Nội dung của bài viết trình bày về quy trình giải trìn tự DNA để khảo sát tình trạng đột biến gen FLT3 trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy. Kết quả nghiên cứu cho thấy, quy trình khảo sát đột biến gen FLT3 đã được xây dựng thành công tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn cho bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy.
Trang 1KHÔNG CÓ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ
Phan Thị Xinh*,**, Hoàng Anh Vũ*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Xây dựng quy trình giải trình tự DNA để khảo sát tình trạng đột biến gen FLT3 trong bệnh
bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT).
Đối tượng và phương pháp: Mẫu tủy xương của 18 bệnh nhân BCCDT không kèm bất thường nhiễm sắc
thể được khảo sát đột biến gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20 tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ
05/2012 đến 05/2013.
Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khuếch đại vùng gen chứa các exon 14 đến exon 20 bằng một
cặp mồi duy nhất, cho phép phát hiện hầu hết các kiểu đột biến của gen FLT3. Khảo sát trên 18 bệnh nhân, chúng tôi phát hiện 9 trường hợp (50%) có đột biến, bao gồm 6 trường hợp chèn đoạn của exon 14 và 3 trường hợp đột
biến điểm của exon 16 và 20.
Kết luận: Quy trình khảo sát đột biến gen FLT3 đã được xây dựng thành công tại Bệnh viện Truyền máu
Huyết học TP.HCM, giúp việc phân nhóm tiên lượng tốt hơn cho bệnh nhân BCCDT.
Từ khóa: Gen FLT3, đột biến, bạch cầu cấp dòng tủy, nhiễm sắc thể đồ.
ABSTRACT
FLT3 GENE MUTATIONS IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA WITH A NORMAL KARYOTYPE
Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 232 ‐ 236
Background: The aim of this study is to establish a DNA sequencing procedure for detection of FLT3 gene
mutations in patients with acute myeloid leukemia (AML).
Methods: Bone marrow samples of 18 AML patients with a normal karyotype were used for detection of
FLT3 mutations from exons 14 to exon 20 at Blood Transfusion and Hematology Hospital from May 2012 to May 2013.
Result: We successfully amplified FLT3 exons 14 to 20 using a single primer pair, which facilitate detection
of almost all the known mutations in this gene. We found 9 mutations from 18 patients (50%), including 6 with internal tandem duplications within exon 14 and 3 with point mutations within exons 16 and 20.
Conclusion: DNA sequencing for detection of FLT3 mutations was established at our hospital. This may
help to improve the prognostic classification for AML patients.
Key words: FLT3 gene, mutation, acute myeloid leukemia, karyotype.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là
bệnh lý ác tính về máu, đặc trưng bởi sự tăng
sinh quá mức và không biệt hóa của các tế bào
tạo máu, gây tích tụ tế bào non trong máu và
trong tủy xương. Về lâm sàng cũng như sinh học, BCCDT biểu hiện nhiều thể khác nhau gây khó khăn cho việc tiên lượng và điều trị. Nếu chỉ dựa vào các bất thường ở mức nhiễm sắc thể, BCCDT thường được phân thành nhóm tiên lượng tốt, tiên lượng trung bình hay
* Đại học Y Dược TP.HCM ** Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM.
Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932728115 Email:
Trang 2tiên lượng xấu(1,3). Theo cách phân chia này,
những bệnh nhân không có bất thường về
nhiễm sắc thể được cho là có tiên lượng trung
bình. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây lại
cho thấy rằng ngay trong nhóm bệnh nhân
không có bất thường NST thì tiên lượng cũng
khác nhau, tùy theo bệnh nhân có kèm theo
các đột biến gen hay không.
Gen FLT3 nằm trên nhiễm sắc thể 13, mã hóa
cho thụ thể tyrosine kinase thuộc nhóm III. Đây
là một trong những gen thường bị đột biến nhất
trong các bệnh lý ác tính về máu(7). Đột biến
thường gặp nhất của gen FLT3 là sự nhân đoạn
nội tại (ITD: internal tandem duplication) thuộc
exon 14 hay exon 15 của vùng cận màng(1). Các
đột biến điểm tại codon 676 của exon 16 hay
quanh vùng codon 835 của exon 20 cũng đã
được báo cáo trong BCCDT(5). Các đột biến gen
này là những đột biến tăng chức năng, góp phần
quan trọng vào cơ chế bệnh sinh của BCCDT
bằng cách làm cho thụ thể FLT3 được hoạt hóa
liên tục, không còn phụ thuộc vào các phân tử
truyền tín hiệu ngoại bào nữa. Bệnh nhân
BCCDT với nhiễm sắc thể bình thường nhưng
có mang đột biến gen FLT3 thì được xếp vào
nhóm tiên lượng xấu. Mặt khác, việc ức chế
hoạt tính của các protein FLT3 đột biến hứa hẹn
là một mô thức điều trị nhắm trúng đích phân tử
hiệu quả trong tương lai(10). Chính vì thế, khảo
sát tình trạng đột biến gen FLT3 trở nên quan
trọng trong cả tiên lượng và điều trị cho bệnh
nhân(8).
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm
xây dựng quy trình xác định đột biến gen FLT3
và mô tả những kết quả ban đầu trên nhóm
BCCDT tại Bệnh viện Truyền Máu – Huyết Học
Thành phố Hồ Chí Minh.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Khảo sát đột biến gen FLT3 được tiến hành
trên 18 mẫu tủy xương của bệnh nhân bị
BCCDT. Tất cả các bệnh nhân này không có bất
thường của bộ nhiễm sắc thể khi phân tích nhiễm sắc thể đồ.
Phương pháp
RT–PCR
Mẫu tủy trong chống đông EDTA được xử
lý loại hồng cầu và RNA được tách chiết bằng RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo nồng độ bằng máy quang phổ kế spectrophotometer. DNA
bổ sung (complement DNA hay cDNA) được tổng hợp từ 1 μg RNA với bộ hóa chất SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Mỹ). Chất lượng cDNA được kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn cDNA của gen beta‐actin dài 1180 bp. Để khuếch đại
đoạn gen FLT3 từ exon 14 đến exon 20, chúng
tôi thiết kế mồi xuôi FLT3‐F1 (5’‐ GACAACATCTCATTCTATGCAAC ‐3’) nằm trên exon 13 và mồi ngược FLT3‐R1 (5’‐ TTAGCATCAACCGGAATGCC ‐3’) nằm trên exon 22 bằng phần mềm Oligo 4.1, dựa trên
trình tự chuẩn của gen FLT3 mang accession
number NM_004119 trong GenBank. Polymerase dùng cho PCR là Takara Taq HS (Takara, Nhật Bản). Chương trình luân nhiệt thực hiện trên máy GeneAmp PCR System
2720 (Applied Biosystems, Mỹ) trong 45 chu
kỳ với nhiệt độ bắt cặp là 60oC. Sản phẩm PCR dài 1073 bp được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide, tinh sạch bằng QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, Mỹ).
Giải trình tự chuỗi DNA
Thực hiện phản ứng cycle sequencing các sản phẩm PCR đã được tinh sạch, theo hai chiều xuôi và ngược với BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ). Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di
khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc
Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape.
Trang 3Để có thể khảo sát được các đột biến của gen
FLT3, trước tiên chúng tôi chọn khuếch đại vùng
mã hóa protein có chứa các exon từ 14 đến 20.
Hình 1 cho thấy sản phẩm PCR tương ứng với
kích thước mong đợi là 1073 bp. Sản phẩm PCR
khi được giải trình tự đã cho kết quả phù hợp
với gen FLT3 mang mã số NM_004119 trong
GenBank. Việc khuếch đại thành công vùng gen
này cho phép nhận diện hầu hết các kiểu đột
biến điểm, mất đoạn hay chèn đoạn có thể xảy
ra trên gen FLT3.
Hình 1: Khuếch đại vùng gen FLT3 chứa exon 14 – 20.
Kết quả giải trình tự DNA trên 18 bệnh được trình bày trong Bảng 1. Có 9 bệnh nhân mang
đột biến gen FLT3, gồm 6 đột biến nhân đoạn
nội tại của exon 14 và 3 đột biến điểm trên exon
16 và 20 (Hình 2).
Hình 2: Hình ảnh các kiểu đột biến
Bảng 1: Tình trạng đột biến gen FLT3 trong các mẫu nghiên cứu
Trang 4STT Mã số nghiên cứu Giới tính Tuổi Exon bị đột biến Kiểu đột biến
BÀN LUẬN
Các đột biến gen FLT3 vừa có ý nghĩa tiên
lượng, vừa là đích nhắm phân tử hứa hẹn
trong nghiên cứu điều trị BCCDT(3,9). Nghiên
cứu này đã thành công trong việc xác lập quy
trình hoàn chỉnh để có thể xác định tình trạng
có hay không có đột biến gen FLT3 cho bệnh
nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền Máu –
Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả
ban đầu theo dõi bệnh nhân cho thấy tình
trạng có đột biến gen FLT3 phù hợp với tiên
lượng xấu. Bệnh nhân có mã số AML‐08, với
kiểu đột biến p.E611_F612ins13 của exon 14,
không đạt được lui bệnh sau đợt điều trị tấn
công và đã tử vong. Trong tương lai, việc phát
hiện đột biến FLT3 bằng kỹ thuật giải trình tự
sẽ giúp chọn giải pháp ghép tủy cho những
trường hợp tiên lượng xấu đã đạt được lui
bệnh sau giai đoạn điều trị tấn công. Việc xác
định được tình trạng đột biến của gen FLT3
cũng cho phép chúng ta có thể chọn bệnh nhân
phù hợp tham gia các nghiên cứu thử nghiệm
lâm sàng quốc tế với các thuốc mới nhắm đến
FLT3 trong BCCDT.
Kỹ thuật giải trình tự DNA trong nghiên cứu
này cho phép khảo sát không chỉ riêng rẽ các
exon 14, 15 và 20 mà toàn bộ vùng mã hóa
protein từ exon 14 đến 20, tránh bỏ sót một số
đột biến mới. Bước đầu khảo sát trên 18 bệnh
nhân, chúng tôi phát hiện đột biến gen FLT3
trong 50% số trường hợp, so với 44% trong
nghiên cứu của Schlenk và cộng sự thực hiện
trên 438 bệnh nhân(6). Hơn nữa, chúng tôi phát
hiện một trường hợp bệnh nhân có mang đột
biến điểm của exon 16 (p.N676K), là đột biến
gần đây được báo cáo trong nghiên cứu của
Opatz và cộng sự khi sử dụng hệ thống giải
trình tự thế hệ mới để tìm đột biến trên toàn bộ các exon trong bộ gen(4). Kết quả cho thấy quy trình kỹ thuật của chúng tôi trong nghiên cứu này đáng tin cậy, có thể ứng dụng để khảo sát thêm với số mẫu lớn hơn nhằm xác định được
tần suất và phổ đột biến của gen FLT3 trên bệnh
nhân Việt nam. Ngoài ra, cũng cần lưu ý rằng,
ngoài đột biến gen FLT3 thì bệnh nhân BCCDT
với bộ nhiễm sắc thể bình thường còn có thể mang các đột biến gen khác cũng ảnh hưởng
đến tiên lượng bệnh, như gen NPM1 và CEPBA (2,6). Trong thời gian tới, chúng tôi sẽ tiếp tục triển khai nghiên cứu đột biến các gen này
để có đầy đủ cơ sở phân nhóm tiên lượng chính xác hơn cho bệnh nhân BCCDT.
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã thành công trong việc xây dựng quy trình giải trình tự chuỗi DNA để xác
định đột biến gen FLT3, giúp tiên lượng bệnh
nhân BCCDT. Việc ứng dụng kỹ thuật này vào lâm sàng có thể cải thiện hiệu quả điều trị trong thời gian tới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Breitenbuecher F, Schnittger S, Grundler R, Markova B, Carius
B, Brecht A, Duyster J, Haferlach T, Huber C, Fischer T (2009). Identification of a novel type of ITD mutations located in nonjuxtamembrane domains of the FLT3 tyrosine kinase receptor. Blood 23;113(17):4074‐7.
2 Fasan A, Haferlach C, Alpermann T (2013). The role of different genetic subtypes of CEBPA mutated AML. Leukemia doi: 10.1038/leu.2013.273.
3 Mrozek K, Heerema NA, Bloomfield CD (2004). Cytogenetics in acute leukemia. Blood Rev;18(2):115‐36.
4 Opatz S, Polzer H, Herold T, Konstandin NP (2013). Exome sequencing identifies recurring FLT3 N676K mutations in core‐ binding factor leukemia. Blood;122(10):1761‐9.
5 Renneville A, Roumier C, Biggio V, Nibourel O, Boissel N, Fenaux P, Preudhomme C (2008). Cooperating gene mutations
in acute myeloid leukemia: a review of the literature. Leukemia; 22(5): 915‐31.
Trang 56 Schlenk RF, Döhner K, Krauter J, Fröhling S (2008). Mutations
and treatment outcome in cytogenetically normal acute myeloid
leukemia. N Engl J Med; 358(18):1909‐18.
7 Stirewalt DL, Radich JP (2003). The role of FLT3 in
haematopoietic malignancies. Nat Rev Cancer;3(9):650‐65.
8 Su L, Gao SJ, Li W, Tan YH, Cui JW, Hu RP (2013). NPM1,
FLT3‐ITD, CEBPA, and c‐kit mutations in 312 Chinese patients
with de novo acute myeloid leukemia. Hematology 2013 Oct 25
[Epub ahead of print].
9 Swords R, Freeman C, Giles F (2012). Targeting the FMS‐like
Leukemia;26(10):2176‐85.
10 Testa U, Pelosi E (2013). The Impact of FLT3 Mutations on the Development of Acute Myeloid Leukemias. Leuk Res Treatment 2013:275760.
Ngày nhận bài báo: 01/11/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014