Nội dung bài viết trình bày về ghép TBG tạo máu là một phương pháp điều trị mới có thể chữa khỏi nhiều bệnh máu lành tính và ác tính. Sự xuất hiện các tế bào người cho trong máu người nhận sau ghép đồng loài là một chỉ số quan trọng cho phép tiên lượng khả năng thải ghép, tái phát, hoặc bệnh ghép chống chủ. Do vậy mục tiêu của ghép TBG tạo máu đồng loài là mảnh ghép (tức tế bào người cho) mọc 100% trong máu người nhận.
Trang 1B ƯớC ĐầU ỨNG DụNG KY THUậT GIảI TRìNH Tự GEN CáC
LOCUS STR PHâN TíCH THể KHảM ADN ĐáNH GIá TìNH TRạNG
MọC GHéP SAU GHéP tế bào gốc ĐồNG LOàI TạI VIệN HUYếT HO C TRUYềN MáU Trung Ương
Lờ Xuõn Hải*
TóM TắT
ADN từ người cho và người nhận trước ghộp được khuếch đại bằng kớt AmpF/STR Identifiler
khuếch đại 15 dấu ấn STR và 1 dấu ấn giới tớnh Giải trỡnh tự cỏc dấu ấn này Căn cứ vào đặc điểm
khỏc biệt giữa cỏc alen STR người cho và người nhận, xỏc định alen mang thụng tin tốt nhất để tớnh
toỏn mức độ khảm Để xỏc định chớnh xỏc mức độ khảm, trộn hỗn hợp ADN người cho và người
nhận trước ghộp theo tỷ lệ xỏc định từ 0 - 100%, sau đú phõn tớch tớnh toỏn % ADN người cho bằng
cỏch tớnh % donor peak area (% diện tớch đỉnh người cho) rồi dựng đường cong chuẩn tương quan
giữa % ADN người cho thực tế và % ADN người cho tớnh toỏn Thụng qua đường cong chuẩn này,
cú thể nội suy kết quả % khảm của mẫu bệnh nhõn (BN) sau ghộp Kết quả: bằng k thuật giải trỡnh
tự gen cỏc locus STR cho 8 cặp ghộp tế bào gốc (TBG) đồng loài, đ xỏc định được 6 trường hợp
khảm hoàn toàn và 2 trường hợp khảm hỗn hợp vào ngày D30 sau ghộp Kết luận: Lần đầu tiờn
ở Việt Nam, đ ỏp dụng thành cụng phương phỏp giải trỡnh tự gen để xột nghiệm phõn tớch tỡnh
trạng khảm Phương phỏp này cú độ tin cậy, độ chớnh xỏc cao, cho phộp đỏnh giỏ tỡnh trạng mọc
ghộp/thải ghộp ở BN sau ghộp tủy/ghộp TBG tạo mỏu đồng loài
* Từ khoỏ: Tế bào gốc đồng loài; Giải trỡnh tự gen; Thể khảm AND
Applying sequence genetic loci STR technique in
analysis of DNA chimerism to evaluate status
of gemmation after hematopoietic stem cell
transplantation at National Hospital of
Hematology and Transfusion SUMMARY
DNAs from pretransplant recipients and donors were amplified with the AmpF/STR Identifiler kit
that contain 15 STR markers and 1 sex marker The fluorescent PCR products were the fractionated
on polyacrylmide gels in an ABI DNA sequencer Results were analyzed using Genemapper ID 3.2
softwear We selected the best markers as informative alens which can distinguish donor from
recipient For quantitative analysis of the engraftment, we prepared a mixed chimeric sample
by mixing pretransplant recipient and donor DNAs in different ratios to produce a standard curve
* Viện Huyết học Truyền máu TW
Ng-ời phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hải (xuanhaile@gmail.com)
Ngày nhận bài: 17/5/2013;
Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/6/2013
Trang 2Ngày bài báo đ-ợc đăng: 21/6/2013
After amplifying the posttransplant recipient DNA, we were able to detect the extent of engraftment
by interpolating the percent peak area of the informative alens from this standard curve Results: We retrospectively analyzed 8 patients who had received allogenic PSCT at D30 post-transplant At D30, 75% of patients had complete chimerism, 25% of patients only have mix chimerism Conclusion: It is the firt time such kind of engraftment analysis is established in Vietnam This method provides an useful tool in assessment of chimerism in posttransplant patients
* Key words: Hematopoietic stem cell transplantation; Short tendem repeat; Chimerism
ĐặT VấN đề
Ghộp TBG tạo mỏu là một phương phỏp
điều trị mới cú thể chữa khỏi nhiều bệnh
mỏu lành tớnh và ỏc tớnh [6, 7] Sự xuất hiện
cỏc tế bào người cho trong mỏu người nhận
sau ghộp đồng loài là một chỉ số quan trọng
cho phộp tiờn lượng khả năng thải ghộp, tỏi
phỏt, hoặc bệnh ghộp chống chủ [2] Cho
d chỉ c n một tỷ lệ nhỏ tế bào mỏu, BN s
phải đối mặt với nguy cơ tỏi phỏt Do vậy
mục tiờu của ghộp TBG tạo mỏu đồng loài
là mảnh ghộp (tức tế bào người cho) mọc
100% trong mỏu người nhận [3]
Thể khảm trong ghộp TBG tạo mỏu là
một trạng thỏi đặc biệt về miễn dịch và di
truyền, đặc trưng bởi sự c ng tồn tại của
cỏc quần thể tế bào cú nguồn gốc từ hai cỏ
thể khỏc nhau Cỏc dạng thể khảm trong
ghộp TBG tạo mỏu cú thể gặp, bao gồm thể
khảm hoàn toàn (mọc ghộp hoàn toàn trong
ghộp TBG tạo mỏu) hoặc thể khảm hỗn
hợp hay khảm một phần (mọc ghộp một
phần hoặc trong trường hợp thải ghộp) [5]
Cú nhiều phương phỏp khỏc nhau được sử
dụng nhằm xỏc định dạng thể khảm Về
nguyờn lý, cỏc phương phỏp này đều phải
dựa vào những điểm khỏc biệt về miễn dịch
hoặc di truyền giữa người cho và người nhận
Trong ghộp TBG tạo mỏu, nhất là ghộp từ
người cho là anh/chị em c ng huyết thống
thỡ khỏc biệt về hệ khỏng nguyờn HLA ớt cú
giỏ trị trong phõn tớch thể khảm, cỏc khỏc
biệt về hệ khỏng nguyờn hồng cầu và nhiễm
s c thể giới tớnh chỉ cú thể sử dụng trong cỏc trường hợp người cho và người nhận khỏc nhúm mỏu và khỏc giới So với những phương phỏp khỏc, phương phỏp phõn tớch thể khảm dựa vào sự khỏc biệt giữa cỏc dấu ấn ADN đặc trưng cỏ thể người cho và người nhận cú ưu thế là sử dụng được cho tất cả cỏc trường hợp ghộp TBG tạo mỏu đồng loài Phương phỏp này chớnh xỏc hơn cỏc phương phỏp khỏc và hiện đang được
sử dụng làm phương phỏp chớnh trong đỏnh giỏ đậu ghộp hoặc thải ghộp trong ghộp tủy/TBG tạo mỏu đồng loài [4] Nếu tại bất cứ thời điểm nào sau ghộp, BN được xột nghiệm mỏu mà khụng cú ADN người bệnh thỡ BN đú ở dạng thể khảm hoàn toàn (complete chimerism - CC) hay mọc ghộp hoàn toàn Tỡnh trạng khảm hoàn toàn được cho là cú nguy cơ tỏi phỏt thấp và tiờn lượng tốt hơn Nếu xột nghiệm thấy cú cả ADN người cho và ADN người bệnh thỡ BN
đú ở dạng khảm hỗn hợp (mixed chimerism
- MC) Thể khảm hỗn hợp chứng tỏ sự cú mặt của cả tế bào người cho và người nhận trong quần thể tế bào quan tõm Nếu sau ghộp theo dừi thấy BN chỉ cú MC mà khụng
cú CC, chứng tỏ kết quả ghộp chưa đạt được mọc ghộp hoàn toàn, nếu thấy bệnh nhõn đạt được CC, sau đú lại xuất hiện MC, chứng
tỏ cú biểu hiện thải ghộp Như vậy, về thực hành, xột nghiệm phõn tớch tỡnh trạng thể
Trang 3khảm rất cú ngh a trong theo dừi tiờn
lượng sau ghộp TBG tạo mỏu đồng loài [4]
đối T ƯỢNG Và PHƯƠNG PHáP
NGHIêN C ỨU
1 Mẫu mỏu BN
Phõn tớch 16 mẫu ADN trước ghộp và 8
mẫu ADN sau ghộp (ngày D30 sau ghộp) từ
8 cặp BN ghộp TBG tạo mỏu đồng loài từ
anh/chị em ruột cú ph hợp HLA, điều trị tại
Khoa Ghộp TBG, Viện Huyết học Truyền
mỏu TW từ thỏng 9 - 2012 đến 3 - 2013
Tiến hành phõn tớch tại Khoa Miễn dịch - Di
truyền và Sinh học phõn tử, Viện Huyết học
Truyền mỏu TW và Labo phõn tớch di truyền,
Cụng ty Gentis
P ỏ u
* Chuẩn bị mẫu:
Tỏch chiết ADN genome bằng kớt
Quick-gADN MiniPrep (ZymoResearh, USA) Phõn
tớch, đỏnh giỏ nồng độ ADN và chất lượng
ADN sau tỏch chiết trờn mỏy Nanodrop của
h ng Quiawel (Anh)
* Chuẩn bị xõy dựng đường chuẩn hỗn
hợp khảm ADN:
Trước khi định lượng tỡnh trạng mọc mảnh
ghộp trong mỏu ngoại vi, xõy dựng đường
chuẩn bằng cỏch phõn tớch cỏc mẫu hỗn
hợp ADN người cho và người nhận theo tỷ
lệ đ xỏc định trước Để tạo mẫu chuẩn cho
từng cặp ghộp, chỳng tụi trộn cỏc mẫu ADN
(10 ng/ul) đ tỏch của BN và người hiến trước
ghộp theo tỷ lệ khỏc nhau từ 0 - 100% Cỏc
mẫu này được phõn tớnh giải trỡnh tự locus
STR, căn cứ vào đặc điểm khỏc biệt alen
STR giữa người cho và người nhận, tớnh
toỏn xỏc định tỡnh trạng khảm (% donor)
Căn cứ vào % donor tớnh toỏn được và %
donor thực tế (% ADN người cho trong hỗn
hợp ADN đ chuẩn bị), d ng phần mềm
Microsoft Excel để xõy dựng đường cong
tương quan d ng cho tớnh toỏn định lượng theo hàm nội suy
* Khuếch đại cỏc đoạn STR (Short Tandem Repeat, cỏc đoạn lặp ngẫu nhiờn):
Sau khi tỏch chiết thu được ADN từ cỏc mẫu, chạy phản ứng PCR khuếch đại ADN bằng bộ kớt AmpF/STRđ
Identifilerđ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, M ) Kớt này cho phộp khuếch đại 15 locus STR
và 1 locus gen giới tớnh Phản ứng chạy trờn mỏy PCR 9700 (ABI, M ) với chu kỳ nhiệt như sau: 950
C: 11 phỳt, 940C: 1 phỳt,
590C: 1 phỳt x 28 chu kỳ, 720
C: 1 phỳt, 600C:
60 phỳt
* Điện di mao quản và phõn tớch:
Xỏc định kiểu gen của sản phẩm chạy phản ứng PCR của mẫu nghiờn cứu bằng phương phỏp điện di mao quản trờn mỏy giải trỡnh tự gen ABI 3100 (Applied Biosystem,
M ) Sau điện di, xử l kết quả thu được bằng phần mềm Genemapper ID 3.2 để xỏc định alen của mỗi locus
* Tớnh toỏn hỗn hợp thể khảm:
Tỷ lệ % ADN người cho được tớnh toỏn từ mỗi cặp locus STR mang thụng tin % diện tớch đỉnh người cho (% peak area) được tớnh toỏn theo cụng thức sau: % peak area
= [(AD1+AD2) x 100%]/(AD1+AD2+AR1+AR2),
ở đõy A k hiệu cho diện tớch đỉnh, D k hiệu cho cỏc alen người cho, R k hiệu cho cỏc alen người nhận (hỡnh 1) Trong trường
hợp người cho và người nhận c ng cú chung một số alen, chỉ những alen mang thụng tin mới được đưa vào tớnh toỏn Bằng cỏch nội suy diện tớch đỉnh của alen mang thụng tin
cú sử dụng đường chuẩn đ xõy dựng, tớnh toỏn được tỡnh trạng mọc ghộp thể hiện bằng % ADN người cho
* Định nghĩa khảm hoàn toàn (CC) và khảm hỗn hợp (MC):
Trang 4Khảm hoàn toàn (CC) được xỏc định khi
xuất hiện > 95% tế bào tạo mỏu người cho
sau ghộp TBG tạo mỏu đồng loài Khảm
hỗn hợp (MC) được xỏc định khi cú 5 - 95%
TBG tạo mỏu người cho sau ghộp TBG tạo
mỏu đồng loài [6]
hợp R1 và R2 là tớn hiệu alen 1 và 2 của
người nhận; D1 và D2 là tớn hiệu alen 1 và 2
của người cho; A là diện tớch đỉnh tớn hiệu
đặc hiệu (A) Cỏch tớnh khi cỏc alen của cả
người cho và người nhận cú những đỉnh
khỏc nhau (B) Cỏch tớnh trong trường hợp
cú 2 alen dị hợp tử và cú 1 alen c ng cú ở
người cho và người nhận
KếT QUả NGHIêN CứU
1 Độ tậ tru , độ ớ xỏ và đ ờ
uẩ
Vỡ cỏc alen ng n hơn cú thể khuếch đại
hiệu quả hơn alen dài, do đú cần phải kớch
hoạt một dải hỗn hợp thể khảm cú thể
tương ứng với cỏc mẫu sau ghộp gặp trờn
lõm sàng Pha loóng mẫu ADN để đỏnh giỏ
độ tương quan, khả năng lặp lại, độ tập trung
và độ nhạy của STR-PCR trong đỏnh giỏ
định lượng hỗn hợp thể khảm Tớnh toỏn %
diện tớch đỉnh người cho ở alen mang thụng
tin cỏc mẫu tạo dựng (mẫu trộn ADN người
cho và ADN người nhận theo tỷ lệ đ biết)
và d ng tỷ lệ % này v đường cong chuẩn
theo % diện tớch đỉnh của cỏc locus mang thụng tin và % ADN thực tế (y = -0,006x2
+ 1,730x - 5,472; r2 = 0,995)
2 Tỡm cỏc alen STR mang thụng tin
Cú rất nhiều tổ hợp alen người cho và người nhận, tuy nhiờn, chỉ cú một số tổ hợp
cú mang thụng tin cần thiết để phỏt hiện cỏc alen người cho Mặc d cú một số locus xột về mặt k thuật cú mang thụng tin, nhưng thực tế chỳng khụng tốt để d ng xỏc định thể khảm hỗn hợp vỡ cú sự xuất hiện của cỏc băng “búng” tồn tại dưới dạng như
2 băng phụ dọc theo cỏc đỉnh alen chớnh Nhỡn chung, cỏc băng “búng” là một băng lặp lại nhỏ hơn đỉnh alen chớnh và cú diện tớch nhỏ hơn so với alen chớnh Cỏc băng
“búng” này cú thể gõy ảnh hưởng đến việc lựa chọn locus mang thụng tin
Đ đ m BN và t u tớ
t m u
Bảng 1 cho biết một số thụng tin cơ bản
về 8 BN ghộp TBG đồng loài tại Viện Huyết học Truyền mỏu TW từ thỏng 9 - 2012 đến
3 - 2013 Trong số 8 BN này, 1 BN nam (12,5%) và 7 BN nữ (87,5%); 2 BN được ghộp khỏc giới (25%), 6 BN ghộp c ng giới (75%); 1 BN m c bệnh đỏi huyết s c tố kịch phỏt ban đờm (PNH), 2 BN rối loạn sinh tủy
% ADN ng-ời cho tính theo % diện tích đỉnh (Peak area)
Trang 5(MDS), 5 BN bạch cầu cấp d ng tủy (AML) BN ghép có tuổi nhỏ nhất 25, lớn nhất 51
Bảng 1: Đặc điểm BN ghép TBG tạo máu đồng loài
Vào thời điểm ngày 30 sau ghép, 6 BN (75%) đạt tình trạng khảm hoàn toàn, 2 BN (25%) chỉ đạt khảm hỗn hợp, trong đó 1 BN đạt thể khảm 32% và 1 BN đạt 67%
sang trái là: D3S1358, TH01, D13S317; D16S539; D2S1338 Hàng trên c ng là mẫu ADN người cho trước ghép Hàng 2 là mẫu ADN BN trước ghép Hàng 3 là mẫu AND
BN ngày 30 sau ghép (D30) Ngày D30 sau ghép, phân tích mẫu máu BN thấy 100% là
ADN của người cho, 0% là ADN BN
Trang 6Các mẫu máu được tách ADN và khuếch đại marker STR Hình 2 là hình ảnh phân tích
5 locus STR của 1 BN (BN số 2) trước ghép và ngày 30 sau ghép Phân tích cho thấy ở
BN này, các locus D13S31, D16S539, D2S1338 là những locus mang thông tin
BµN LUËN
Ngày nay, ghép TBG tạo máu là một
phương pháp điều trị có thể cứu sống BN
m c bệnh máu ác tính hoặc BN suy tủy
xương Sau ghép TBG, biểu hiện tái phát
bệnh là một dấu hiệu thất bại của ca ghép
Phát hiện sớm tình trạng tái phát có thể
giúp sớm quyết định biện pháp điều trị bổ
sung hiệu quả Do vậy, với những BN ghép
TBG tạo máu đồng loài, cần thiết phải làm
xét nghiệm phân tích đậu mảnh ghép sau
ghép để khẳng định mảnh ghép đ mọc và
để phát hiện tình trạng mọc ghép hay tái
phát sau ghép [5]
Các đặc tính đa hình của ADN được
d ng để theo dõi mọc ghép sau ghép đồng
loài, không d ng đánh giá tình trạng mọc
ghép sau ghép tự thân [5] Trong trường
hợp người cho là anh/chị em sinh đôi giống
nhau về di truyền, các đặc tính đa hình của
ADN cũng không có giá trị Tính đa hình có
giá trị nhất d ng cho mục đích này là biến
thể ở một số trình tự lặp lại nhất định, các
trình tự lặp lại này được gọi là đoạn lặp
ng n ngẫu nhiên (STR) [1] Locus STR mang
thông tin là locus mà ở đó có ít nhất 1 alen
người nhận có số lượng đoạn lặp lại khác
với alen người cho Vì người cho và người
nhận thường có quan hệ họ hàng với nhau,
nên người cho và người nhận có nhiều alen
giống nhau Vì vậy, cần phân tích trên nhiều
locus STR để xác định được ≥ 1 locus mang
thông tin Việc nhân bản đồng thời nhiều locus trong một ống phản ứng cho phép xác định được locus mang thông tin Khi thực nghiệm pha lo ng mẫu người cho và người nhận để xây dựng đường chuẩn, chúng tôi nhận thấy, mức 5% có thể tái lập được bằng phương pháp thực nghiệm Thậm chí, mức
< 5% vẫn có thể tìm thấy đỉnh khác biệt Ngoài ra, việc phân tích nhiều alen làm tăng
độ tin cậy của kết quả, do làm tăng cơ hội đánh giá các đỉnh mang thông tin Một số locus mặc d mang ngh a về mặt k thuật, nhưng không tốt để xác định tình trạng khảm, vì có sự tồn tại của các dải lặp lại (hay “bóng đỉnh”), các dải này chủ yếu xuất hiện ở dạng 2 đỉnh phụ dọc theo đỉnh alen chính Sự có mặt của các đỉnh lặp lại ảnh hưởng đến việc lựa chọn locus mang thông tin d ng để phân tích mọc ghép Do đó, khi phân tích cần loại bỏ các alen phụ này
KÕT LUËN
Viện Huyết học Truyền máu TW hiện đ tiến hành ghép TBG đồng loài cho một số mặt bệnh như rối loạn sinh tủy, bệnh bạch cầu cấp d ng tủy, đái huyết s c tố kịch phát ban đêm Tuổi của BN ghép nhìn chung là trẻ (< 55 tuổi) Kết quả sau ghép có đến 75% đạt tình trạng khảm hoàn toàn, 25% đạt tình trạng khảm hỗn hợp Kết quả này phản ánh chất lượng ghép của Việt Nam ở mức độ khá, tương đương trình độ của khu vực Với việc phân tích các alen STR, lần đầu tiên ở Việt Nam, đ áp dụng thành công
Trang 7phương pháp sinh học phân tử trong đánh
giá tình trạng khảm sau ghép TBG đồng
loài với độ tin cậy, độ chính xác cao, loại trừ
được những khó khăn trong xác định mọc
ghép ở trường hợp ghép c ng nhóm máu,
ghép đồng giới
TµI LIÖU THAM KH¶O
1 Butler JM Forensic ADN typing: Biology
and technology behind STR marker Academic
Press London 2001
2 Catalin Marian, Andrei Anghel, Simona
Maria Bell, Beatrix Katalin Frencz, Sorin Ursoniu,
Milan Dressler, Octavian Popescu, Bruce Budowle
STR data for the 15 AmpF/STR Identifiler loci in
the Western Romanian population Forensic Science
International 2007, 170, pp.73-75
3 Chen DP, Tsao KC, Wang PN, Tseng
CP, Sun CF Quantitative analysis of chimerism
after allogeneic peripheral blood stem cell
transplantation Chang Gung Med J 2002 Nov,
25 (11), pp.734-742
4 Lobashevsky AL, Senkbeil RW, Townsend
JE, Mink CA, Thomas JM Quantitative analysis
of chimerism using a short tandem repeat method
on fluorescent automated ADN sequencer Clin Lab Haematol 2006, 28, pp.40-49
5 Ma X, Wu D, Sun A et al The value of
monitoring minimal residual disease in the patients with donor lymphocyte infusion as intervention of relapse/refractory acute lymphoblastic leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
Am J Hematol 2010, 85, pp.141-142
6 Goh RY, Kim SH, Han JY Lineage-specific
chimerism analysis in nucleated cells, T cells and natural killer cells after myeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Korean
J Hematol 2011 Mar, 46 (1), pp.18-23
7 Weng L, Dyson J, Dazzi F Low-intensity
transplant regimens facilitate recruitment of donor-specific regulatory T cells that promote hematopoietic engraftment Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104, pp.8415-8420