images of livers and kindeys in experimental aimals Results: In study of the acute toxicity, LD was 700 mg/kg (613.94 ± 786.06) In study of the subchronic toxicity, there were no significant differences in gerenal conditions of animals, the complete blood count, liver and kidney functions as well as histological images of livers and kindeys between one saline treated group and two nifedipine-PLA treated groups (p > 0.05) Conclusion: Nifedipine-PLA is safe in experimental animals This is basis for us to conduct further studies to apply nifedipine-PLA for treatment hypertensions in humans
* Key word: Nifedipine-PLA; Acute, subchronic toxicities; Experimental animals
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tăng huyết áp (THA) đang có xu
hướng tăng ở nước ta và là nguyên nhân
của nhiều bệnh lý và biến chứng khác
Một nghiên cứu cho thấy, THA chiếm tới chiếm tới 59,3% các nguyên nhân gây ra tai biến mạch máu não [1] Những biến chứng này làm tăng chi phí điều trị và
* Học viện Quân y
** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Cấn Văn Mão (canvanmao2001@gmail.com)
Ngày nhận bài: 07/01/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/03/2017
Ngày bài báo được đăng: 27/03/2017
Trang 2gánh nặng kính tế cho gia đình và xã hội
Do đó, điều trị THA có ý nghĩa quan trọng
trong việc hạn chế các biến chứng của nó
gây ra Thuốc điều trị hiệu quả là vấn đề
đang được quan tâm của Ngành Y tế
Có nhiều thuốc điều trị THA với cơ chế
tác động gây giảm huyết áp khác nhau
Trong đó, thuốc nifedipin (chẹn kênh
canxi) là một thuốc hay được dùng trong
lâm sàng Ưu điểm của nifedipine là tác
dụng nhanh, sau vài phút có thể có tác
dụng hạ áp ngay, nên hay được sử dụng
trong cấp cứu cơn THA kịch phát Tuy
nhiên, thời gian tác dụng của nifedipine
chỉ khoảng 4 - 6 giờ, nên khi sử dụng
nifedipine trong điều trị THA thường phải
sử dụng nhiều lần trong ngày [2] Điều
này dễ dẫn đến hiện tượng tích lũy thuốc
và gây ra nhiều tác dụng không mong
muốn như BN bị tụt huyết áp quá mức
(khi đó huyết áp rất khó kiểm soát, cấp
cứu tụt huyết áp trong trường hợp này rất
khó khăn)
Để hạn chế tác dụng không mong
muốn này, nhiều nghiên cứu đã gợi ý sử
dụng các loại nanoparticle như là chất
mang, giúp kiểm soát sự hấp thu và giải
phóng nifedepine tốt hơn [6] Dựa trên
nguyên lý này, chúng tôi đã tổng hợp một
loại nanoparticle có tên là chitosan/PLA
và gắn chitosan/PLA với nifedipine Để
đảm bảo an toàn và làm cơ sở nghiên
cứu sử dụng tổ hợp nifedipine-PLA trên
người, cần đánh giá độc tính của phức
hợp này đối với cơ thể sống Xuất phát từ
vấn đề này, chúng tôi nghiên cứu đề tài
này nhằm mục đích: Đánh giá độc tính
cấp và bán trường diễn của tổ hợp
nifedipin-PLA trên động vật thực nghiệm
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
Đánh giá độc tính cấp 48 chuột nhắt trắng (trọng lượng 18 - 22 g) và đánh giá độc tính bán trường diễn 30 chuột cống trắng (trọng lượng 150 - 200 g) chủng Swiss Cả 2 giống, khoẻ mạnh do Ban Cung cấp Động vật thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp Chuột nuôi trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh lý học 5 - 7 ngày trước khi nghiên cứu, trong suốt thời gian nghiên cứu cho ăn bằng thức ăn dành riêng cho chuột, uống nước tự do Quy trình nghiên cứu tuân thủ nghiêm ngặt hướng dẫn chăm sóc và sử dụng động vật của Học viện Quân y
2 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu
- Tổ hợp nifedipine-PLA dạng bột do Viện Kỹ thuật Nhiệt đới (Viện Khoa học Việt Nam) cung cấp, hòa tan trong nước muối sinh lý và cho uống qua đường miệng
- Dung dịch NaCl 0,9% do Euro-Med (Philippine) sản xuất
- Các hóa chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học
- Cân điện tử (Nhật Bản), độ chính xác 0,001 gam
- Cốc chia vạch, kim cho chuột uống thuốc đầu tù
- Máy sinh hóa bán tự động BTS 350 (Hãng Biosystem, Tây Ban Nha)
- Máy phân tích huyết học Swelab Alpha (Hãng Swelab, Thụy Điển)
3 Phương pháp nghiên cứu
* Độc tính cấp:
48 chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành 6 lô khác nhau, mỗi lô 8 con Tổ
Trang 3hợp nifedipine-PLA uống với liều tăng
dần trong cùng một thể tích để xác định
liều thấp nhất gây chết 100% chuột và
liều cao nhất không gây chết chuột (gây
chết 0% chuột) Theo dõi tình trạng chung
của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có
dấu hiệu nhiễm độc (như nôn, co giật,
kích động, bài tiết…) và số lượng chuột
chết trong vòng 72 giờ sau uống thuốc
Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá
tổn thương đại thể Từ đó xây dựng đồ thị
tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử
* Độc tính bán trường diễn:
Chuột cống trắng chia làm 3 lô, mỗi
lô 10 con:
- Lô chứng (n = 10): uống nước muối
sinh lý 1 ml/100 g/ngày
- Lô trị 1 (n = 10): uống dung dịch tổ
hợp nifedipine-PLA liều 3 mg/kg
- Lô trị 2 (n = 10): uống dung dịch tổ
hợp nifedipine-PLA liều 15 mg/kg (gấp 5
lần lô 1)
Chuột được uống nước muối hoặc
thuốc thử trong 4 tuần liền, mỗi ngày một
lần vào buổi sáng
* Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong
quá trình nghiên cứu:
- Tình trạng chung, thể trọng của chuột
- Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu
- Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: ALT, AST
- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ ure, creatinin huyết thanh
Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc tiêm thuốc, sau 4 tuần tiêm thuốc
* Mô bệnh học:
Sau 4 tuần tiêm thuốc, mổ chuột quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột ở mỗi lô Các xét nghiệm vi thể c thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103
* Phương pháp phân tích số liệu:
Các số liệu được xử lý thống kê theo thuật toán thống kê t-test student bằng phần mềm Microsoft Excel, phần mềm SPSS
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Độc tính cấp
Chuột nhắt trắng uống dung dịch chứa tổ hợp nifedipine-PLA từ liều thấp nhất đến liều cao nhất Lô chuột uống đến liều 1.150 mg/kg thể trọng chuột bị chết 100%, liều
400 mg/kg thể trọng chuột bị chết 0% sau 72 giờ uống thuốc
Bảng 1: Độc tính cấp của nifedipine-PLA
(mg/kg)
Số chuột thử (n i )
Số chuột chết (r i )
Số chuột sống (s i )
Tích số r i s i z i = 2k - 1
- 2i
Tích số r i z i
Trang 44 850 10 7 3 21 3 63
Tính LD50 theo phương pháp cải tiến của Livschitz P.Z (1986) Theo phương pháp này, chúng tôi xác định được: LD50 = 700 mg/kg (613,94 ± 786,06)
Kết quả nghiên cứu trên tương đối phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho thấy
LD50 của nifedipine trên chuột nhắt từ 700 - 1.000 mg/kg [4] Tuy nhiên, cũng có sự khác biệt với một số tài liệu khác cho thấy LD50 trên chuột nhắt chỉ khoảng 200 - 300 mg/kg, khác biệt ở đây có thể do giống, chủng loại và động vật thực nghiệm [7] Khác biệt về LD50 trên chuột nhắt uống nifedipine với chuột uống tổ hợp nifedipine có thể do ảnh hưởng của nanochitosan/PLA khi sử dụng
2 Độc tính bán trường diễn
* Ảnh hưởng của thuốc đối với thể trạng chung của động vật:
Trong thời gian thí nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, ăn uống tốt, nhanh nhẹn, lông mượt, mắt sáng, phân khô
Bảng 2: Ảnh hưởng của nifedipine-PLA đến thể trọng chuột
Thời gian Trọng
Trước thí
Sau 2 tuần
Sau 4 tuần
Sau 4 tuần thí nghiệm, trọng lượng chuột ở các lô đều tăng so với trước khi nghiên cứu có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Trọng lượng chuột ở các lô uống dung dịch chứa
tổ hợp nifedipine-PLA tăng ít hơn so với lô chứng sinh học, tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
* Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng tạo máu:
Bảng 3: Thay đổi chức năng tạo máu trước và sau uống thuốc
Kết quả
Số lượng hồng cầu
Trang 5Trước uống 12,72 ± 0,55 11,90 ± 0,63 12,40 ± 0,61 > 0,05 Hàm lượng huyết sắc tố
Số lượng bạch cầu (G/l)
Sau 4 tuần thí nghiệm, các xét nghiệm đánh giá chức năng tạo máu (số lượng hồng
cầu, hàm lượng huyết sắc tố, số lượng bạch cầu ở cả lô trị 1 (uống nifedipine-PLA liều
3 mg/kg/ngày) và lô trị 2 (uống tổ hợp nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày) khác biệt không có ý nghĩa so với lô chứng và so sánh giữa các thời điểm trước và sau khi uống thuốc thử (p > 0,05) Điều này chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA liều từ 3 - 15 mg/kg không làm ảnh hưởng đến chức năng tạo máu [2, 3, 4]
* Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng gan, thận:
Bảng 4: Thay đổi chỉ số đánh giá chức năng gan thận
Kết quả
Hoạt độ AST
Hoạt độ ALT
Ure (mg/dl)
Creatinin
- Về chức năng gan: sau 4 tuần thí
nghiệm, các xét nghiệm đánh giá mức độ
hủy hoại tế bào gan (hoạt độ AST, ALT
trong máu chuột) ở cả lô trị 1 (uống
nifedipine-PLA liều 3 mg/kg/ngày) và lô trị
2 (uống nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày)
đều không khác biệt có ý nghĩa so với lô
chứng và so sánh giữa hai thời điểm
trước và sau khi uống thuốc thử (p > 0,05)
Điều này chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA
liều 3 - 15 mg/kg trong thời gian 4 tuần
không gây tổn thương tế bào gan và
không ảnh hưởng đến chức năng tạo mật
của gan trên chuột [3, 4, 9]
- Về chức năng thận: sau 4 tuần thí nghiệm, ở cả lô trị 1 (uống nifedipine-PLA liều 3 mg/kg/ngày) và lô trị 2 (uống nifedipine-PLA liều 15 mg/kg/ngày), nồng
độ ure và creatinin trong máu chuột không thay đổi khác biệt có ý nghĩa thống
kê so với lô chứng Tương tự, các chỉ số này cũng không khác biệt giữa các lô ở
cả hai thời điểm trước và sau 4 tuần thí nghiệm (p > 0,05) Điều này chứng tỏ tổ hợp nifedipine-PLA liều 3 - 15 mg/kg trong 4 tuần không gây tổn thương thận cũng như ảnh hưởng lên chức năng thận trên chuột [10]
Trang 6* Thay đổi trên mô bệnh học gan thận
trước và sau uống thuốc :
- Quan sát đại thể: trên tất cả chuột
thực nghiệm (cả lô chứng và 2 lô trị),
không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý
nào về mặt đại thể của các cơ quan tim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận và hệ thống tiêu hoá của chuột
- Quan sát vi thể:
+ Hình ảnh vi thể gan:
Hình 1: Hình ảnh vi thể gan trước và sau uống thuốc
Ở lô chứng: các tiểu thùy gan rõ cấu trúc khoảng cửa với ống mật, động mạch và tĩnh mạch; các bè gan sắp xếp hướng về mao mạch trung tâm tiểu thùy Các tế bào gan có nhân tròn, đều, chất màu khá mịn, hạt nhân nhỏ, bào tương bị thoái hóa hốc Các tế bào Kuffer tăng sinh
Ở lô uống thuốc (lô trị 1 và lô trị 2): các tiểu thùy gan rõ cấu trúc của khoảng cửa với ống mật, động mạch và tĩnh mạch; các bè gan sắp xếp hướng về mao mạch trung tâm tiểu thùy Các tế bào gan có nhân tròn, đều, chất màu khá mịn, hạt nhân nhỏ, bào tương bị thoái hóa hốc Các tế bào Kuffer tăng sinh Trong tiểu thùy có một số ổ xâm nhiễm tế bào viêm lympho Tĩnh mạch gan xung huyết
+ Hình ảnh vi thể thận
Hình 2: Hình ảnh vi thể thận trước và sau uống thuốc
Lô chứng: cấu trúc của thận rõ vùng
vỏ và vùng tủy Cầu thận rõ cấu trúc cuộn
mạch với các mao mạch chứa hồng cầu,
khoang Bowman không chứa dịch Một số
nơi còn thấy cấu trúc của bộ máy cận cầu
thận Các ống lượn gần với tế bào biểu
mô có nhân tròn mịn, bào tương màu hồng Các ống lượn xa lòng tự do
Các mạch máu khe thận xung huyết
Lô uống thuốc (lô trị 1 và lô trị 2): cấu trúc của thận rõ vùng vỏ và vùng tủy Cầu thận rõ cấu trúc của cuộn mạch với mao
Trang 7mạch chứa hồng cầu, khoang Bowman
không chứa dịch Một số nơi còn thấy cấu
trúc của bộ máy cận cầu thận Các ống
lượn gần với tế bào biểu mô có nhân tròn
mịn, bào tương màu hồng Ống lượn xa
lòng tự do, các mạch máu khe thận xung
huyết
Như vậy, nifedipine-PLA liều 3
mg/kg/ngày và liều 15 mg/kg/ngày (liều
cao gấp 5 lần) khi cho chuột uống trong 4
tuần liên tục không gây ảnh hưởng đến
mô bệnh học gan, thận của chuột (hình
ảnh mô bệnh học của chuột dùng
nifedipine-PLA nằm trong giới hạn bình
thường, không có sự khác biệt rõ rệt so
với lô chứng) [4, 11]
KẾT LUẬN
Nghiên cứu độc tính cấp tính và bán
trường diễn của tổ hợp nifedipine-PLA trên
động vật thực nghiệm, kết quả cho thấy:
- Với độc tính cấp tính: liều LD50 là 700
mg/kg/24 giờ (613,94 ± 786,06) trên
chuột nhắt trắng
- Với độc tính bán cấp: thuốc thử
nifedipine-PLA liều 3 mg/kg/ngày và liều
15 mg/kg/ngày không gây độc tính bán
trường diễn trên chuột cống, khi cho
chuột uống trong 4 tuần liên tục Cân
nặng, chức năng tạo máu, mức độ hủy
hoại tế bào gan, chức năng thận và mô
bệnh học gan, thận đều nằm trong giới
hạn bình thường, không có sự khác biệt
rõ rệt so với lô chứng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Văn Đăng Điều tra dịch tễ học
tai biến mạch máu não trong cộng đồng và
trong bệnh viện Công trình cấp bộ (1989 -
1994) 1994
2 Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dương
Xét nghiệm sử dụng trong lâm sàng Nhà xuất bản Y học 2001
3 Vũ Đình Vinh Hướng dẫn sử dụng các
xét nghiệm sinh hoá Nhà xuất bản Y học
2001, tr.115-287
4 Đinh Thị Lam, Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Đỗ Thị Phương, Phạm Thị Vân Anh, Mai Phương Thanh Độc tính bán trường diễn
của cao xoa Bách xà trên động vật thực nghiệm TCNCYH 2016, 99 (1), tr.32-39
5 Cohan J.A, Checcio L.M Nifedipine in
the management of hypertensive emergencies: report of two cases and review of the literature Am J Emerg Med 1985, 3 (6), pp.524-530
6 Lim L.T, Auras R, Rubino M
Processing technologies for poly (lactic acid) Prog Polym Sci 2008, 33 (8), pp.820-885
7 AA PHARMA INC Product monograp
nifedipine, toxicology, acute toxicity studies
2010, p.22
8 Cayman Chemical Company Safety
datasheet nifedipine Toxicological Information
2012, section 11
9 Ragunath M.P Sasmal D Comparative
evaluation of hematology and biochemistry before and after administration of nifedipine and isoxsuprine in the treatment of preterm labor International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2015, 7 (3), pp.212-215
10 Guido Bel linghier, Giampiero Mazzaglia, Vincenzo Savica, Domenico Santoro Effects of manidipine and nifedipine
on blood pressure and renal function in patients with chronic renal failure: A multicenter randomized controlled trial Renal Failure 2003, 25 (5), pp.681-689
11 World Health Organization Working
group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Organization 2000