Cấy tủy xương để đánh giá số lượng tế bào gốc trung mô thông qua các đơn vị tạo khúm nguyên bào sợi (CFU-FS)

Ở Việt Nam chưa thấy có một nghiên cứu nào xác định đặc điểm của tủy xương liên quan đến khả năng tạo xương của tủy xương. Khả năng tạo xương của tủy xương là nhờ các tế bào gốc trung mô, được đánh giá thông qua số lượng CFU-Fs. Vì vậy đề tài thực hiện nghiên cứu nuôi cấy tế bào tủy và đếm số lượng CFU-Fs của tủy xương người Việt Nam.

CẤY TỦY XƯƠNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ SỐ LƯỢNG TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THÔNG QUA CÁC ĐƠN VỊ TẠO KHÚM NGUYÊN BÀO SỢI (CFU-FS)

Trần Công Toại*, Cao Thỉ**

TÓM TẮT

Đặt vấn đề: Ở Việt Nam chưa thấy có một nghiên cứu nào xác định đặc điểm của tủy xương liên quan

đến khả năng tạo xương của tủy xương Khả năng tạo xương của tủy xương là nhờ các tế bào gốc trung mô, được đánh giá thông qua số lượng CFU-Fs.Vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu nuôi cấy tế bào tủy và đếm số lượng CFU-Fs của tủy xương người Việt Nam

Phương pháp Khoảng 2.0 ml tủy xương được lấy vô trùng pha với 0.1 ml heparin (5000IU/ml) Tủy

được cấy vào môi trường IMDM, 15% FBS, kháng sinh Mẫu được nhuộm Giemsa để quan sát và đếm khúm tế bào CFU-Fs sau 7 ngày nuôi cấy Có 20 mẩu tủy được cấy và đếm CFU-Fs

Kết quả: Nồng độ tế bào đơn nhân sau khi phân lập: 43,9x10 6 /ml, Số CFU-Fs trung bình đếm được sau

7 ngày nuôi: 79,95

ABSTRACT

CULTURE BONE MARROW TO EVALUATE MESENCHYMAL STEM CELLS BY MEANS

OF COUNT OF CFU-FS

Tran Cong Toai, Cao Thi * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 12 - Supplement of No 4 - 2008: 488 – 490

Introduction: There aren’t studies about osteogenic potential of bone marrow in Viet Nam Mesenchymal

stem cells (MSCs) are responsible for osteogenic capacity of bone marrow So, to assess quantity of Vietnamese MSCs, we culture bone marrow and count fibroblast colony forming units (CFU-Fs)

Material and results: Average 2ml of non-infected bone marrow is mixed with 500IU heparin and

cultured in medium IMDM, 15% FBS and antibiotic Giemsa stain is used and CFU-Fs is counted after 7

days Twenty individuals are enrolled in this study After isolated, average concentration of nucleated cells is 43.9x10 6 /ml After 7 days of culture, average of CFU-Fs reaches 79.95

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khả năng tạo xương của tủy xương đã

được Goujon nêu lên từ năm 1869[2] Các thực

nghiệm tế bào – sinh hóa, thực nghiệm ứng

dụng của tủy xương trên động vật thí nghiệm,

cũng như một số các nghiên cứu trên tủy

người cho thấy tủy xương có tính chất tạo

xương Tủy xương bao gồm nhiều loại tế bào,

trong đó có tế bào gốc dòng tạo máu và tế bào

gốc trung mô Các tế bào gốc trung mô là các

tế bào trong thành phần mô đệm của tủy

xương Các tế bào này biệt hóa thành nhiều

kiểu hình tế bào khác nhau, trong đó có các

tiền tế bào tạo xương Nhờ các tế bào này mà

tủy xương có tính chất tạo xương Để đánh giá

số lượng của tế bào gốc trung mô trong tủy, cần phải cấy tủy và đếm số lượng các đơn vị tạo khúm nguyên bào sợi (CFU-Fs) sau khi nuôi cấy Và do đó số lượng CFU-Fs đặc trưng cho khả năng tạo xương của tủy Ở Việt Nam, chưa thấy một báo cáo nào nghiên cứu đặc điểm của tủy xương liên quan đến tính chất tạo xương của tủy, cụ thể là đếm số lượng CFU-Fs Nhằm rút ra đặc điểm tủy xương liên quan đến tính chất tạo xương ứng dụng trong ngành chấn thương chỉnh hình, so sánh với một số y văn thế giới, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nuôi cấy tủy xương và đếm số lượng CFU-Fs

* Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch ** Đại Học Y Dược TP HCM

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Có 20 bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu

Các bệnh nhân này là các bệnh nhân chấn

thương cơ quan vận động có phẫu thuật và

được chọn ngẫu nhiên trong số các bệnh nhân

của Khoa Chấn Thương Chỉnh Hình bệnh viện

Chợ Rẫy Trong lúc bệnh nhân đang được mổ,

2ml tủy xương được lấy từ mào chậu trước

Dùng kim chọc tủy chọc vào mào chậu hút ra 1

ml tủy, thay đổi vị trí đầu kim đến nơi khác

trong mào chậu và hút thêm 1ml tủy Cả 2ml

tủy được cho vào ống nghiệm vô trùng có pha

sẵn 500IU heparin để chống đông Sau đó tủy

được đưa về phòng thí nghiệm và xử lý trong

vòng 4 giờ sau khi lấy Tại đây, tủy được ly

tâm tách và đếm tế bào có nhân Thành phần

tế bào được cấy vào môi trường IMDM, 15%

FBS, có pha kháng sinh để chống nhiễm

khuẩn Sau 7 ngày, khi các khúm tế bào mọc

thấy rõ, mẩu cấy sẽ được nhuộm giemsa để

quan sát và đếm khúm tế bào Mỗi khúm tế

bào được xem là một CFU-F khi khúm phát

triển được nhiều hơn 50 tế bào

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả phân lập tế bào và đếm CFU-Fs

được cho trong bảng 1

Kết quả phân lập tế bào

Nồng độ tế bào có nhân biến thiên rất lớn

từ 10x106 đến 160x106 tế bào trên mỗi ml tủy

Nồng độ tế bào trung bình trong mỗi ml tủy

bằng 43,9X106 với độ lệch chuẩn là 41,2X106

Theo nghiên cứu của Major và cộng sự thì

trung bình mỗi ml tủy hút ra từ mào chậu

người khỏe mạnh có chứa 46 ±±±± 32,5x106 tế bào

có nhân[3] So sánh hai giá trị trung bình cho

thấy kết quả của chúng tôi không khác biệt với

kết quả của Major (p<0,05) Đối với nghiên cứu

của Hernigou, số lượng tế bào có nhân trong

tủy của các bệnh nhân khớp giả xương chày

chỉ 18±7x106 [1] Số liệu này có thể là do các

bệnh nhân bị khớp giả thường có số tế bào tủy

ít hơn, hoặc cũng có thể do cách lấy tủy của tác

giả này là chích hút mỗi nơi đầu kim trong cánh chậu đến 4ml tủy

Kết quả đếm số CFU-Fs

Số CFU-Fs cũng biến thiên rất rộng từ 29 đến 156, trung bình là 79,95 Độ lệch chuẩn là 73,2 So với nghiên cứu của Seebach và cộng

sự thì ở nam giới khỏe mạnh, số CFU-Fs đếm được là 54±±±±17[4] Như vậy theo cách lấy tủy và môi trường cấy của chúng tôi, số CFU-Fs đạt được nhiều hơn Cũng theo nghiên cứu của Seebach thì ở những bệnh nhân đa thương sẽ cho kết quả số CFU-F lớn hơn (59±25) Τrong khi đó theo kết quả của Hernigou thì có thể đếm được 612±134 CFU-Fs trên mỗi cm3 (12-1224) sau 10 ngày nuôi cấy tủy Số lượng tế bào có nhân ít hơn nhưng thu được nhiều CFU-Fs hơn Điều này cho thấy sự khác biệt là

do môi trường cấy và thời gian cấy, chứ không liên quan đến cách lấy tủy

Liên quan giữa số lượng tế bào có nhân

và số CFU-Fs

Dùng bảng ANOVA phân tích phương sai

1 yếu tố thì kết quả của chúng tôi không thấy

có mối liên hệ giữa số lượng tế bào có nhân và

số lượng CFU-Fs đếm được (p=0,11) Hernigou ghi nhận có thể thu được 1 CFU-F trong 3x104

tế bào có nhân của tủy xương, rong khi đó chúng tôi chỉ thu được trung bình là 1 CFU-F trong 53,6x104 tế bào có nhân

Liên quan giữa số CFU-Fs và tuổi, giới

Bằng cách tương tự không thấy mối liên hệ giữa số CFU-Fs so với tuổi (p=0,9) và với giới tính (p=0,88)

Bảng 1: Kết quả phân lập tế bào và đếm số CFU-Fs

STTN ă m sinhGi ớ i tính Th ể tích

m ẫ u (ml)

M ậ độ

tb/ml (X10 7 )

S ố CFU-FS

STTN ă m sinhGi ớ i tính Th ể tích

m ẫ u (ml)

M ậ độ

tb/ml (X10 7 )

S ố CFU-FS

STTN ă m sinhGi ớ i tính Th ể tích

m ẫ u (ml)

M ậ độ

tb/ml (X10 7 )

S ố CFU-FS

4,4  0,9 79,95  8,31

Một số hình ảnh nuôi cấy:

Mẫu sau 1 ngày nuôi Mẫu sau 3 ngày nuôi

Mẫu sau 7 ngày nuôi Mẫu sau ngày nuôi Nhuộm Giemsa

KẾT LUẬN

Chúng tôi xây dựng được qui trình thu

nhận tế bào trung mô tủy xương rút ra từ mào

chậu Kết quả mỗi ml tủy trung bình chứa

43,9x106 tế bào có nhân Sau khi cấy 7 ngày

đếm được 79,95 CFU-Fs Đây là kết quả bước

đầu cấy tủy đếm CFU-Fs, là tài liệu tham khảo

cho các tác giả có quan tâm đến vấn đề tế bào

gốc trung mô

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Hernigou P., Poignard A., Beaujean F., Rouard H (2005),

“Pecutaneous autologous bone marrow grafting for

nonunion Influence of the number and concentration

of progenitor cells”, JBJS,87A(7),pp.1430-1437

2 Hernigou P., Poignard A., Manicom O., Mathieu G., Rouard H (2005), “The use of pecutaneous autologous bone marrow transplantation in nonunion and avascular

necrosis of bone”, JBJS, 87B,pp 896-902

3 Majors A.K., Boehm C.A., Nitto H., Midura R.J., Muschler G.F (1997), “Characterization of human bone marrow

stromal cells with respect to osteoblastic differentiation”, J

Orthop Res,15(4),pp.546-557

4 Seebach C, Henrich D, Tewksbury R, Wilhelm K, Marzi I (2007), “Number and proliferative capacity of human mesenchymal stem cells are modulated positively in multiple trauma patients and negatively in atrophic

nonunions”, Calcif Tissue Int,80(4),pp.294-300