Bài viết nhằm nghiên cứu cơ chế phân tử của sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên vi khuẩn streptococcus nhóm B phân lập tại Hàn Quốc. Nghiên cứu được tiến hành trên 1075 mẫu vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm của các bệnh nhân tại các bệnh viện ở Hàn Quốc.
Trang 1NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
NHÓM FLUOROQUINOLONE TRÊN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS
NHÓM B PHÂN LẬP TẠI HÀN QUỐC
Đặng Nguyễn Đoan Trang*, Usha Srinivasany**, Zachary Britt**, Carl F Marrs**, Lixin Zhang**,
Moran Ki***, Betsy Foxman **
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus, GBS) là nguyên nhân chính của nhiễm trùng ở
trẻ sơ sinh và cũng là nguyên nhân thường gặp ở nhiễm trùng người lớn có những tổn thương về miễn dịch.Sự
đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên GBS đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới
Đối tương và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trên 1075 mẫu vi khuẩn phân lập từ
bệnh phẩm của các bệnh nhân tại các bệnh viện ở Hàn Quốc Đột biến trên các gene mã hóa các enzyme gyrase và topoisomerase được xác định bằng kỹ thuật PCR và giải mã trình tự chuỗi DNA đặc hiệu Hoạt động của bơm đẩy được xác định thông qua sự thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu của norfloxacin và ethidium bromide trên GBS với sự có mặt của reserpine (20 µg/mL)
Kết quả: Sự đề kháng ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin có liên quan đến đột biến trên các gene mã
hóa các enzyme gyrase và topoisomerase Bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy được phát hiện trên 52,2 % các
vi khuẩn đề kháng với norfloxacin nhưng không có đột biến
Từ khóa: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, đột biến, bơm đẩy, MIC
ABSTRACT
MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE TO FLUOROQUINOLONES AMONG CLINICAL
STRAINS OF GROUP B STREPTOCOCCUSFROM SOUTH KOREA
Dang Nguyen Doan Trang, Usha Srinivasan, Zachary Britt, Carl F Marrs, Lixin Zhang, Moran Ki,
Betsy Foxman * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No 4 - 2013: 78 - 82
Introduction: Group B Streptococcus (GBS) is a major cause of neonatal sepsis and an emerging cause of
infection in immune-compromised adult populations GBS resistance to fluoroquinolones has been reported in many countries worldwide
Materials and methods: The study collection included 1075 clinical strains of GBS isolated from South
Korea Mutations in genes encoding gyrase and topoisomerase were identified by PCR with specific primers followed by sequencing Evidence of efflux-mediated resistance to norfloxacin was identified by changes in MIC of norfloxacin and ethidium bromide in the presence of reserpine (20 µg/mL), an efflux pump inhibitor
Results: Mutations were detected in strains resistant to ciprofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin
Evidence of the efflux phenotype was found in 52,2% of GBS strains resistant only to norfloxacin with no known mutations
Keywords: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, mutations, efflux, MIC
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ** Khoa Dịch tễ, Đại học Michigan, Hoa Kỳ
*** 3 Khoa Y học Dự phòng, Trường Đại học Y khoa Eulji, Daejeon, Hàn Quốc
Tác giả liên lạc: DS Đặng Nguyễn Đoan Trang ĐT: 0909907976 Email: dtrangpharm@yahoo.com
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus,
Streptococcus agalactiae, GBS) là nguyên nhân
chính của nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh và cũng là
nguyên nhân thường gặp ở nhiễm trùng người
lớn có những tổn thương về miễn dịch(3) Sự đề
kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên
GBS đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới
(4,9,11,12) Trong một nghiên cứu tại Mỹ (12), tỷ lệ đề
kháng levofloxacin trên GBS là 4,4% Theo
nghiên cứu của Savoia D và cộng sự tại Ý, tỷ lệ
đề kháng norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin,
pefloxacin và levofloxacin trên GBS lần lượt là
6,8%, 2,7%, 6,8%, 10,9% và 1,3% (11)
Trong nhiều nghiên cứu đã được báo cáo,
sự đề kháng các fluoroquinolone trên một số
vi khuẩn gram dương bao gồm GBS liên quan
đến đột biến trên các gene mã hóa các enzyme
gyrase và topoisomerase làm giảm khả năng
gắn kết và giảm hoạt tính của các
fluoroquinolone trên vi khuẩn gram dương
còn được giải thích bởi cơ chế bơm đẩy trên
Staphylococcus aureus(5), Streptococcus pneumonia
(8), Streptococcus pyogenes (8) và Streptococcus suis
(8) nhưng chưa có báo cáo trên GBS
Trên một nghiên cứu trên 1075 mẫu GBS
được phân lập từ các bệnh phẩm tại các bệnh
viện ở Hàn Quốc, tỷ lệ đề kháng các
fluoroquinolones khá cao, đặc biệt đối với
norfloxacin (tỷ lệ đề kháng với norfloxacin,
ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin lần
lượt là 93%, 8,9%, 8,1% và 0,8%) (7) Tỷ lệ đề
kháng này đặt ra vấn đề cần xác định cơ chế đề
kháng ở mức độ phân tử của các vi khuẩn phân
lập được nhằm góp phần vào việc lựa chọn
kháng sinh hiệu quả trong trị liệu cũng như
nghiên cứu các công thức thuốc mới có hiệu quả
cao trên GBS
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chọn mẫu nghiên cứu
Việc xác định các đột biến trên các gene mã hóa gyrase và topoisomerase được tiến hành trên 95 mẫu GBS được lựa chọn ngẫu nhiên từ
1075 mẫu GBS phân lập từ nước tiểu, âm đạo, trực tràng, vết thương của các bệnh nhân nhập viện từ các bệnh viện ở Hàn Quốc từ năm 2006 đến 2008 Sau khi xác định các đột biến, 146 mẫu GBS được tiếp tục thử nghiệm để xác định hoạt động của bơm đẩy bao gồm 88 mẫu chỉ đề kháng với norfloxacin (20 trong số này đã qua xác định đột biến) và 58 mẫu đề kháng với các fluoroquinolone khác đã qua xác định đột biến
Phân lập GBS
GBS được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm bằng cách nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Thử nghiệm catalase và phản ứng ngưng kết latex (Streptex; Murex Biotech Ltd., Dartford, Anh) được sử dụng để phát hiện và xác định GBS
Xác định tính nhạy cảm của GBS đối với các kháng sinh nhóm fluoroquinolone
Tính nhạy cảm của GBS đối với các kháng sinh nhóm fluoroquinolone(norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin) được xác định bằng máy kháng sinh đồ tự động VITEK II (thực hiện tại Seoul Clinical Laboratories và Seoul Medical Science Institute) dựa trên các tiêu chuẩn EUCAST
Susceptibility Testing) 2009 và 2011 Trên 1075 mẫu GBS nghiên cứu, tỷ lệ đề kháng với norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin phát hiện lần lượt là 93%, 8,9%, 8,1% và 0,8%
Xác định đột biến trên vùng QRDR (Quinolone Resistance Determining Region)
Các bước xác định đột biến trên vùng QRDR
của các gene gyr và par (mã hoá các enzyme
gyrase và topoisomerase):
Trang 3- Vùng QRDR được khuếch đại bằng kỹ
thuật PCR với các đoạn mồi đặc hiệu của gyrA,
gyrB, parC và parE (12) Phản ứng PCR được tiến
hành trong điều kiện như sau: biến tính chuỗi
DNA ở 94oC trong 3 phút, 30 chu kỳ nhiệt bao
gồm giai đoạn bắt cặp ở nhiệt độ 45oC trong 30
giây và giai đoạn kéo dài ở 68oC trong 1 phút,
giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 68oC trong 6 phút
Sản phẩm PCR được tiếp tục phân tích bằng kỹ
thuật điện di trên gel agarose 1% trong đệm
Tris-acetic acid/EDTA (pH 7.5) với chất nhuộm gel an
toàn GelRed và soi bằng nguồn sáng đèn UV
- Sản phẩm PCR được giải mã trình tự DNA
(sequencing) tại Trung tâm Giải mã DNA, Đại
học Michigan, Hoa Kỳ và phân tích bằng phần
mềm Lasegene DNA STAR Các chủng vi khuẩn
GBS ATCC 12403 and A909 được sử dụng làm
đối chứng âm trong phân tích
Xác định hoạt động của bơm đẩy (efllux
pump) đối với norfloxacin
Hoạt động của bơm đẩy đối với norfloxacin
được xác định dựa trên sự thay đổi MIC của
norfloxacin (giảm ít nhất 4 lần) và ethidium
bromide (giảm ít nhất 2 lần) với sự có mặt của
reserpine (20 µg/mL), một chất ức chế bơm đẩy
lần thử nghiệm lặp lại Norfloxacin dùng trong
thử nghiệm được cung cấp bởi Sigma Aldrich,
Co., Missouri, Hoa Kỳ; reserpine được cung cấp
bởi MP Biomedicals, LLC, Ohio, Hoa Kỳ và
ethidium bromide được cung cấp bởi Fisher
Scientific, New Jersey, Hoa Kỳ
Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus
1199B được cấy bơm đẩy norA được sử dụng
làm đối chứng dương; các chủng GBS ATCC
12403 và A909 được sử dụng làm đối chứng
âm trong thử nghiệm này
Xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý thống kê
bằng phần mềm SAS (SAS Version 9.2 for
Windows; SAS Institute Inc., Cary, NC)
KẾT QUẢ Đột biến trên các gene mã hoá gyrase và topoisomerase
Việc xác định đột biến được tiến hành trên
các tiểu đơn vị gyrA, gyrB của gyrase và parC, parE của topoisomerase Chỉ có những đột biến
làm thay đổi ít nhất một acid amin mới được đưa vào phân tích Không có trường hợp đột biến nào được phát hiện trên các chủng vi khuẩn nhạy cảm với tất cả bốn fluoroquinolone và những chủng vi khuẩn chỉ đề kháng với
norfloxacin Đột biến trên gyrA và parC được
phát hiện trên các chủng đề kháng với ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin theo những tỷ lệ khác nhau (Bảng 1) Chỉ có ba trường hợp đề kháng với ciprofloxacin có đột
biến trên gyrB và không có trường hợp đột biến trên parE nào được phát hiện Đột biến đồng thời trên cả parC và gyrA được phát hiện trên 90%
chủng vi khuẩn đề kháng với levofloxacin và 100% chủng vi khuẩn đề kháng với moxifloxacin Tất cả những trường hợp này đều
đề kháng chéo với norfloxacin và ciprofloxacin (Bảng 1)
Bảng 1: Tỷ lệ đột biến trên các gene gyrA và parC
trên 95 mẫu Streptococcus nhóm B (GBS) đề kháng với các fluoroquinolone phân lập từ Hàn Quốc (2006 – 2008)
Tỷ lệ đột biến
Đề kháng
NF
Đề kháng
NF và CF
Đề kháng
LF
Đề kháng
MF
Đột biến trên
parC hay gyrA
Đột biến trên cả
parC hay gyrA
Không có đột biến
NF: norfloxacin, CF: ciprofloxacin, LF: levofloxacin, MF: moxifloxacin
Mối liên quan giữa đột biến trên các gene gyrA và parC và MIC
Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa
sự hiện diện của đột biến trên cả hai gene par và gyr và MIC trong những trường hợp đề kháng
Trang 4với ciprofloxacin (p=0,001), levofloxacin (p=0,001)
và moxifloxacin (p=0,001) Không có mối liên
quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến trên duy
nhất 1 gene (par hay gyr) và MIC
Bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy đối
với norfloxacin
Trên các mẫu GBS chỉ đề kháng với
norfloxacin và không có đột biến, MIC trung
bình của norfloxacin khi có reserpine giảm
khoảng 4 lần so với khi không có reserpine cho
thấy có sự hoạt động của bơm đẩy (Bảng 2) Trên
các mẫu GBS chỉ có đột biến trên duy nhất một
gene (parC hay gyrA), hoạt động của bơm đẩy
yếu hơn (MIC trung bình chỉ giảm 1,6 lần khi có
mặt reserpine) Trên các mẫu GBS có đột biến
trên cả 2 gene gyrA và parC, hoàn toàn không có
sự thay đổi MIC khi có mặt reserpine chứng tỏ
bơm đẩy không tồn tại hay không hoạt động
(Bảng 2)
Bảng 2: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
norfloxacin khi có và không có reserpine trên 146 mẫu
Streptococcus nhóm B (GBS) phân lập từ Hàn Quốc
(2006-2008)
lượng
Giá trị MIC trung bình (µg/mL)
Tỷ lệ có hoạt động của bơm đẩy (%)
- Reserpin
e
+ Reserpin
e Không có đột biến
Nhạy cảm với các
FQ
Đề kháng trung gian
với NF
Đề kháng NF
2
9
88
4 13.3 33.9
4 7.6 12.8
0 33.3 52.2
Đột biến chỉ trên
parC hay gyrA
Đột biến trên cả
parC và gyrA
NF: Norfloxacin, FQ: fluoroquinolone
Khi sử dụng ethidium bromide làm chất
nền, bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy
được phát hiện trên 54,1% các chủng GBS chỉ
đề kháng duy nhất với norfloxacin và không
có đột biến Tuy nhiên, tỷ lệ đồng thuận của
hai phương pháp phát hiện bơm đẩy (sử dụng
norfloxacin và ethidium bromide) chỉ ở mức
trung bình (kappa=0,6, khoảng tin cậy 95%: 0,45 – 0,78)
MIC của norfloxacin trên 2 chủng GBS ATCC 12403 and A909 (đối chứng âm) là 4 µg/mL Không có sự khác biệt về MIC của norfloxacin trên 2 chủng này khi thêm reserpine
BÀN LUẬN
Tỷ lệ đề kháng các kháng sinh nhóm fluoroquinolone, đặc biệt đề kháng norfloxacin, trong nghiên cứu này cao hơn kết quả của những nghiên cứu trước đây (1,6,11) Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đề kháng ciprofloxacin
và levofloxacin liên quan đến đột biến trên ít
nhất một gene gyrA hay parC trong khi sự đề
kháng moxifloxacin đòi hỏi phải có sự hiện diện
đồng thời của hai đột biến trên cả gyrA và parC
Sự khác biệt này có thể được lý giải dựa trên cấu trúc phân tử cồng kềnh của moxifloxacin Kết quả nghiên cứu thu được cũng khá tương đồng với kết quả của các nghiên cứu trước đây về vị trí ưu tiên tác động của các fluoroquinolone trên
vi khuẩn gram dương: các quinolone không thân nước như moxifloxacin sẽ ưu tiên tấn công vào gyrase trong khi các quinolone thân nước như ciprofloxacin và levofloxacin sẽ ưu tiên tấn công vào topoisomerase (7,10)
Tỷ lệ đề kháng norfloxacin của 1075 mẫu GBS nghiên cứu là 93% Tuy nhiên, không có đột biến nào được phát hiện trong các mẫu lựa chọn ngẫu nhiên từ các trường hợp chỉ đề kháng với norfloxacin Kết quả của thử nghiệm tiếp theo cho thấy có bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy trên 52,2% các trường hợp chỉ đề kháng với norfloxacin Như vậy, bơm đẩy có thể là nguyên nhân dẫn đến đề kháng norfloxacin trên GBS Trên GBS, hoạt động của bơm đẩy dẫn đến đề kháng macrolide(2) và tetracycline(1) đã được báo cáo nhưng chưa có nghiên cứu nào về hoạt động của bơm đẩy trên fluoroquinolones Kết quả nghiên cứu này chính là phát hiện đầu tiên về hoạt động của bơm đẩy dẫn đến đề kháng norfloxacin trên GBS Tuy nhiên, đây chỉ là bước khởi đầu Trong tương lai, cần tiến hành thêm
Trang 5nhiều nghiên cứu khác để xác định rõ hơn cơ chế
đề kháng các fluoroquinolone của GBS nhằm
góp phần vào việc lựa chọn kháng sinh hiệu quả
trong điều trị cũng phát triển các hoạt chất và các
phối hợp thuốc mới hiệu quả trên GBS (Ví dụ:
phối hợp chất có tác dụng ức chế hoạt động của
bơm đẩy và fluoroquinolone)
Lời cám ơn: Xin chân thành cám ơn TS Glenn W Kaatz, Đại
học Wayne State, Detroit, Michigan đã cung cấp mẫu đối
chứng cho nghiên cứu; Quỹ Nghiên cứu Korea Research
Foundation, Hàn Quốc và Trung tâm MAC-EPID (The
Center for Molecular and Clinical Epidemiology of Infectious
Diseases), Đại học Michigan, Hoa Kỳ đã tài trợ cho nghiên
cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
tetracycline resistance determinant isolated from deep
Chemother., 52: 4518–4521
(mef) gene variants in Streptococcus agalactiae J Clin
Microbiol , 45: 2754–2755
infections due to group B streptococci Obstet Gynecol ,104:
1062-1076
mechanisms of resistance and clonal relationships of
Streptococcus agalactiae isolates resistant to macrolides,
lincosamides, and ketolides in Spain Antimicrob Agents and
Chemother., 49: 2525–2527
in Staphylococcus aureus due to overexpression of a novel multidrug and toxin extrusion (MATE) transport protein Antimicrob Agents Chemother , 49: 1857–1864
multidrug efflux transporter distinct from NorA in Staphylococcus aureus Antimicrob Agents Chemother , 44: 1404-1406
Streptococcus agalatiae from South Korea Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 31: 3199-205
bacteria: an update Drugs, 69: 1555–1623
streptococci in acute Exacerbation of Chronic Bronchitis Emerging Infect Diseases,14: 349-350
10 Patel D et al.(2010) Ethidium bromide MIC screening for enhanced eflux pump gene expression or efflux activity in Staphylococcus aureus Antimicrob Agents Chemother 2010; 54: 5070-5073
11 Savoia D et al (2008) Streptococcus agalactiae in pregnant women: phenotypic and genotypic characters J Infect., 56: 120-125
12 Wehbeh W et al (2005) Fluoroquinolone-resistant Streptococcus agalactiae: Epidemiology and mechanism of resistance Antimicrob Agents Chemother., 49: 2495-2497
Ngày nhận bài báo: 13.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014