Nội dung bài viết trình bày nội dung về xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (tạp chất A) của diclofenac dùng trong kiểm nghiệm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Trang 1TỔNG HỢP 1-(2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2H-INDOL-2-ON (TẠP CHẤT A) CỦA DICLOFENAC NATRI
ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU
Nguyễn Thị Thanh Trà * , Hà Di u Ly ** , Nguyễn Hữu Lạc Thủy * , Trần Thành Đạo *
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Sự có mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất nhỏ trong nguyên liệu hay các chế phẩm thuốc đều
ảnh hưởng đến hiệu quả và mức độ an toàn của dược phẩm Do vậy, x{c định giới hạn tạp chất liên quan là một yêu cầu không thể thiếu trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm của các thuốc
Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (Tạp chất A) của Diclofenac dùng trong kiểm nghiệm
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tạp A của diclofenac được tổng hợp từ natri diclofenac bằng phản
ứng oxi hóa đóng vòng trong môi trường acid, xúc tác ánh sáng và sự hỗ trợ vi sóng Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột (Si-60) v| x{c định cấu trúc sản phẩm bằng phương ph{p phổ nghiệm UV, IR, MS và 1 H-NMR
và 13 C-NMR
Kết quả: Tổng hợp được tạp A diclofenac độ tinh khiết cao h|m lượng 98,21% so với tạp chuẩn A (USP) Kết luận: Quy trình điều chế tạp A diclorofenac đơn giản có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm
với hiệu suất khoảng 53% Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt yêu cầu chất lượng đối với nguyên liệu đối chiếu
Từ khóa: Tạp A diclofenac, tổng hợp, tạp đối chiếu
ABSTRACT
SYNTHESIS OF 1- (2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2H-INDOL-2-ONE (IMPURITY A)
OF DICLOFENAC SODIUM AS REFERENCE MATERIAL
Nguyen Thi Thanh Tra, Ha Dieu Ly, Nguyen Huu Lac Thuy, Tran Thanh Dao
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 521 - 527
Background: The presence of very small amounts of impurities in the active ingredients or in the dosage
forms may affect the effectiveness and safety to the patients Therefore, determining the level of related impurities
is an indispensable requirement in the specifications of substances and products
Objectives: Setting up a prosedure for synthesis of 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one used
as reference impurity for testing quality of diclofenac medicines
Methods: A impurity of diclofenac was synthesized from sodium diclofenac by oxidation in acide medium
under accelerated by microwave and sunlight The product was purified by column chromatography (Si-60) and the structure of final product was determined by UV, IR, MS and 1 H-NMR and 13 C-NMR spectroscopy
Results:A impurity of diclofenac was obtained with a high purity of 98.21% compared to standard A
impurity (USP)
Conclusions: A simple procedure for synthesis of diclofenac A impurity was developted successfully in
Trang 2Keywords: Diclofenac A impurity, synthesis, reference impurity
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, c{c nh| m{y dược phẩm trong
nước đều sản xuất thuốc với nguồn nguyên liệu
chủ yếu là nhập khẩu Do đó, kiểm nghiệm chất
lượng nguyên liệu l| điều hết sức cấp thiết, đặc
biệt là tạp chất liên quan Yêu cầu nghiêm ngặt
về tạp chất đã được các tổ chức quốc tế đưa ra v|
là một trong những chủ đề chính trong các hội
nghị quốc tế để thống nhất các nguyên tắt như
Q3A (R), Q3B (R) và Q3C của ICH
Sựcó mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất
nhỏ cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu lực và mức
độan toàn của dược phẩm Các tạp chất chuẩn
dùng trong kiểm nghiệm nguyên liệu hiện vẫn
chưa được tổng hợp và sản xuất nhiều tại Việt
Nam, nếu phải mua thì rất đắt và phụ thuộc
nhiều từ bên ngoài và mất thời gian đặt mua, do
đó, đ}y l| vấn đề được nhiều xí nghiệp dược
Việt Nam quan tâm
Diclofenac, thuộc nhóm kháng viêm, giảm
đau không steroid l| một trong những nhóm
thuốc được sử dụng nhiều nhất Theo BP 2014,
diclofenac có 5 tạp chất li n quan, trong đó tạp A
là vừa là sản phẩm trung gian vừa là sản phẩm
phân hủy trong quá trình sản xuất(2) Vì vậy,
trong dược điển USP, BP và EP hiện hành, qui
định phảikiểm soát tạp Atrong nguyên liệu và
thành phẩm
Với mong muốn tạo ra chất chuẩn tạp phục
vụ cho công tác kiểm nghiệm để giảm chi phí
sản xuất cũng như gi{ th|nh sản phẩm, trong bài
báo này chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp
1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on
(Tạp chất A của diclofenac natri) hướng đến thiết lập chất tạp đối chiếu
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dẫn chất
1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on còn gọi là tạp A của diclofenac
Hóa chất
Nguyên liệu diclofenac natri, Số lô: DA006; hạn dùng: 2/2017; nơi sản xuất: Ấn Độ Tạp A diclofenac natri chuẩn USP, Số lô: USP/LOM 175, h|m lượng 99%, nguyên trạng Methanol (HPLC), ethyl acetat (PA)của JT Baker, acid phosphoric 85%, acid hydrocloric 37%, acid sulfuric 98%, natri dihydro phosphat PA, bản mỏng silica gel F254 (Merck), silica gel cỡ hạt
60-200mm dùng cho sắc ký cột
Thiết bị
Lò vi sóng Hitoshi G-475AW, máy hồng ngoại Thermo-Science, máy sắc ký lỏng Shimadzu LC-20A với detector PDA, máy DSC-Q20, m{y đo khối phổ tứ cực LC-MS/MS Agilent
1200 nguồn ESI, cột Inersil C18 (250 mm x 4,6
mm, 5 m), m{y đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz (Viện Hóa học, viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam)
Phương pháp nghiên cứu
Tạp diclofenac được tổng hợp theo sơ đồ
1
Sơ đồ 1: Phản ứng tổng hợp tạp A của diclofenac
Trang 3Giai đoạn 1
Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành
diclofenac để hạn chế tối đa tạp hình thành trong
phẩn ứng tổng hợp tiếp theo(2,3)
Cân khoảng 12 g diclofenac natri, thêm
khoảng 500 ml dung dịch HCl 10% vào bình
Bucher 1L, khuấy mạnh liên tục Kết tủa dạng
acid của diclofenac xuất hiện Lọc lấy tủa Kết
tinh diclofenac trong 300 ml methanol, sấy sản
phẩm ở 60oC trong 12 giờ Sản phẩm thu được
đem đo phổ IR v| DSC để định tính v| x{c định
độ tinh khiết (điểm chảy diclofenac là 178,8oC)(5)
Giai đoạn 2: Tổng hợp tạp A từ diclofenac
Dựa theo các tài liệu đã nghi n cứu,
diclofenac trong môi trường acid, dưới t{c động
của vi sóng sẽ xảy ra phản ứng đóng vòng hình
thành tạp A(2,3,4) Cố định tỷ lệ (g/ml) chất nền
diclofenac và thể tích acid sulfuric là 1: 10 Tiến
hành khảo sát các công suất lò từ 50W, 150W,
250W, với nồng độ acid sulfuric lần lượt là 20%,
30%, 40% và 50% và thời gian phản ứng ở các
khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút để chọn ra
điều kiện tổng hợp thích hợp nhất
Tinh chế: Sản phẩm tổng hợp được tinh chế
qua sắc kí cột tr n pha tĩnh hấp phụ (silica gel
Si-60), dung môi rửa giải ethyl acetat 100%
X{c định cấu trúc: X{c định bằng c{c phương
pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, IR cũng
như so s{nh c{c số liệu phổ có được với tài liệu
tham khảo(3)
Xác định độ tinh khiết: Độ tinh khiết của sản
phẩm tổng hợp được x{c định bằng HPLCvới
điều kiện sắc ký tu}n theo điều kiện kiểm
nghiệm tạp A trong nguyên liệu diclofenac natri
của USP 35(6)
Dung dịch đệm phosphat pH 2.5: Trộn đều 2
thể tích tương đương acid phosphoric 0.01 M v|
natri hydrophosphat 0.01 M
Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm
Dung môi: Methanol:Nước (70:30) Cột: d|i 0.25 m, đường kính 4.6 mm Pha tĩnh: octylsilyl silica gel (5 µm)
Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm phosphat pH 2.5 (700:300)
Tốc độ dòng:1 ml/phút
ước sóng phát hiện: 254 nm
Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
Sử dụng chế độ Max plot giúp phát hiện các pic tạp chất trên toàn thang sóng 190 – 800 nm
Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic để x{c định độ tinh khiết pic
KẾT QUẢ
Gi i đoạn 1: Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành diclofenac dạng acid
Thu được 9,8 g kết tinh trắng, bông xốp Phổ
IR cho c{c dao động đặc trưng tương ứng với diclofenac, điểm chảy 178,8oC phù hợp với điểm chảy diclofenac Tiến hành đo DSC để x{c định
độ tinh khiết của sản phẩm là 99,5 %
Gi i đoạn 2: Tổng hợp tạp A của diclofenac
Khảo sát yếu tố công suất lò vi sóng
Cân khoảng 1,0 g diclofenac thu được vào 3 bình nón 100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4 20%, tiến hành phản ứng lần lượt với 3 công suất 50W, 150W, 250W trong 2 phút Mỗi phản ứng thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC, sử dụng tạp chuẩn A của diclofenac làm chất đối chiếu x{c định hiệu suất phản ứng dựa vào % diện tích pic của tạp A trên sắc ký đồ Lấy khoảng 1 ml dung dịch phản ứng chiết bằng
5 ml x 2 lần cloroform, l|m bay hơi dịch cloroform cắn hòa tan trong pha động theo điều kiện HPLC (Hình 1)
Tạp được hình thành nhiều nhất ở công suất 150W, trong khi ở công suất 250W sau 10 giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn toàn Chọn công suất 150W là công suất để thực hiện
Trang 4Hình 1: Kết quả khảo sát công suất phản ứng
Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch H 2 SO 4
Cân khoảng 1,0 g diclofenac vào 4 bình nón
100 ml, thêm vào mỗi bình lần lượt 10 ml dung
dịch H2SO4 ở các nồng độ khác nhau (20%, 30%,
40% và 50%) Tiến hành phản ứng ở công suất
150W trong 2 phút Mỗi phản ứng thực hiện 3
lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC
để x{c định hiệu suất phản ứng
Tạp được hình thành nhiều nhất với dung dịch H2SO4 40%, trong khi dung dịch H2SO4 50%, sau 20 giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn toàn Chọn dung dịch H2SO4 40% để thực hiện phản ứng tổng hợp
Hình 2: Kết quả khảo sát nồng độ acid sulfuric phản ứng
Trang 5Khảo sát yếu tố thời gian phản ứng
Hình 3: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng
Cân khoảng 1 g diclofenac vào 5 bình nón
100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4 40%
tiến hành phản ứng ở công suất 150W lần lượt
trong các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút
Mỗi phản ứng thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu
phản ứng tiến h|nh HPLC để x{c định hiệu
suất phản ứng
Tạp diclofenac được tạo thành nhiều nhất
với thời gian 8 phút Ở thời gian sau 10 phút các
tạp khác bắt đầu xuất hiện nhiều
Qui trình tổng hợp tạp A diclofenac
Cân khoảng 6g diclofenac vào bình nón
200ml, thêm vào 60 ml dung dịch H2SO4 40%, đặt
vào lò vi sóng ở công suất 150W trong 8 phút,
hỗn hợp phản ứng tạo th|nh thu được khối dẻo
màu vàng (5,4 g) Hiệu suất khoảng 90%
Tinh chế
methanol (8:2), phát hiện vết bằng đèn UV 254
nm, đối chiếu với vết của chuẩn tạp A diclofenac của USP, thu được ph}n đoạn có chứa tạp A (3,2 g) ký hiệu DFA Hiệu suất của toàn bộ quá trình
tổng hợp và tinh chế là 53,3%
Xác định cấu trúc
Tính chất
Tinh thể màu trắng, điểm chảy: 251 oC(6). Phổ IR cho c{c dao động ở 1731cm-1 (nhóm C= O của vòng lactam), 1612 cm-1 (C-N), và 782,
749 cm-1 (C-Cl), ứng với phổ IR của tạp A của diclofenac USP Phổ ESI-MS của sản phẩm tổng hợp có m/z = 299,9958 [M+Na]+; M phù hợp với công thức phân tử của tạp A: C14H9Cl2NO (M = 278,1338) Phổ 1H-NMR của DFA cho các tín hiệu cộng hưởng của vòng 2,6 diclorophenyl: [H = 7,51ppm (d; 2H; J = 8,0 Hz), H-3’; H-5’+, *H = 7,34 ppm (t; 1H; J = 6,5 Hz và J = 7,0 Hz), H-4’+; Vòng
Trang 67,5 Hz và J = 7,5 Hz), H-7], [H = 6,40 ppm (d; 1H;
J = 7,5 Hz), H-6] và 2 proton methylen -CH2 ở C-3
có H = 3,78
Phổ 13C-NMR của DFA cho các tín hiệu cộng
hưởng:173,6 (C-2); 35,73 (C-3); 124,3 (C-4); 143,3
(C-5); 109,2 (C-6); 129,03 (C-7); 123,05 (C-8); 124,8
(C-9); 135,5 (C-1’); 130,5 (C-2’, C-6’); 130,8 (C-3’,
C-5’); 127,9 (C-4’).Từ các kết quả phổ MS, IR, và
NMR, khẳng định DF điều chế được là tạp A
(1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on) của diclofenac natri
Xác định độ tinh khiết của tạp A
Tính phù hợp của h thống
Pha dung dịch tạp A có nồng độ 500 µg/ml Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần kết quả RSD của các thông số sắc ký đều nhỏ hơn 2%,
As trong khoảng 0,8 – 1,5; Rs ≥ 1,5 Như vậy qui trình x{c định độ tinh khiết tạp đạt tính phù hợp hệ thống
Hàm lượng của tạp A
Theo điều kiện triển khai HPLC, h|m lượng của tạp A tổng hợp được l| 98,21% được nối từ chuẩn USP số lô LOM 175, hàm lượng 99%, nguyên trạng
Hình 4: Sắc ký đồ của DFA
BÀN LUẬN
Tạp A của diclofenac natri là sản phẩm
đóng vòng của diclofenac dưới tác dụng của
nhiệt độ trong môi trường acid, dưới tác dụng
của siêu âm hoặc vi sóng tạp A sẽ xuât hiện
nhiều hơn Qui trình tổng hợp đã được tìm
điều kiện tối ưu để có hiệu suất tối đa, đồng
thời phương pháp tách và tinh chế chất tổng
hợp khác với tài liệu, nhanh gọn hơn Các tác
nhân cho phản ứng đóng vòng là các chất dễ
tìm, rẻ tiền, máy móc đơn giản Tạp A là chất
kém tan trong nước và tan tốt trong các dung
môi hữu cơ như cloroform, ethyl acetat,
methanol và trong môi trường nước Nhưng kết tinh thu được vẫn không sạch nên phải tinh chế bằng săc ký cột cổ điển Pha động để rửa giải tạp A trong sắc lý cột cổ điển sau khi lựa chọn các dung môi khác nhau là ethyl acetat 100%, đây là 1 dung môi khá an toàn Đối với tạp E, thử nghiệm 2 phản ứng tổng hợp dựa theo nguồn gốc phát sinh và tài liệu về tổng hợp, cả 2 phản ứng hiệu suất đều rất thấp Hơn nữa, tạp E trên thị trường khá rẻ nên lựa chọn cách mua tạp E về để tinh chế Tạp E tan trong cloroform, methanol, ethyl acetat, tan chậm trong nước thử tinh chế tạp E bằng các
Trang 7nên đã lựa chọn phương pháp tinh chế bằng sắc
ký cột cổ điển Pha động để rửa giải tạp A trong
sắc lý cột cổ điển sau khi lựa chọn các dung môi
khác nhau là cloroform: methanol (99:1)
KẾT LUẬN
Từ nguyên liệu đầu natri diclofenac, qua 2
bước đã tổng hợp được
1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on còn gọi là tạp A
diclofenac Sản phẩm cuối được chứng minh cấu
trúc bằng phương ph{p phổ IR, MS, 1H-NMR,
13C-NMR H|m lượng của tạp đạt 98,21% khi
so sánh với chất chuẩn tạp A USP của diclofenac
bằng HPLC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 British Pharmacopoeia 2014, Diclofenac sodium Electronic
Edition
2 Görög S, (2000), “Identification and Determination of Impurities in Drugs” Elsevier Science, e ook IS N: 9780080534404 Pages
772
3 Palomo ME, allesteros MP, Frutos P (1999), “ nalysis of
diclofenac sodium and derivatives”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21, 83 – 94
4 Somashekar PL, Sanjay Pai PN, Rao G (2013), “Synthesis and Characterization of Specified Impurities of ceclofenac”,
Chem Sci Trans, 2(3),813-820
5 Tudja P, Khan MI, Mestrovic E, Horvat M, Golja P (2001),
“Thermal ehaviour of Diclofenac Sodium: Decomposition
and Melting Characteristics”, Chem Pharm Bull, 49(10) 1245—
1250
6 United States Pharmacopoeia 37 (2014) Electronic Edition, Diclorofenac sodium
Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018