Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ADENOSINE TRONG
ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps spp.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC
Chử Văn Mến*; Vũ Tuấn Anh*; Nguyễn Văn Long*
Nguyễn Thị Lan Hương*; Bùi Thị Thu Hà*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng
hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Đối tượng: Đông trùng hạ thảo
Phương pháp: xác định điều kiện sắc ký để định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo
bằng HPLC Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH Kết quả: xác định được điều kiện
sắc ký thích hợp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo gồm: cột C 18 Phenomenex
(4,6 mm × 250 mm, 5 µm) với hệ dung môi pha động là dung dịch đệm phosphate và acetonitril,
tỷ lệ 92/8, detector UV tại bước sóng 259 nm Phương pháp được thẩm định đã đáp ứng yêu
cầu về tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng
(LOQ), giới hạn phát hiện (LOD), độ đúng, độ chính xác Kết luận: đã xây dựng và thẩm định
được phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC
* Từ khóa: Đông trùng hạ thảo; HPLC; Adenosine
Determination of Adenosine in Cordyceps spp by HPLC
Summary
Objectives: Establishment and validation of adenosine quantification in Cordyceps spp by high
performance liquid chromatography Materials: Cordyceps spp Methods: Determine chromatographic
conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp using HPLC The validation was carried
out in accordance with ICH guideline and USP-34 Results: The suitable chromatographic
conditions for quantitation of adenosine in Cordyceps spp., including: C 18 Phenomenex columns
(4.6 mm x 250 mm, 5 µm) with mobile phase of phosphate buffer and acetonitrile, at the ratio
of 92/8, the detection wave length of 259 nm The quantitative method was validated on system
compatibility, selectivity, linear range, limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), precision
and accuracy Conclusion: The HPLC method for adenosine quantitation has been developed
and fully validated in accordance with ICH guideline
* Key words: Cordyceps spp.; HPLC; Adenosine
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông trùng hạ thảo, một thuốc cổ truyền
nổi tiếng của Trung Quốc, có tên khoa học
là Cordyceps sinensis hoặc Cordyceps
côn trùng và sâu chết Đông trùng hạ thảo phân bố chủ yếu ở một số tỉnh của Trung Quốc như Tibet, Qinghai, Sichuan, Yunnan và Gansu Đây là vị thuốc có nhiều
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến (chuvanmen@gmail.com)
Ngày nhận bài: 24/06/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2015
Ngày bài báo được đăng: 01/12/2015
Trang 2tác dụng quý và giá thành cao Đông trùng
hạ thảo dùng trong đông y có tác dụng bổ
thận, bổ khí điều trị các trường hợp mệt
mỏi, mồ hôi về đêm, giảm năng lực tình
dục, tăng đường huyết, tăng mỡ máu, vô
lực sau khi ốm nặng, bệnh phổi, bệnh
thận, suy thận, loạn nhịp tim và bện gan
[1, 2] Nghiên cứu dược lý học hiệu đại
cho thấy: Đông trùng hạ thảo có tác dụng
cải thiện nhiều hệ thống cơ quan của cơ
thể như tuần hoàn, miễn dịch, cơ quan
tạo máu, tim mạch, phổi và các tuyến nội
tiết trong cơ thể [3, 4] Cho tới nay, hoạt
chất chính trong Đông trùng hạ thảo được
xác nhận là nucleoside và adenosine là
một chỉ tiêu để đánh giá tiêu chuẩn chất
lượng của Đông trùng hạ thảo [3, 5]
Adenosine có tác dụng dập tắt trạng thái
kích thích của tế bào thần kinh trung
ương và ức chế giải phóng nhiều chất
dẫn truyền thần kinh tiền sinap [6, 7]
Để đảm bảo hiệu quả chữa bệnh của
Đông trùng hạ thảo, việc đánh giá chất
lượng của Đông trùng hạ thảo rất quan
trọng Nghiên cứu này tiến hành: Định lượng
adenosine trong Đông trùng hạ thảo
nhằm đánh giá chất lượng của loại dược
liệu này
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
- Dược liệu: Đông trùng hạ thảo do
Phòng Dược và các Hợp chất tự nhiên,
Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân
sự - Học viện Quân y cung cấp Mẫu được
lưu tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học
Quân sự, Học viện Quân y
- Hóa chất:
+ Chất chuẩn adenosine (Shanghai Tauto Biotech Co., Ltd Trung Quốc)
+ Ethanol 96, methanol đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích
+ Acetonitril, đệm phosphate, nước cất
2 lần: đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC - Merck
- Thiết bị, dụng cụ:
+ Bình chiết siêu âm Soniclean, bộ chiết hồi lưu dung môi
+ Máy HPLC Alliance Water 2695D; detector PDA
+ Cân phân tích Sartorius có độ chính xác 0,1 mg
+ Bộ lọc hút chân không Alltech (Mỹ) + Màng lọc nylon Sartorius Minisart kích thước lỗ lọc 0,45 µm
2 Phương pháp nghiên cứu
- Xây dựng phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo dựa trên đánh giá các thông số: tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới
- Qua tham khảo tài liệu [3, 5] và thực nghiệm, chúng tôi xây dựng các điều kiện phân tích HPLC như sau:
+ Hệ thống HPLC
+ Detector PDA, tại bước sóng 259 nm + Chương trình rửa giải isocratic với
hệ pha động acetonitrile/dung dịch đệm phosphate pH 6,5 (tỷ lệ 8/92)
+ Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 10 µl
Trang 3- Dung dịch thử: cân chính xác 2 g bột
dược liệu (được nghiền tới kích thước
thích hợp) cho vào bình hồi lưu, thêm
chính xác 50 ml methanol 90%, cân bình,
ghi chính xác khối lượng Tiến hành chiết
bằng phương pháp hồi lưu trong 60 phút
Để nguội, cân lại bình, bổ sung methanol
90% đến khối lượng ban đầu Lắc đều,
lọc qua màng 0,45 μm, sau đó, đem phân tích sắc ký
- Dung dịch chuẩn: cân chính xác 10,0 mg chất chuẩn adenosine và hòa tan vào
bình định mức 10 ml với methanol để được
dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1,0 mg/ml (dung dịch A)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Tính tương thích hệ thống
Đánh giá bằng cách tiêm lặp lại 6 lần một dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký với
điều kiện nêu trên Kết quả trình bày ở bảng 1 và sắc ký đồ của dung dịch chuẩn
adenosine, dịch chiết từ Đông trùng hạ thảo được ghi ở hình 1, 2
Adenosine
Trang 4Bảng 1: Kết quả khảo sát tính thích
hợp của hệ thống sắc ký
RSD = 0,18%
RSD = 0,12%
Kết quả cho thấy hệ thống sắc ký tương
thích với mẫu phân tích với RSD của diện
tích pic và thời gian lưu đều < 1%
2 Tính đặc hiệu
Sử dụng detector PDA để đánh giá tính
đặc hiệu của phương pháp tại thời gian
lưu píc trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và
mẫu thử, xác định phổ UV-VIS Kết quả
cho thấy: phổ của hai píc giống nhau về
hình dạng và số đỉnh hấp thụ cực đại,
chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao
3 Khoảng tuyến tính
Để khảo sát khoảng tuyến tính của
phương pháp, chúng tôi tiến hành pha
một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ
2,40; 6,0; 12,0; 30,0; 60,0; 100,0 µg/ml
Sau đó xác định tương quan diện tích píc
và nồng độ các dung dịch chuẩn
Bảng 2: Sự phụ thuộc của diện tích píc
vào nồng độ adenosine chuẩn
= 0,9999
píc và nồng độ adenosine
Kết quả cho thấy: trong khoảng nồng
độ khảo sát, diện tích píc và nồng độ adenosine có tương quan tuyến tính chặt chẽ, R2 = 0,9999
4 Độ lặp lại
Tiến hành xác định độ lặp lại của phương pháp bằng cách định lượng adenosine với 6 thí nghiệm riêng biệt theo phương pháp đã chọn
Bảng 3: Kết quả đánh giá độ lặp lại của
phương pháp
Thứ
tự
Lƣợng Đông trùng
hạ thảo (g)
Lƣợng adenosine (mg)
Hàm lƣợng (%)
Thống kê
RSD = 0,92%
Kết quả cho thấy: phương pháp định lượng có độ lặp lại tốt với RSD = 0,92%
Trang 5- Độ đúng
Xác định độ đúng của phương pháp
bằng phương pháp thêm chuẩn
+ Dung dịch chuẩn gốc: hút chính xác
1 ml dung dịch chuẩn (dung dịch A), hòa
loãng vào bình định mức 50 ml bằng
methanol, lắc kỹ (dung dịch B)
+ Dung dịch thử gốc: tiến hành chuẩn
bị như phần dung dịch thử
+ Dung dịch hỗn hợp: hút chính xác
5 ml dung dịch thử gốc cho vào bình định
mức 10 ml, thêm dung dịch chuẩn gốc
(dung dịch B) vừa đủ tới vạch, lắc đều
Lọc dung dịch được qua màng 0,45 µm,
sau đó, dung dịch được phân tích sắc ký
Tiến hành đo HPLC với điều kiện đã
nêu trên, lặp lại thực nghiệm với 5 dung
dịch thử khác nhau
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng
Thứ
tự
Lƣợng thêm
vào (µg)
Lƣợng thu hồi (µg)
Tỷ lệ (%) thu hồi
RSD = 1,10%
Phương pháp định lượng có độ đúng
cao với tỷ lệ (%) thu hồi từ 98,18 - 101,07%;
RSD = 1,10%
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng dưới:
+ Nồng độ mẫu thử khoảng 0,8 µg/ml
là giới hạn phát hiện Tại nồng độ này, đáp ứng píc mẫu thử có diện tích gấp hơn 3 lần diện tích đáp ứng của mẫu trắng + Nồng độ mẫu thử khoảng 2,4 µg/ml
là giới hạn định lượng dưới Tại nồng độ này, đáp ứng píc mẫu thử có diện tích gấp hơn 10 lần diện tích đáp ứng của mẫu trắng với độ đúng và độ lặp lại ở mức có thể chấp nhận khi tiến hành phân tích ở nồng độ này
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp định lượng adenosine trong Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký: cột Phenomenex Genimi RP-C18; pha động: acetonitrile: đệm phosphate pH6,5 (8:92); detector: UV tại bước sóng 259 nm Phương pháp định lượng này có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc và nồng độ adenosine trong khoảng nồng độ khảo sát với R2 = 0,9999; độ lặp lại (RSD = 0,92%)
và độ đúng (98,18 - 101,07%) Thời gian phân tích một mẫu bằng HPLC là phù hợp (khoảng 15 phút)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Zhu JS, Halpern GM, Johns K The
scientific rediscovery of an ancient Chinese
herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part I;
J Alt Comp Med 1998, 4, pp.289-303
2 Zhu JS, Halpern GM, Johns K The
scientific rediscovery of an ancient Chinese
herbal medicine: Cordyceps sinensis: Part II;
J Alt Comp Med 1998, 4, pp.429-457
Trang 63 SP Li, FQ Yang, Karl WK Tsim Quality
control of Cordyceps sinensis, a valued traditional
Chinese medicine, Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis 2006, 41,
pp.1571-1584
4 Ashok Kumar Panda, Kailash Chandra
Swain Traditional uses and medicinal
potential of Cordyceps sinensis of Sikkim,
J Ayurveda Integr Med 2011, Jan-Mar, 2 (1),
pp.9-13
5 The Pharmacopoeia Commission of
PRC (Eds.) Pharmacopoeia of the People’s
Republic of China, Chemical Industry Publishing House, Beijing 2005
6 Corradetti R, Lo Conte G, Moroni F, Passani MB, Pepeu G Adenosine decreases
aspartate and glutamate release from rat hippocampal slices Eur J Pharmacol 1984, Sep 3, 104 (1-2), pp.190-126
7 C Schmidt, M C Bellingham, D W Richter
Adenosinergic modulation of respiratory neurones and hypoxic responses in the anaesthetized cat J Physiol 1995, Mar 15,
483 (Pt 3), pp.769-778