Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm xây dựng hệ thống định lượng alpha fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1XÂY DỰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN
TỪ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN
ĐƯỢC SẢN XUẤT TỪ TẾ BÀO LYMPHÔ B CỦA CHUỘT LOU
Phan Ngọc Tiến*
TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein trong huyết thanh từ kháng thể
đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP)
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm
Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng
kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983F,
có thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng/ml Nghiên cứu định lượng AFP trong 90 mẫu huyết thanh, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có HBsAg (+), 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân
u gan Giá trị AFP tương ứng là 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP trong huyết thanh ở bệnh nhân u gan là > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%)
Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP được sản xuất từ chuột
LOU có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5-350ng/ml
ABSTRACT
THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTI-ALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT
Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 11 - No 4 - 2007: 208 - 212
Purpose: Set up the system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using
monoclonal antibodies
Method: Experimental research
Results: The test ELISA for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal
antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml
In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples
of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP
< 500 ng/ml (24%), respectively
Conclusion: The system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal
antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng
được Georges Kohler và César Milstein trình
bày năm 1975(1), và từ đó cho đến nay kháng
thể đơn dòng đã được ứng dụng trong rất
nhiều lĩnh vực nhất là trong kỹ thuật nhận diện và định lượng kháng nguyên
Alpha-fetoprotein (AFP), một glycoprotein, có trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, được tổng hợp ở gan phôi thai và túi ối, vì vậy nồng độ AFP bình thường trong dịch ối và huyết thanh
Trang 2bào thai người rất cao Tuy nhiên AFP có trong
huyết thanh người sau sinh và người trưởng
thành rất thấp, chỉ khoảng 3ng/ml(7,9,11)
Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên
phát AFP tăng rất cao, và việc định lượng AFP
trong huyết thanh gốp phần chẩn đoán bệnh
ung thư gan nguyên phát
Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, được
sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã
mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983(3), chúng
tôi xây dựng hệ thống định lượng AFP trong
huyết thanh người bằng kỹ thuật ELISA(5,10)
Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng hệ thống định lượng
alpha-fetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng
kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế
bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với
AFP và dòng tế bào IR983
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm
Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu
- Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể
đơn dòng kháng AFP có gắn men peroxidase
- Và 90 mẫu huyết thanh, được thu thập tại
Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế
và Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh
Trong đó 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân
có siêu âm hoặc CT scan phát hiện u gan, trong
đó 20 nam và 5 nữ, 16 mẫu huyết thanh của
bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan siêu vi B
cấp HBsAg (+), trong đó 9 nam và 7 nữ, 14
mẫu huyết thanh có HBsAg (+) nhưng không
có biểu hiện lâm sàng, trong đó 10 nam – 4 nữ,
35 mẫu huyết thanh của người bình thường
khỏe mạnh, HBsAg (-)
Phương pháp thu thập số liệu
- Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa hai
đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật độ quang
tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA
- Xác định mật độ quang tương ứng của các
nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300,
350, 400, 500 ng/ml Chúng tôi sử dụng AFP tinh chế và chuẩn độ của Viện Pasteur Tp HCM
- Xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU: dùng phương pháp ELISA
- Xác định mật độ quang tương ứng của các nồng độ thấp của AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; 5 ng/ml Từ đó xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU với phương pháp ELISA
- Định lượng AFP trong các mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng sử dụng kháng thể đơn dòng của chuột LOU: dùng phương pháp ELISA
Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh
số thứ tự từ 1 đến 90, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường được đánh số từ
1 đến 35, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân
có HBsAg (+) được đánh số từ số 36 đến 49, 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu
vi B cấp được đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh
số từ 66 đến 90 Lần 1 mẫu huyết thanh định lượng không pha loãng, lần 2 những mẫu huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1
sẽ được pha loãng với tỉ lệ 1:2 Những mẫu huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên 350ng/ml thì chúng tôi quyết định lấy kết quả cuối cùng là trên 500 ng/ml
Xử lý số liệu
Chương trình Point To Point, chương trình dùng cho xử lý số liệu trong kỹ thuật Elisa để tính kết quả định lượng nồng độ AFP Chương trình SPSS 11.5
KẾT QUẢ Quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng
độ AFP và giá trị mật độ quang tương ứng
Với kết quả thu được chúng tôi nhận thấy khi nồng độ AFP tăng thì DO cũng tăng theo Nhưng đến nồng độ AFP bằng 350, 400, 500 ng/ml thì DO tăng không đáng kể
Trang 3Do vậy chúng tôi chỉ ứng dụng định lượng
nồng độ AFP trong huyết thanh đến mức cao
nhất là 350ng/ml
Qua đường cong chuẩn của hệ thống định
lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng
kháng AFP của chuột LOU (đồ thị 1), chúng
tôi nhận thấy hai đại lượng DO và nồng độ
AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận
+ r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO và
nồng độ AFP có mối liên hệ thuận rất chặt chẽ
+ Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng:
y = a + bx, trong đó:
Như vậy phương trình hồi qui tuyến tính là: y = 0,599 + 0,0055x
+ P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan tuyến tính theo chiều thuận giữa hai đại lượng
DO và nồng độ AFP là rất rõ rệt, sự tương quan có ý nghĩa thống kê
AFP (ng/ml)
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
9 8 7
6 5
4
3
2 1
Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou
AFP (ng/ml)
6 5
4 3
2 1
0
,30
,25
,20
,15
,10
,05
0,00
8
7
6 5 4 2 1
Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn những giá trị thấp của nồng độ AFP
Kết quả nồng độ AFP chuẩn thấp nhất mà hệ
thống định lượng AFP dựa trên kháng thể
đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể
định lượng được (đồ thị 2)
Qua đường biểu diễn trên ta thấy khi nồng
độ AFP giảm thì giá trị DO giảm theo, nhưng khi đến nồng độ 0,5 ng/ml thì đường biểu diễn
đi ngang Do vậy giá trị thấp nhất mà hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng
Trang 4được là 0,5 ng/ml
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các
mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng
AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP
của chuột LOU
S ố th ứ t ự
m ẫ u huy ế t
thanh
S ố m ẫ u
huy ế t
thanh
Giá tr ị
nh ỏ nh ấ t
Giá tr ị l ớ n
nh ấ t
Giá tr ị
trung bình
1-35 35 1,08 7,26 2,7780
36-49 14 0,91 6,08 3,7993
50-65 16 6,2 113,53 32,1806
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những
bệnh nhân u gan (những mẫu huyết thanh từ
số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6
mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%)
BÀN LUẬN
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein
trong huyết thanh người bằng phương pháp
Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng được sản
xuất từ tế bào lymphô B của chuột Lou và
dòng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao vì có khả năng định lượng AFP ở
nồng độ rất thấp là 0,5ng/ml so với hệ thống
định lượng của các hãng khác là Abbott
0,4ng/ml(2) và Maxim Biotech 2ng/ml(6), và
AFP-L có thể định lượng nồng độ AFP cao
nhất là 350ng/ml so với của hãng Abbott là
350ng/ml(2) và Maxim Biotech là 300mg/ml(6)
Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao vì qua các
thử nghiệm đặc tính và định lượng không có
phản ứng chéo với các protein của huyết thanh
nhất là với albumin, protein có trọng lượng
phân tử và cấu trúc gần giống với AFP
Kết quả định lượng nồng độ AFP trong 90
mẫu huyết thanh có kết quả tương đồng với
các nghiên cứu trong và ngoài nước(2,6,8)
Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng
kháng thể đơn dòng được sản xuất từ chuột
Lou có khả năng định lượng AFP trong huyết
thanh từ 0,5-350ng/ml, và chúng tôi hy vọng
góp phần nhỏ trong việc sử dụng những hệ
thống định lượng AFP
KẾT LUẬN
Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP
và dòng tế bào IR983, có thể định lượng nồng
độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng đến 350ng/ml
Mật độ quang và nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p = 0,002 (< 0,01), và y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x: nồng độ AFP chuẩn)
Kết quả nồng độ AFP định lượng bằng hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những người bình thường là 2,8 ng/ml
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân có HBsAg(+) là 3,8 ng/ml
Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp là 32,1 ng/ml Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%)
Cám ơn: GS.TS Nguyễn Lê Trang, Viện Pasteur Tp HCM,
BS Cao Đức Trùng Dương và BS Lưu Thị Thanh Loan, BV Từ
Dũ Tp HCM đã giúp thực hiện nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
division of Harcourt Brace Company, USA
Edition, Vol 2, pp.1381-1383
of Allergy Guy’s Hospital, London
Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA, USA
nguyên phát”, Nội khoa y học, TTĐT&BDCBYT, tập 3(4),
tr.24-28
Alpha-fetoprotein ở 37 bệnh nhân được chẩn đoán lâm
sàng là viêm gan B cấp tính”, Tạp chí y học thực hành, (3), tr
1-3
Trang 59. Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học
(1993), “Đánh giá khả năng chẩn đoán ung thư gan của
Alpha-fetoprotein”, Y học Việt Nam, (5), tr.31-35