Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá sự biến đổi hình thái vi thể mô buồng trứng (MBT) chuột sau bảo quản lạnh sâu và bước đầu so sánh hiệu quả bảo quản MBT chuột giữa môi trường bảo quản có EDS (etylen glycol; dimethyl sulphoxide; sucrose) và PDS (1,2 propanediol; dimethyl sulphoxide; sucrose).
Trang 1BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC VI THỂ CỦA MÔ BUỒNG TRỨNG CHUỘT CỐNG TRẮNG SAU BẢO QUẢN LẠNH
BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA
Nguyễn Thị Hương*; Đỗ Thùy Hương*
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá sự biến đổi hình thái vi thể mô buồng trứng (MBT) chuột sau bảo quản
lạnh sâu và bước đầu so sánh hiệu quả bảo quản MBT chuột giữa môi trường bảo quản có EDS
(etylen glycol; dimethyl sulphoxide; sucrose) và PDS (1,2 propanediol; dimethyl sulphoxide;
sucrose) Đối tượng và phương pháp: chia MBT của 10 chuột thành 3 nhóm: nhóm tươi, nhóm
EDS (thủy tinh hóa [TTH] có sử dụng EDS) và nhóm PDS (TTH có sử dụng PDS) Sử dụng kỹ
thuật hiển vi quang học để đánh giá sự biến đổi cấu trúc mô học của nang trứng sau r đông
Kết quả: tỷ lệ nang trứng có hình thái bình thường sau bảo quản lạnh ở nhóm EDS cao hơn có
ý nghĩa thống kê so với nhóm PDS, tương ứng là 35,6% và 26,6% Tuy nhiên, không có sự
khác biệt về tỷ lệ nang trứng nguyên thủy có hình thái bình thường sau bảo quản lạnh giữa ba
nhóm (61,8%, 53,8% và 55,9%, p > 0,05) K ết luận: TTH MBT chuột cống trắng có thể bảo tồn
được phần lớn nang trứng nguyên thủy
* Từ khóa: Mô buồng trứng chuột; Thủy tinh hóa; Biến đổi cấu trúc vi thể
Microstructural Changes of Rat Ovarian Tissue after Vitrification
Summary
Objectives: To assess the microstructural changes of rat ovarian tissue after vitrification and
compare efficient protection of rat ovary tissue between EDS (ethylene glycol, dimethyl sulphoxide,
sucrose) and PDS (1.2 propanediol, dimethyl sulphoxide, sucrose) Subjects and methods:
Ovarian tissues of 10 rats were divided into 3 groups: fresh group, EDS group (vitrification using
EDS) and PDS group (vitrification using EDS) Evaluation of the microstructural changes of
follicles in three groups after thawing under optical microscopy Results: The percentages of
the morphologically normal follicles in the EDS group was significanty higher than that in the
PDS group (35.6% vs 26.6%, p < 0.05) However, there was no difference in the percentage of
morphologically normal primordial follicleamong three groups (61.8%, 53.8% and 55.9%, p > 0.05)
Conclusion: Vitrification of rat ovarian tissue could preserve majority of primordial follicle
* Keywords: Rat ovary tissue; Vitrification; Microstructural changes
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trữ lạnh MBT là một trong các phương
pháp để bảo tồn chức năng sinh sản cho
phụ nữ Chỉ định này đặc biệt phù hợp cho các bé gái và phụ nữ có nguy cơ bị suy buồng trứng sớm do tác dụng phụ của hóa trị và xạ trị trong điều trị ung thư
* Trường Đại học Y Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Thuỳ Hương (dohuong2112@gmail.com)
Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017
Trang 2Phẫu thuật cấy ghép lại MBT sau bảo
quản lạnh có thể phục hồi chức năng sinh
sản và nội tiết [1] Ngày nay, trên toàn thế
giới đ có tới > 70 em bé được sinh ra
sau khi cấy ghép MBT [2]
Có hai kỹ thuật bảo quản MBT được
sử dụng hiện nay: trữ lạnh theo chương
trình và TTH Trữ lạnh theo chương trình
là kỹ thuật kinh điển, được áp dụng từ
rất sớm và đến nay vẫn được ghi nhận
trong hiệu quả bảo tồn MBT TTH là kỹ
thuật mới, được phát triển để trữ lạnh
MBT trong khoảng một thập kỷ trở lại đây,
với ưu điểm tiết kiệm thời gian, dễ thực
hiện Nhiều nghiên cứu gần đây đánh giá
cao hiệu quả bảo tồn MBT của kỹ thuật
này Năm 2015, chúng tôi đ thử nghiệm
TTH MBT thỏ Để chuẩn hóa quy trình và
tìm hiểu sự biến đổi của nang trứng sau
bảo quản lạnh, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm
trên buồng trứng của chuột cống trắng với
mục tiêu: Đánh giá sự biến đổi hình thái
vi thể MBT chuột sau bảo quản lạnh sâu
và bước đầu so sánh hiệu quả bảo quản
MBT chuột giữa môi trường bảo quản có
EDS và PDS
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
MBT của 10 chuột cống trắng cái thuần
chủng khỏe mạnh, 7 - 8 tuần tuổi, trọng
lượng 100 - 130 gram
2 Phương pháp nghiên cứu
- Cắt MBT của mỗi chuột thành những
miếng nhỏ, chia ngẫu nhiên vào 3 nhóm:
nhóm chứng, nhóm EDS (nhóm bảo quản
lạnh sâu bằng kỹ thuật TTH, môi trường
bảo quản gồm 3 chất etylen glycol (EG),
dimethyl sulphoxide (DMSO), sucrose), nhóm PDS (nhóm bảo quản lạnh sâu bằng
kỹ thuật TTH, môi trường bảo quản gồm
3 chất 1,2 propanediol (PrOH), DMSO, sucrose) với kích thước mảnh mô 3 - 4 x
2 x 1 - 2 mm
- Cố định các mảnh mô của lô chứng trong dung dịch bouin để làm tiêu bản nhuộm H.E (hematoxylin eosin) đánh giá
mô học
- Thả mảnh mô của hai nhóm còn lại vào dung dịch PBS có 10% FBS chuẩn bị cho quy trình bảo quản Bảo quản mô trong nitơ lỏng trong thời gian 3 tuần, sau
đó r đông để làm tiêu bản nhuộm H.E đánh giá mô học
* Quy trình TTH:
- Nhóm EDS: theo phương pháp của Hye Won Youm (2013) [3]:
+ Ủ mảnh mô trong môi trường E1 và E2 với nồng độ và thời gian như sau: E1: PBS + 20% FBS + 7,5% EG + 7,5% DMSO: 10 phút
E2: PBS + 20% FBS + 20% EG + 20% DMSO + 0,5 mol/l S: 5 phút
+ Đặt mảnh mô vào cryotop (cọng đông phôi), thả vào nitơ lỏng
- Nhóm PDS: theo phương pháp của Li Yu-bin (2007) [4]:
+ Ủ mảnh mô trong môi trường P1 và P2 với nồng độ và thời gian như sau: P1: DMEM + 10% FBS + 0,1 mol/l S + 2,0 mol/l DMSO: 5 phút
P2: DMEM + 10% FBS + 0,2 mol/l S + 2,0 mol/l DMSO + 2,0 mol/l PrOH: 5 phút + Đặt mảnh mô vào cryotop (cọng đông phôi), thả vào nitơ lỏng
Trang 3* Quy trình rã đông:
- Nhóm EDS:
Lấy cryotop chứa mẫu ra khỏi bình
chứa nitơ lỏng, thả vào PBS 370C cho tới
khi tan đá hoàn toàn Rửa mảnh mô bằng
PBS, 20% FBS với nồng độ sucrose giảm
dần 1 mol/l, 0,5 mol/l; 0,25 mol/l; 0 mol/l
Đặt vào tủ ấm 370
C, 5% CO2 trong 30 phút
- Nhóm PDS:
Lấy cryotop ra khỏi bình chứa nitơ
lỏng, thả vào PBS 370C cho tới khi tan đá
hoàn toàn Rửa mảnh mô bằng DMEM,
10% FBS với nồng độ sucrose giảm dần
0,5 mol/l; 0,25 mol/l; 0,125 mol/l; 0 mol/l
Đặt vào tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 30 phút
* Chỉ tiêu nghiên cứu:
So sánh sự biến đổi về mặt hình thái của
các loại nang trứng có trong MBT giữa
3 nhóm nghiên cứu theo tiêu chuẩn xếp loại nang trứng như sau:
- Nang trứng bình thường: noãn có hình dạng tròn đều, cân đối Màng trong suốt
có cấu trúc nguyên vẹn Tế bào nang,
tế bào hạt phân bố đều đặn, khoảng cách giữa các tế bào nhỏ
- Nang trứng bất thường: noãn méo mó, biến dạng hoặc thoái hóa, ly giải Màng trong suốt không còn nguyên vẹn hoặc bị
ly giải Tế bào nang, tế bào hạt sắp xếp lộn xộn, không liên tục hoặc thoái hóa, nhân đông vón, tách rời khỏi bờ nang trứng
Để tránh việc khảo sát nang trứng bị trùng lặp, mảnh mô được đúc block nến
và cắt lát dày 4 µm, cứ 16 lát lấy một lát
mô để khảo sát
* Xử lý số liệu: bằng SPSS 16.0 Sử
dụng thuật toán khi bình phương để so sánh hai tỷ lệ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tổng số có 738 nang trứng được khảo sát ở cả 3 nhóm nghiên cứu Trong 4 loại nang trứng có mặt trong MBT (nang trứng nguyên thủy, nang nguyên phát, nang trứng đặc, nang trứng có hốc), nang trứng nguyên thủy chiếm tỷ lệ 27,2%; 42,5%; 30,7% tương ứng ở nhóm chứng, nhóm EDS, nhóm PDS Nang trứng nguyên phát chiếm tỷ lệ cao nhất ở nhóm chứng, nhóm EDS, nhóm PDS tương ứng là 51,7%; 42,5%; 37,5%
1 Số ượng và tỷ lệ nang trứng c h nh thái nh thường
Bảng 1:
Nhóm
Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p < 0,05)
Trang 4Ở MBT tươi của chuột, 38,2% nang trứng
có hình thái bình thường Quá trình TTH làm
các nang trứng bị biến đổi cấu trúc dẫn tới tỷ
lệ này bị giảm đi Cụ thể: nhóm EDS giảm còn
35,6%, tuy nhiên sự khác biệt so với mô tươi
không có ý nghĩa thống kê Nhóm PDS có tỷ lệ
nang trứng bình thường thấp nhất trong 3
nhóm (26,6%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê khi so sánh giữa nhóm PDS và 2 nhóm
chứng và EDS
2 Số lượng và tỷ lệ nang trứng bình
thường theo giai đoạn tiến triển
Ở MBT tươi của chuột, 61,8% nang trứng
nguyên thủy có hình thái bình thường Quá
trình bảo quản lạnh và rã đông làm cho một
số nang trứng nguyên thủy bị thoái hóa biến
dạng, dẫn tới tỷ lệ này bị giảm còn 53,8% và 55,9% tương ứng ở nhóm EDS và PDS Tuy nhiên, sự khác biệt ở cả 3 nhóm không có ý nghĩa thống kê
Về chất lượng của nang trứng tiến triển sau bảo quản: quá trình TTH làm thay đổi cấu trúc nang trứng tiến triển một cách nặng
nề, đặc biệt là nang trứng đặc và nang trứng
có hốc Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm EDS và nhóm chứng về
tỷ lệ bình thường của các nang trứng tiến triển, tuy nhiên sự khác biệt này thấy rõ khi
so sánh giữa nhóm chứng và nhóm PDS
Bảng 2:
Nhóm
Loại nang
Số nang
khảo sát
Số bình
thường
% bình thường
Số nang khảo sát
Số bình thường
% bình thường
Số nang khảo sát
Số bình thường
% bình thường
Số nang khảo sát
Số bình thường
% bình thường
Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p > 0,05)
3 Biến đổi các thành phần cấu tạo của nang trứng nguyên thủy sau bảo quản
Trang 5Chất lượng noãn và tế bào nang của nang trứng nguyên thủy bị giảm không đáng
kể sau quá trình TTT Không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi so sánh chất lượng noãn và tế bào nang ở cả 3 nhóm nghiên cứu
Bảng 3:
Nhóm
Thành phần cấu tạo
Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm EDS (p > 0,05)
4 Biến đổỉ các thành phần cấu tạo của nang trứng tiến triển sau bảo quản
Bảng 4:
Bình thường
(%)
Bất thường (%)
Bình thường (%)
Bất thường (%)
Bình thường (%)
Bất thường (%)
Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p < 0,05)
Trong 3 thành phần có mặt trong nang trứng tiến triển được khảo sát, noãn là thành phần bị biến đổi cấu trúc nhiều nhất Mức độ tổn thương sau bảo quản của màng trong suốt có xu hướng nhẹ hơn so với noãn Nhóm EDS có tỷ lệ noãn và màng trong suốt
có hình thái bình thường tương ứng 26,2% và 27%, thấp hơn so với nhóm chứng (31,9% và 31,9%) Tuy nhiên, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Sự khác biệt thấy rõ khi so sánh giữa nhóm PDS với nhóm chứng và nhóm EDS, tỷ lệ noãn và màng trong suốt bình thường còn 13,5% và 16,5%
Trang 6Tế bào hạt và tế bào vỏ là thành phần ít bị ảnh hưởng do tác động của TTH Tỷ lệ
tế bào hạt/vỏ bình thường ở nhóm EDS 35,7% so với 41,6% tỷ lệ cùng loại ở MBT tươi,
sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê Riêng nhóm PDS tỷ lệ này giảm còn 24,1%
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm PDS với nhóm chứng và EDS
1 x400 2 x400 3 x400
4 x400 5 x400 6 x400
8 x400 9 x400
Trang 77 x100 8 x400 9 x400
(Ảnh 1, 2, 3: nang trứng nguyên thủy; Ảnh 4, 5, 6: nang trứng đặc; Ảnh 7, 9: nang trứng có hốc; Ảnh 8: nang trứng nguyên phát)
Hình 1: Hình ảnh cấu trúc vi thể của MBT chuột trước và sau khi bảo quản lạnh
BÀN LUẬN
1 Biến đổi cấu trúc của nang trứng
sau bảo quản lạnh
Nang trứng nguyên thủy là nang trứng
chưa tiến triển, là lượng nang trứng dự trữ
của buồng trứng Mục tiêu của bảo quản
lạnh MBT là bảo tồn được càng nhiều loại
nang này càng tốt Kết quả nghiên cứu cho
thấy tỷ lệ nang trứng nguyên thủy có hình
thái bình thường ở MBT tươi (61,8%)
Sau TTH, một số nang trứng nguyên thủy
bị biến dạng, thoái hóa làm tỷ lệ này giảm
còn 53,8% và 55,9% tương ứng ở nhóm
EDS và PDS Tuy nhiên, không thấy sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 3 nhóm
nghiên cứu Với kết quả trên có thể khẳng
định khả năng chịu nhiệt tốt hơn của nang
trứng nguyên thủy so với các loại nang
trứng tiến triển khác trong quá trình bảo
quản lạnh Đặc tính này là do nang trứng
nguyên thủy có cấu tạo khác biệt: noãn có
kích thước nhỏ, ít bào tương, trong màng
bào tương có ít các thành phần nhạy cảm
với nhiệt, không có màng trong suốt, ít tế
bào hạt và do nang đang trong trạng thái
ngủ nên tốc độ chuyển hóa chậm
Khi phân tích chất lượng của nang trứng
tiến triển (nang trứng nguyên phát, nang
trứng đặc, nang trứng có hốc), sau bảo
quản chúng tôi thấy: so với các công bố
khác trên thế giới có sử dụng phương
pháp bảo quản tương tự, tỷ lệ nang trứng
tiến triển còn nguyên vẹn trong nguyên cứu này thấp hơn Chỉ một số ít các nang trứng nguyên phát và nang trứng đặc giữ được hình thái tương đối bình thường sau bảo quản đông nhanh Toàn bộ nang trứng có hốc đ bị biến dạng một trong các thành phần cấu tạo Nhóm PDS gây ảnh hưởng nặng nề nhất lên cấu trúc của nang trứng tiến triến, hầu như toàn bộ các nang trứng tiến triển đ bị biến đổi hoàn toàn Điều này do cấu tạo của nang trứng tiến triển có noãn là tế bào có kích thước lớn, trong bào tương có những thành phần nhạy cảm với nhiệt độ như thoi vô sắc đ hình thành dễ bị đứt gãy trong quá trình đông lạnh và r đông Vì vậy, gặp rất nhiều khó khăn trong việc bảo quản nang trứng tiến triển
2 Ảnh hưởng của nhóm TTH EDS và PDS lên biến đổi hình thái của nang trứng và các thành phần cấu tạo MBT
Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi so sánh tổng chất lượng nang trứng bình thường giữa hai nhóm EDS và PDS thấy: nhóm EDS cho kết quả bảo quản tốt hơn
so với nhóm PDS, đặc biệt đối với các nang trứng tiến triển Tỷ lệ noãn bị thoái hóa, ly giải ở nhóm PDS cao hơn so với nhóm EDS Chúng tôi cho rằng nhóm EDS bảo quản MBT chuột cống trắng tốt hơn nhóm PDS EG được sử dụng phổ biến cho quá trình TTH vì ít gây độc tính
và khả năng khuếch tán cao trong tế bào Thêm vào đó EG (62,07 kDa) có trọng
Trang 8lượng phân tử khối nhẹ hơn DMSO (78,13
kDa) và PrOH (76,09 kDa), dễ dàng thấm
vào MBT hơn Tuy nhiên, chính vì đặc
tính này nếu sử dụng riêng rẽ EG với
nồng độ cao và thời gian dài kết quả có
thể không tốt hơn so với DMSO hoặc
PrOH Để tận dụng tính thấm qua màng
của EG, các nghiên cứu gần đây có xu
hướng kết hợp EG với các chất bảo vệ
lạnh khác: EG + GLY được chứng minh
có hiệu quả trên bảo quản phôi, EG +
GLY + polymer cho kết quả tốt trên MBT
khỉ [5], EG + DMSO + sucrose là môi
trường tối ưu cho MBT chuột [3], EG +
DMSO + PrOH + polymer cho kết quả tốt
trên MBT người [6]
Chất bảo vệ lạnh có vai trò quyết định
thành công của quá trình TTH MBT của
các loài động vật khác nhau phù hợp với
chất bảo vệ lạnh khác nhau Trong nghiên
cứu này, chúng tôi thực hiện bảo quản
lạnh bằng kết hợp hai nhóm chất bảo vệ
lạnh khác nhau với phương pháp của hai
nhóm tác giả để khảo sát tác động của
các chất bảo vệ lạnh khi kết hợp với nhau
và tìm môi trường tối ưu cho bảo quản
MBT chuột
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi đưa
ra một số kết luận sau:
- Thủy tinh hóa có thể bảo tồn được
phần lớn nang trứng nguyên thủy
- Hỗn hợp chất bảo vệ lạnh: ethylen glycol, dimethyl sulfoxide và sucrose có xu hướng bảo tồn nang buồng trứng chuột cống trắng tốt hơn so với kết hợp của 1,2 propanediol, dimethyl sulfoxide và sucrose
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Amorim C.A et al Cryopreservation of
oocytes from pre-antral follicles Hum Reprod Update 2003, 9 (2), pp.119-129
2 Silber S et al Ovarian tissue cryopreservation
and transplantation: scientific implications Journal of Assisted Reproduction and Genetics
2016, 33 (12), pp.1595-1603
3 Youm H.W et al Optimal vitrification
protocol for mouse ovarian tissue cryopreservation: effect of cryoprotective agents and in vitro culture on vitrified-warmed ovarian tissue survival Hum Reprod 2014, 29 (4), pp.720-730
4 Li Y.B et al Modified vitrification method
for cryopreservation of human ovarian tissues Chin Med J (Engl) 2007, 120 (2), pp.110-114
5 Li Q et al Ovarian function reconstruction
by orthotopic transplantation of novel vitrification cryopreserved ovaries in chemotherapy-induced ovary damage rat model Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi 2013,
27 (9), pp.1116-1121
6 Ting A.Y et al Morphological and
functional preservation of pre-antral follicles after vitrification of macaque ovarian tissue in
a closed system Hum Reprod 2013, 28 (5), pp.1267-1279