Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu nêu lên một trong những khó khăn trong công tác kiểm nghiệm felodipin là vấn đề chất chuẩn tạp vì có giá rất cao và khó mua. Do vậy, mục tiêu của đề tài này là tổng hợp 3 chuẩn tạp A, B và C của felodipin nhằm cung cấp cho viện kiểm nghiệm thuốc và Hội Đồng Dược Điền Việt Nam.
Trang 1TỔNG HỢP CÁC CHẤT CHUẨN TẠP FELODIPIN
Nghiêm Thoại Vân * , Trần Bội Châu ** , Trần Thành Đạo * , Lê Minh Trí *
TÓM TẮT
Mục tiêu: Một trong những khó khăn trong công tác kiểm nghiệm felodipin là vấn đề chất chuẩn tạp vì có
giá rất cao và khó mua Do vậy, mục tiêu của đề tài này là tổng hợp 3 chuẩn tạp A, B và C của felodipin nhằm cung cấp cho viện kiểm nghiệm thuốc và Hội Đồng Dược Điền Việt nam
Phương pháp: tổng hợp 3 tạp chất của felodipin A, B và C và tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột và kiểm
tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tạp chất A được tổng hợp từ felodipin bằng cách oxy hóa bằng acid nitric trên giá mang silicagel Tạp B và C tổng hợp theo phản ứng Hantzsch qua 2 giai đoạn: tạp chất B được tổng hợp từ 2,3-diclorobenzaldehyd và methyl acetoacetat và methyl crotonat Tạp chất C được tổng hợp từ 2,3- diclorobenzaldehyd, ethyl acetoacetat và ethyl crotonat
Kết quả: 3 chất chuẩn tạp A, B và C của felodipin (Dược điển BP 2007) đã được tổng hợp với hiệu suất và
độ tinh khiết cao
Kết luận: Các qui trình tổng hợp khá đơn giản có thể áp dụng tổng hợp các 3 tạp chất A, B và C của
felodipin dùng làm chất chuẩn trong công tác kiểm nghiệm nguyên liệu felodipin
Từ khóa: Phản ứng Hantzch, tạp felodipine
ABSTRACT
SYNTHESIS OF STANDARD IMPURITIES OF FELODIPINE
Nghiem Thoai Van, Tran Boi Chau, Tran Thanh Dao, Le Minh Tri
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 443 - 449
Objectives: In the quality control of drug, one of the problems is the standard reference substrates because of
their extremely high cost and unavailablity In this research, 3 impurities of felodipine are synthesized in very simple conditions in order to provide to the institute of quality control
Method: Three impurities A, B and C were synthetized and purified with flash column chromatography
Impurity A was obtained from felodipine under oxidative process by acid nitric supported on silicagel The Hantzsch reaction via 2 stepes in the presence of catalysis pyridine, piperidine and acetic acid was applied for generation of impurity B and impurity C, using 2,3-dichlorobenzaldehyde, methyl acetoacetate and methyl crotonate as starting materials The synthetic impurities were purified by recrystallization then followed by column chromatography process on silica gel
Conclusion: Three imputities of felodipine A, B and C were synthetized with high yield and purity These
substances could be applied for qualitative analysis of felodipine under BP 2007 specifications
Key words: Hantzch reaction, felodipine impurities
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới, hiện nay, bệnh
cao huyết áp là một trong 10 bệnh nguy hiểm
ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người và là
nguyên nhân gây ra cái chết của hơn 7,5 triệu người hằng năm Phương pháp điều trị hiệu quả nhất là dùng thuốc liên tục và lâu dài Do đó, việc kiểm tra, đánh giá chất lượng thuốc cần quan tâm đặc biệt
*Bộ môn Hóa Dược, Khoa Dược, ĐHYD TP.HCM **Trường Đại học Tôn Đức Thắng
Tác giả liên hệ: PGS TS Lê Minh Trí ĐT: 0903718190 Email: leminhtri1099@gmail.com
Trang 2Felodipin là một thuốc hạ huyết áp thuộc
nhóm chẹn kênh calci, là một trong những thuốc
được ưu tiên lựa chọn bởi những ưu điểm riêng
như: thời gian bán thải dài, liều dùng thấp, chỉ
sử dụng một liều duy nhất trong ngày (dễ tuân
trị, tránh được hiện tượng quên thuốc ở người
cao tuổi)… Tuy nhiên, tại Việt Nam, các chất
chuẩn không sẵn có, phải nhập khẩu từ nước
ngoài với giá đắt, do đó việc kiểm tra nguyên
liệu đầu vào trước khi đưa vào sản suất cũng
như kiểm nghiệm thành phẩm gặp rất nhiều
khó khăn
Từng bước đảm bảo nguồn nguyên liệu hóa
dược cần tiến hành song song với điều chế chất
chuẩn và tạp chất chuẩn để phục vụ công tác
kiểm nghiệm
Bước đầu các nhà sản xuất hóa dược trong nước đã tiến hành một số nghiên cứu sản xuất thuốc đặc trị như các thuốc tim mạch như nifedipin, felodipin và amlodipin
Hiện nay nhu cầu tạp chất chuẩn felodipin (xem Hình 1) tại Viện kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh rất cấp thiết, do vậy nghiên cứu này nhằm mục tiêu thiết lập được phản ứng điều chế, tinh chế thích hợp để sản xuất trong nước thay cho nhập ngoại rất đắt và mất nhiều thời gian chờ nhập
Báo cáo này trình bày các phản ứng hóa học ứng dụng trong điều chế và toàn bộ các qui trình tổng hợp tinh chế cũng như kiểm nghiệm độ tinh khiết Tuy vậy, kết quả này chỉ mới là bước thăm dò qui mô phòng thí nghiệm
Tạp A: ethyl methyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethylpyridin-3,5-dicarboxylat Tạp B: dimethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat Tạp C: diethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat
Hình 1 Các chất chuẩn tạp A, B và C dùng trong kiểm nghiệm felodipin
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các hoá chất dùng trong tổng hợp:
2,3-diclorobenzaldehyd, methyl acetoacetat,
ethyl-3-aminocrotonat, ethyl acetoacetat,
methyl-3-aminocrotonat, acid nitric, silicagel,
N-bromo-succinimid, piperidin, piridin, acetonitril,
n-hexan, methanol, ethanol, isopropyl alcol,
diisopropyl ether mua từ Merck được dùng tổng
hợp không qua tinh chế
Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy
Gallenkamp với nhiệt kế không hiệu chỉnh; đo
phổ tử ngoại (UV) trên máy U-2010
spectrophometer (Hitachi), ghi phổ hồng ngoại
(IR) trên máy FTIR-8201 PC (Shimadzu), định
lượng sản phẩm tổng hợp bằng hệ thống sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống sắc ký Water, phổ 1H-NMR được đo trên máy Bruker Ultrashield 500 (500 MHz)
Phương pháp tổng hợp
Tổng hợp chất chuẩn tạp A
Khảo sát khả năng oxi hoá vòng 1,4-dihydropyridin thành pyridin với 4 tác nhân Oxone,
Iod, N-bromosuccinamid, HNO3-SiO2(4,3,Error!
Reference source not found.,5) để chọn xúc tác phù hợp
Tổng chất chuẩn tạp B và C
Dựa vào phản ứng Hantzsch gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Tổng hợp dẫn chất trung gian benzyliden
Trang 3Giai đoạn 2: Phản ứng đóng vòng Hantzsch
giữa các chất trung gian và benzyliden
aminocrotonat
Các chất chuẩn tạp A, B và C được tinh khiết
bằng kết tinh trong dung môi methanol và sau
đó triển khai sắc ký cột nhanh với hệ dung môi
thích hợp: các tạp A, B và C được tiến hành chạy
sắc kí cột với silica gel 0,2-0,5 μm, pha động gồm n-hexan:ethylacetat (9:2) Các tạp chất chuẩn tổng hợp được định tính (phương pháp UV-Vis, IR) xác định cấu trúc (MS, NMR) và xác định hàm lượng nước bằng phương pháp chuẩn độ Karl-Fisher, Định lượng bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)(2)
Sơ đồ 1 Phản ứng oxi hóa felodipin thành chất chuẩn tạp A
Sơ đồ 2 Phản ứng Hantzsch dùng điều chế các chất chuẩn tạp B và C
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Tổng hợp chất chuẩn tạp A
Trong bốn tác nhân oxi hoá khảo sát, HNO3
-SiO2 cho phản ứng nhanh chóng (6 phút), nhẹ
nhàng, ít sản phẩm phụ và tinh khiết dễ dàng
bằng sắc ký cột nhanh(Error! Reference source not found.,6)
Cho vào bình cầu 4,5 g dung dịch acid nitric
65% được khuấy với 2 g silicagel trong 10 phút,
chất rắn màu trắng sẽ được tạo ra Hòa tan
(0,384 g, 1 mmol) felodipin trong 5 ml
dicloromethan, thêm 0,15 g SiO2-HNO3 Hỗn
hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng
khoảng 6 phút, theo dõi phản ứng bằng sắc ký
lớp mỏng (SKLM) Hiệu suất: 60%
Tạp A là chất dầu màu vàng nhạt, tan trong
aceton, cloroform, diclorometan, ethanol,
methanol, trong tan trong nước, ete, n-hexan
Phổ UV: 2 đỉnh tại bước sóng 273,5 nm và 234
nm Phổ IR (υ, cm-1, KBr): 1752 (δN-H); 1705,0 et
1380,9 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1652 (υC=C), 850,5
(nhân thơm thế tại 1,2,3); 1139,9 (Cl-Ar)
Phổ khối: MA = 382,0 (lý thuyết: công thức phân tử C19H19Cl2NO4, phân tử lượng 382,24) Phổ NMR-H1 (500 MHz, CDCl3, δ ppm): xem Bảng 1
Bảng 1 Phân tích phổ NMR-H 1 của chuẩn tạp A
đỉnh
Số
H
Hằng số
ghép (J, Hz)
Vị trí H
Tổng hợp chất chuẩn tạp B
Cho vào bình cầu dung tích 25 ml hỗn hợp gồm: 2,3-diclorobenzaldehyd (2,3-DCB, 0,525g,
3 mmol) hoà tan trong 3 ml isopropanol, methyl acetoacetat (0,39 g, 4,2 mmol), xúc tác piperidin và acid acetic với tỉ lệ mol so với 2,3-DCB là 1:5 (tỉ lệ mol giữa piperidin và acid acetic là 1:5) Hỗn hợp được đun hồi lưu ở khoảng 50-60 oC trong vòng
Trang 44h Kiểm soát phản ứng bằng phương pháp sắc
ký lớp mỏng Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sau
phản ứng gồm nguyên liệu đầu 2,3-DCB, hai
đồng phân E & Z của sản phẩm MBI (methyl
benzyliden intermediate) Vì sự khác nhau về tính
chất vật lý của hai đồng phân: đồng phân E là
tinh thể dạng rắn, trong khi Z ở dạng lỏng, vì thế,
hỗn hợp sau phản ứng được để kết tinh ở 0-5 oC
trong vòng 10-12h Lọc dưới áp suất giảm, rửa với
5 ml isopropanol lạnh, và sấy khô để thu được
đồng phân E Dịch lọc tiếp tục đun nóng ở 60 oC
trong vòng 1 giờ để có sự chuyển từ đồng phân Z
sang đồng phân E, để kết tinh tiếp tục ở 0-5 oC,
trong 10-12 giờ, lọc và gộp 2 phần sản phẩm MBI
chung với nhau
Cho vào bình cầu dung tích 10 ml 0,273 g (1
mmol) MBI phản ứng với 1,2 mmol 3-methyl
aminocrotonat, xúc tác pyridin, hỗn hợp được
đun hồi lưu trong 2 ml ethanol ở 80 oC trong
vòng 4 giờ Tỉ lệ pyridin so với MBI là 1:10 Theo
dõi phản ứng bằng SKLM
Sau phản ứng, ethanol được cất bay hơi dưới
áp suất giảm, sau đó thêm 3 ml CHCl3 Dịch
cloroform được xử lý với dịch acid (6,3 g dd
HClđđ trong 24 ml H2O) Làm khan dịch
cloroform bằng 3 g natri sulfat khan Bay hơi
dung môi và thêm 3 ml diisopropyl ether Kết
tinh sản phẩm ở 0 oC trong vòng 10 giờ, lọc và
rửa với diisopropyl ether
Nhiệt độ nóng chảy: 158-160 oC
Hấp thu trong vùng tử ngoại (2 đỉnh hấp thu
tại bước sóng 361,5 nm và 241,5 nm với tỷ lệ hấp
thu 0,55) Trên bản mỏng silicagel F254, phát
quang dưới đèn 254 và 365 nm
Phổ hồng ngoại IR (υ, cm-1, KBr): 1752 (δN-H);
1705,0 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1652 (υC=C), 850,5
(nhân thơm được thế ở vị trí 1, 2, 3), 1139,9 (aryl
clorid)
Phổ IR (υ, cm-1, KBr): 1616 (δN-H), 1367 (υC=O),
1020,3 (υ C-O), 1616 (υC=C), 866,5 (nhân thơm thế
tại 1,2,3), 1137,9 (Cl-Ar)
Phổ khối : MB = 370,0 (lý thuyết: CTPT:
C17H17Cl2NO4, MB =370,227)
Bảng 2 Phân tích phổ NMR-H 1 của chuẩn tạp B
đỉnh
ghép (J, Hz)
Vị trí H
7,046-7,078
Tổng hợp chất chuẩn tạp C
Do chất trung gian ethyl benziliden không kết tinh được theo qui trình trên nên phải dùng natri bisulfit để loại nguyên liệu 2,3-DCB dư Sau phản ứng giai đoạn 1, cô quay loại isopropanol dưới áp suất giảm và hoà tan phần cắn dạng dầu màu cam trong ethyl acetat và trung hoà bằng dung dịch NaHCO3 10% Để loại vết nguyên liệu đầu 2,3-DCB, dung dịch NaHSO3 với lượng mol gấp 7,5 lần 2,3-DCB (0,104 g trong 10 ml nước) được thêm vào dd ethyl acetat và khuấy trong vòng 2 giờ, sau đó, chiết bỏ lớp nước và rửa nhiều lần với nước đến khi không còn 2,3-DCB Loại bỏ dung môi dưới
áp suất giảm
Thêm tiếp vào bình cầu 0,75 mmol 3-methyl aminocrotonat và các xúc tác, dung môi như ở giai đoạn 2 tổng hợp tạp B ở trên
Chất rắn màu cam, tan trong aceton, cloroform, diclorometan, ethanol, methanol, thực tế không tan trong nước, ete, n-hexan Nhiệt độ nóng chảy: 104-106 oC
Hấp thu trong vùng tử ngoại có 2 đỉnh hấp thu tại bước sóng 360 nm và 239 nm với tỷ lệ hấp thu 0,41 Trên bản mỏng silicagel F254, phát quang dưới đèn 254 và 365 nm
Độ ẩm : 3,7% (xác định bằng cân đo ẩm độ) Phổ hồng ngoại IR (υ, cm-1, KBr): 1616 (δ
N-H), 1701,1 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1616 (υC=C), 866,5 (nhân thơm được thế ở vị trí 1, 2, 3), 1137,9 (aryl clorid)
Trang 5Phổ khối: MC = 398,0 (lý thuyết: CTPT:
C19H19Cl2NO4 M = 398,28)
Bảng 3 Phân tích phổ NMR-H 1 của chuẩn tạp C
δ (ppm) Dạng
đỉnh
ghép (J, Hz)
Vị trí H
1,095 -
1,124
3,982 -
4,024
6,971-7,002
7,160
-7,179
7,223
-7,242
Xác định mức độ tinh khiết của các chất
Các chất được kiểm tra độ tinh khiết bằng
SKLM với 3 hệ dung môi khác nhau và tất cả
đều cho 1 vết sản phẩm
Phương pháp HPLC với cột pha đảo
Phenominex C18, detector PDA, bước sóng
phát hiện từ 210 nm đến 400 nm(2)
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 10 mg tạp A sau
khi đã tinh chế bằng SKC và hòa tan vào 25
ml acetonitril Tạp B, C (cân chính xác
khoảng 2 mg hoà tan trong 10 ml acetonitril)
Điều kiện tiến hành:
Cột pha đảo: Phenomenex Luna C18 4,6 x
250 mm; Kích thước hạt pha tĩnh: 5μm; Thể tích
bơm mẫu: 10 μl; Tốc độ dòng: 1 ml/1 phút
Chế độ chạy gradient trong 60 phút với hệ
pha động thay đổi như sau:
Bảng 4 Hệ pha động sử dụng để xác định độ tinh
khiết của các chất chuẩn tạp A, B, C
0 100 0
10 95 5
20 90 10
30 85 15
40 80 20
50 75 25
60 70 30
Trên sắc ký đồ 3 chiều, ta thấy mẩu thử khá tinh khiết mặc dù quan sát ở bước sóng thấp 210
nm nhưng chỉ phát hiện những đỉnh rất nhỏ và chiếm tỉ lệ không đáng kể
Chuẩn tạp A không phát hiện bất kỳ đỉnh phụ nào sơ bộ kết luận độ tinh khiết của chất chuẩn tạp A về mặt sắc ký đạt 100%
Hình 2 Sắc ký đồ HPLC của chuẩn tạp A
Chuẩn tạp B có một tỷ lệ nhỏ tạp chất (1,86%) => Độ tinh khiết về mặt sắc ký đạt 98,14%
Trang 6Hình 3 Sắc ký đồ HPLC của chuẩn tạp B
Chuẩn tạp C có một tỷ lệ nhỏ tạp chất
(0,95%) => độ tinh khiết về mặt sắc ký đạt
99,05%
Hình 4 Sắc ký đồ HPLC của chuẩn tạp C
Khi quan sát tại bước sóng 254 nm, bước
sóng trong định tính, định lượng felodipin theo
quy định của Dược Điển Anh BP 2007 thì không
phát hiện bất kỳ đỉnh phụ nào khác Do đó, các
chất này hoàn toàn có thể sử dụng làm chất đối
chiếu trong kiểm nghiệm felodipin
KẾT LUẬN
Từ nguyên liệu đầu là felodipin, qua khảo
sát phản ứng oxi hoá bằng các tác nhân Oxone,
iod, HNO3-SiO2, N-bromosuccinimid đã đưa ra
kết luận tác nhân acid nitric trên giá mang
silicagel có thể ứng dụng để tổng hợp tạp A với
điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, thời gian ngắn,
ít sản phẩm phụ, hiệu suất khá cao Tạp B và C
của felodipin được tổng hợp theo phản ứng
Hantzsch qua 2 giai đoạn, giai đoạn 1 tạo chất trung gian diclorobenzyliden từ 2,3-diclorobenzaldehyd và alkyl acetoacetat (tạp B: methyl, tạp C: ethyl), sau đó cho chất trung gian này phản ứng với alkyl crotonat (tạp B: methyl, tạp C: ethyl) Các chất sau tổng hợp được tinh chế bằng sắc ký cột để đạt độ tinh khiết ở mức cao và kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC, đầu
dò PDA với pha động có mức độ phân cực thay đổi từ kém phân cực nhất đến phân cực và bước sóng phát hiện từ 210-400 nm Với những nghiên cứu bước đầu cho kết quả khả quan, có thể tiếp tục khảo sát các điều kiện phản ứng hoặc đưa vào sản xuất thử các chất chuẩn đưa ra thị trường
Trang 7TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Arash GC, Mohsen N, Hamid G, Lofti S, Zahra C, (2009)
“Oxidation of Hantzsch 1,4-Dihydropyridins using
Supported Nitric Acid on Silica gel and Poly Vinyl
Pyrrolidone (PVP) under mild and heterogeneous
conditions”, Bull Korean Chem Soc., Vol 30 (No 4), pp
972-974
2 Dược Điển Anh 2007, CD ROM
3 Fillipan-Litvié M, Cepanec I, Vinkovié V, “Hantzsch
Synthesis of
2,6-Dimethyl-3,5-dimethoxycarbonyl-4-(o-methoxyphenyl)-1,4-dihydropyridin; a Novel Cyclisation
Leading to an Unusual Formation of
1-Amino-2-
methoxycarbonyl-3,5-bis(o-methoxyphenyl)-4-oxa-cyclohexan-1-ene”, Molecules (2007), pp 2546-2558
4 Gustavsson, Anders; Kallstrom, Ang Ke, Palmer, Sven
“Manufacturing process for Felodipin”, USA Patent, 5,942,624
(24/8/1999)
5 Nagarajan R., Anthonyraj JCA, Muralidharan D., Saikumar C., “A convenient method for the oxidation of Hantzch 1,4-dihydropyridin with N-bromosuccinimi”, Indian Journal of Chemistry, (2006), Vol 45B., pp 826-828
6 Zolfigol M.A., Bagherzah M., Niknam K., Shirini F., Mohammadpoor-Baltork I., Ghorbani Choghamarani A và Baghbanzah M., “Oxidation of 1,4-dihydropyridins under mild and heterogeneous conditions using Solid Acids”,
Journal of the Iranian Chemistry Society, (2006), Vol 3, No.1.,
pp 73-82