Bài giảng Phản ứng huyết thanh - TS. Nguyễn Thị Hoàng Lan

Bài giảng Phản ứng huyết thanh với ứng dụng miễn dịch trong chẩn đoán vi sinh và bệnh nhiễm sẽ giúp các bạn trình bày tính chất của phản ứng KN – KT, nguyên tắc và các phương pháp thực hiện, nhận định kết qua. Mời các bạn cùng tham khảo!

PHẢN ỨNG HUYẾT THANH ỨNG DỤNG MIỄN DỊCH TRONG CHẨN

ĐOÁN VI SINH VÀ BỆNH NHIỄM

TS Nguyễn Thị Hoàng Lan

Bộ môn Vi sinh Khoa Dược – Đại học Lạc Hồng

MỤC TIÊU

• Trình bày tính chất của phản ứng KN – KT

• Nguyên tắc và các phương pháp thực hiện

• Nhận định kết quả

NGUỒN GỐC TẾ BÀO MÁU

ĐÁP ỨNG MIỂN DỊCH

CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH HỌC

• Nhận biết kháng nguyên hoăc̣ kháng thể

• Lương giá kháng nguyên hoặc kháng thể

IgG 70% - IgM 10% - IgA 20% - IgE 0.001% - IgD 1%

PHẢN ỨNG HUYẾT THANH

• Là phản ứng kháng nguyên – kháng thể

• Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

- Tìm kháng thể trong huyết thanh

- Nhận định vi sinh vật

- Đo sự gia tăng kháng thể trong máu để nhậnđịnh tình trạng nhiễm bệnh

CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN

• Quan sát trực tiếp bằng mắt thường

- Đồng vị phóng xạ - RIA

- Huỳnh quang - IFA

PHÁT HIỆN KHÁNG NGUYÊN

• Dùng kháng thể (KT)đã được biết trước để pháthiện kháng nguyên (KN) của vi sinh vật

• Không cần nuôi cấy phân lập vi khuẩn

• Giúp định danh vi sinh vật

PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ VÀ XÁC ĐỊNH

HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ

• Dùng kháng nguyên mẫu đã biết cho kết hợp

với kháng thể nếu có trong mẫu huyết thanh củabệnh nhân

• Đánh giá đáp ứng của cơ thể đối với kháng

nguyên của vi sinh vật ( vaccine)

KHÁNG NGUYÊN HÒA TAN

Kháng nguyên thu được từ môi trường nuôi cấyvirus đã loại bỏ virus và các thành phần tế bào

- Enzyme của virus

- Thành phần cấu tạo của virus

- Kháng nguyên bề mặt bong ra

KHÁNG NGUYÊN HỮU HÌNH

• Kháng nguyên hữu hình là kháng nguyên có kích thước lớn như hồng cầu, tế bào vi khuẩn, có các epitop bề mặt có thể liên kết với các kháng thể tạo thành từng mạng liên kết nhìn thấy bằng mắt thường.

• TD: KN lõi hoặc KN vỏ virus (KN H : yếu tố gây ngưng

kết hồng cầu và KN N là men phá hủy điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào ký chủ → CÚM)

CÁC LOẠI KHÁNG NGUYÊN

• Kháng nguyên hòa tan = kết tủa

Không kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp

• Kháng nguyên hữu hình = ngưng kết

Ngưng kết với kháng thể

Kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp

CÁC LOẠI KHÁNG THỂ

• Kháng thể đa dòng

o Hỗn hợp tế bào B

o Xác định nhiều epitope trên 1 KN

o Có thể phản ứng chéo với KN khác

• Kháng thể đơn dòng

o Từ một clone tế bào B (tương bào)

o Đặc hiệu cho từng epitope trên KN

o Ít nhạy cảm hơn KT đa dòng

PHẢN ỨNG KẾT TỦA

• Phản ứng huyết thanh trong đó hàng ngàn phân

tử KN-KT liên kết với nhau ở những vị trí xácđịnh và tạo thành dạng mạng lưới có thể quansát bằng mắt thường

• Phản ứng này có thể thực hiện ở trong môitrường lỏng hoặc gel

PHẢN ỨNG KẾT TỦA TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG

• Trộn DD kháng nguyên với DD

kháng thể ở dạng hòa tan theo

tỷ lệ nhất định trong ống nghiệm.

• Phản ứng KN-KT sẽ cho kết tủa

nhiều nhất ở vùng cân bằng →

là những hạt lơ lửng hoặc lắng

xuống đáy ống.

• Quan sát phản ứng ở một dãy

ống nghiệm với nồng độ KN-KT

từ thấp đến cao.

PHẢN ỨNG KẾT TỦA TRÊN THẠCH

Kháng nguyên hòa tan

Precipitation reactions in gels

Khuếch tán vòng Mancini

o KT hòa đều trong thạch

o Cho KN vào sẽ khuếch tán

o Kết tủa dạng vòng

o Vòng kết tủa lớn : KN nhiều

o Định lượng

Kết tủa trên thạch Ouchterlony

o Định tính, KN và KT khuếch

tán ngược chiều.

o Cần nhiều huyết thanh

o Khó đọc kết quả và cần

nhiều giờ (24-48h)

PHẢN ỨNG KẾT TỦA Đường cong kết tủa

Đường kết tủa xuất hiện khi tỷ lệ KN-KT tối ưu

PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT

Agglutination

• Kháng nguyên hữu hình

• Kháng thể phản ứng với kháng nguyên trên bềmặt của các phân tử và dẫn tới sự tụ tập →

ngưng kết hạt

• Phản ứng thực hiện trên lam kính hay trong ốngnghiệm

• Ứng dụng trong nhận định nhóm máu và chẩnđoán bệnh truyền nhiễm ( KT Widal dùng

kháng huyết thanh chẩn đoán bệnh thương

hàn)

PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT

ĐIỀU KIỆN HÌNH THÀNH MẠNG NGƯNG KẾT

• KN và KT đặc hiệu

• KN và KT đa giá (có nhiều vị trí kết hợp)

• KN và KT có nồng độ tương đương nhau

NGƯNG KẾT TRỰC TIẾP

KHÁNG NGUYÊN HỮU HÌNH

Thành phần kháng nguyên của chính tế bào vi khuẩn kết hợp với kháng thể đặc hiệu → tạo mạng kết tụ với kháng thể

Ưu điểm

o Kỹ thuật đơn giản rẻ tiền

Nhược điểm

o Có thể phụ thuộc isotype

o IgM ngưng kết hiệu quả hơn IgG

Ứng dụng

o Các XN sàng lọc nhanh

o Xác định nhóm máu

-NGƯNG KẾT GIÁN TIẾP

KHÁNG NGUYÊN DẠNG HÒA TAN

• KN dạng hòa tan được gắn lên nền ( hồng cầuhoặc là hạt latex)

• Độ nhạy và độ đặc hiệu cao

• Dùng rộng rãi trong chẩn đoán vi sinh

NGƯNG KẾT GIÁN TIẾP

HẠT LATEX ĐƯỢC PHỦ KN IgG KẾT HỢP KT IgM

TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN

THỬ NGHIỆM TRÊN LAME

6/21/2016 Dr.T.V.Rao MD 27

NGƯNG KẾT TRỰC TIẾP: Định tính

PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT (SERODIA hoặc SFD HIV1/2)

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

ĐỊNH TÍNH

• Chỉ cho kết quả có hay không có kháng thể hoặckháng nguyên trong mẫu thử

• Ứng dụng trong chẩn đoán các trường hợp mà

KN và KT ở người bình thường không có ( vikhuẩn gây bệnh giang mai)

• Trong các trường hợp KN và KT có thể tìm thấy

ở người bình thường thì phải định lượng KNhoặc KT phát hiện ( bệnh thấp khớpp do liêncầu nhóm A)

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT

<2 32 128 32 4

MẪU HUYẾT THANH THỬ NGHIỆM

Huyết thanh đơn

• Dương tính hoặc âm tính

• Hiệu giá được dùng để đánh giá nồng độ KT cao

hoặc thấp trong huyết thanh.

o Pha loãng mẫu

o KT phản ứng chéo bị pha loãng

Huyết thanh kép (Định lượng )

• Lấy 2 lần, cách nhau ≥ 1 tuần

• Kết quả

o Hiệu giá tăng > 2 lần = mới nhiễm

o Hiệu giá giảm/không tăng = nhiễm từ lâu

• Mục đích phân biệt nhiễm trùng mới mắc/ do vaccine

PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

Neutralization Test

• Là phản ứng huyết thanh trong đó có sự trung hòa giữa kháng nguyên và kháng thể

• Phản ứng dùng để nhận định độc tố và kháng độc tố, virus và kháng thể kháng virus.

PHẢN ỨNG TRUNG HÒA VIRUS

NGUYÊN TẮC

– Kháng thể trong huyết thanh trung hòa với kháng nguyên bề mặt của virus (neutralizing antibodies) – Ức chế virus không thể gây nhiễm tế bào

ỨNG DỤNG

– Plaque phản ứng trung hòa với dengue virus,

Japanese encephalitis virus

– Phản ứng trung hòa với Kháng thể của độc tố vi khuẩn ( diphtheria toxin, clostridium toxin)

PHẢN ỨNG TRUNG HÒA TRÊN SÚC VẬT

• Tiêm một lương nhỏ ngoại độc tố (kháng nguyên vi khuẩn bạch hầu) vào 2 con

chuột lang thử nghiệm.

• Tiếp tục tiêm kháng độc tố vi khuẩn bạch hầu vào một con thì nó vẫn sống và một con không tiêm thì chết.

→ Thú thử nghiệm chết vì vi khuẩn bạch hầu

PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

Trung hòa độc tố

Trung hòa virus:ngăn ngưng kết hồng cầu

DƯƠNG TÍNH

ÂM TÍNH

PHẢN ỨNG TRUNG HÒA

Không ngưng kết hoặc tiêu huyết = phản ứng dương tính Có ngưng kết hoặc tiêu huyết = phản ứng âm tính

HUYẾT THANH MIỄN DỊCH

• Dùng một loại kháng thể có nguồn gốc từ ngườihay động vật giúp cơ thể có ngay kháng thể đặchiệu chống lại tác nhân gây bệnh

• Dạng miễn dịch thụ động không bền vững chỉtồn tại trong cơ thể vài ngày

• Các loại huyết thanh này được tiêm bắp.Một số

ít huyết thanh của người được tinh chế tiêm vàotĩnh mạch

HUYẾT THANH MIỄN DỊCH

• Sử dụng trong trường hợp điều trị và phòngbệnh cho nhưng bệnh nhân đã nhiễm VSV hoặcđộc tố cấp tính

• Đưa kháng thể vào để trung hòa tác nhân gâybệnh → huyết thanh có hiệu lực với những bệnh

mà cơ chế bảo vệ chủ yếu nhờ miễn dịch dịchthể

• TD : huyết thanh chống uốn ván SAT huyếtthanh chống bạch hầu SAD, huyết thanh khángdại…

PHẢN ỨNG GÂY LY GIẢI TẾ BÀO

• Còn gọi là phản ứng kết hợp bổ thể

• Kháng thể đặc hiệu với sự tham gia của bổ thể

→ ly giải tế bào vi khuẩn

TEST KHÁNG NGUYÊN– KHÁNG THỂ

MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG IFA

• Phản ứng thực hiện trên lam kính do sự kết hợpkháng nguyên – kháng thể và một chất màuhuỳnh quang

• Soi dưới kính hiển vi huỳnh quang hoặc ánhsang tử ngoại, phản ứng sẽ có sự phát quang

• Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

có thể nhanh chóng phát hiện vi sinh vật trongbệnh phẩm

MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG IFA

• Kháng nguyên cần xác định (vi khuẩn hoặc virus)được trải lên phiến kính, để khô rồi cố định

• Nhỏ KT có gắn huỳnh quang lên tiêu bản Rửatiêu bản để loại KT thừa

• Soi kính hiển vi huỳnh quang để phát hiện phứchợp KN-KT-HQ

• Hình thể vi sinh vật sẽ sáng lên trên nền tối dochúng được bao bọc bởi các KT gắn huỳnhquang

labeled-immunoglobulin để phát hiện

kháng nguyên hoặc kháng thể

– Cần có kính hiển vi huỳnh quang

microscope – Fluorometers –

Flow cytometers

ỨNG DỤNG : phát hiện và định

danh mầm bệnh cũng như định

lượng và xếp loại tế bào

– Herpes virus IgM

– Dengue virus

– Rabies virus

MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG Immuno Fluorescence Assay

Kháng nguyên cần xác định ( dịch vi khuẩn hoặc virus) được đàn lên phiến kính, để khô rồi cố định.

Phủ KT có gắn huỳnh quang lên tiêu bản Rửa tiêu bản để loại KT thừa Phức hợp KN – KT gắn đặc hiệu sẽ phát sang khi quan sát.

Antigens on Cells or on Tissue Sections

UV Light

Fluorescence

Double layerSandwich

UV Light

Antigens

Direct and indirect Immunofluorescence

THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ

Radio Immuno Assay RIA

Ưu điểm

– Độ nhạy cao

– Có thể phát hiện với lượng rất nhỏ dung để đo

nồng độ các kháng nguyên có trọng lượng phân tử nhỏ (hapten)

– Có thể định lượng (ng hoặc pg)

Hạn chế

– Giá thành đắt

THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ

Radio Immuno Assay RIA

• Nguyên tắc dựa trên sự gắn các kháng nguyên

những kháng nguyên cần định lương trênnhững vị trí của kháng thể

• Trộn một lượng xác định kháng nguyên đánhdấu với một lượng kháng thể xác định và mộtlượng kháng nguyên chưa biết (mẫu thử)

• Phức hợp KN-KT được tạo thành sẽ được tách

ra và đo tác động phóng xạ

P.U MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ

(ĐÁNH DẤU)

Dựa trên sự cạnh tranh giữa KN không được đánh dấu (Ag) và KN đã được đánh dấu (Ag*) với một lượng giới hạn kháng thể nhất định (Ab)

• 4 Ag* + 4 Ab 4 Ag* Ab

• 4 Ag* + 4 Ag + 4 Ab 2 Ag* Ab + 2 Ag Ab + 2Ag* +2Ag

• 4Ag* + 12 Ag + 4 Ab Ag* Ab + 3 Ag Ab +3Ag* + 9 Ag

Phức hợp được đánh dấu sẽ được đo và cho kết quả

P.U MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ

• Có sự cạnh tranh KT: nếu KN trong mẫu cần địnhlượng cao thì KN*- KT thấp

• Hoạt tính phóng xạ của phức hợp (KN*- KT) tỷ lệnghịch với nồng độ KN cần định lượng Xây dựngđồ thị chuẩn ta sẽ xác định được nồng độ chất

cần định lượng.

Kỹ thuật đo miễn dịch phóng xạ

(IRMA)

dùng ở một lượng dư thừa

• KT* có thể phản ứng với tất cả KN, và hoạt tínhphóng xạ đo được ở dạng kết hợp sẽ tỷ lệ thuậnvới nồng độ của KN, hay chất cần định lượng

Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

(sandwich)

• Ủ KN tự do có trong mẫu thử với kháng thể

• Rửa loại bỏ các thành phần không tham gia vàophản ứng KN-KT đặc hiệu

• Cho thêm KT thứ hai có đánh dấu phóng xạ(kháng thể phát hiện) và ủ tiếp

• Rửa lần hai để loại bỏ các KT đánh dấu khôngtham gia phản ứng (dạng tự do)

• Đo hoạt tính phóng xạ Lượng KT đánh dấucàng nhiều thì lượng KN có trong mẫu thử cànglớn, và ngược lại (tỷ lệ thuận)

Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

Để đảm bảo độ chính xác mẫu thử, mẫu bệnhphẩm cũng như các mẫu chuẩn, đều phải được

xử lý và xét nghiệm hoàn toàn như nhau vàtrong cùng các điều kiện

• thời gian ủ

• khối lượng

• nhiệt độ, pH

• thời gian và tốc độ quay ly tâm.

Nhược điểm : sử dụng hoá chất phóng xạ nênphòng xét nghiệm cần phải được thiết kế thíchhợp để bảo đảm các quy định về an toàn phóngxạ

Gamma Counter – Sử dụng để đo mẫu được đánh dấu

KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN

ELISA

• Kháng thể hoặc kháng nguyên được gắn trêngiá cứng (giếng) đem ủ với huyết thanh thànhphức hợp KN-KT

• Phức hợp sẽ được ủ tiếp với kháng thể khángglobulin đã được gắn enzyme Cơ chất củaenzym cho vào đem ủ và phản ứng sẽ chuyển

cơ chất thành hợp chất có màu

THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH GẮN MEN ELISA

R Ử A 5 X

cơ chất

30 phút/ 37 °C 30phút/ T o phòng

Ngưng phản ứng Đọc kết quả

450nm

E

Cộng hợp

+

THỬ NGHIỆM ELISA SANDWICH

Phản ứng màu tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể

R Ử A 5 X

Cơ chất

Bước 2 : 30 phút/ T o phòng 30phút/ T o phòng

Ngưng phản ứng Đọc kết quả

450nm

Cộng hợp

+

Y E E

?

THỬ NGHIỆM ELISA PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI

KHÁNG NGUYÊN & KHÁNG THỂ

Phát hiện nhiễm HIV trong giai đọan cửa sổ

THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH SẮC KÝ

• Số lượng bản sao được tổng hợp theo cấp số nhân 2 n.

QUY TRÌNH PHẢN ỨNG

ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU

ĐỘ NHẠY

• Khả năng của một xét nghiệm cho kết quả dươngtính đối với một mẫu bệnh phẩm thực sự dươngtính

• Độ nhạy càng cao thì kết quả âm tính giả càngthấp

ĐỘ ĐẶC HIỆU

• Khả năng của một xét nghiệm cho kết quả âmtính đối với một mẫu bệnh phẩm thực sự âm tính

• Độ đặc hiệu càng cao thì kết quả dương tính giảcàng thấp

LỰA CHỌN THỬ NGHIỆM

• Điều kiện phòng thí nghiệm : thiết bị, nhân sự

• Độ nhạy các thử nghiệm khác nhau

RIA > EIA và IFA > ngưng kết > kết tủa

• Phản ứng không đặc hiệu cần chọn thử nghiệmít nhạy hơn

• Chi phí