Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài đề cập về: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả. Mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD.
Trang 1PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ
DUCHENNE VÀ BECKER BẰNG KỸ THUẬT MLPA
Nguyễn Khắc Hân Hoan*, Quách Thị Hoàng Oanh*, Phạm Ngọc Khôi**, Nguyễn Thị Phương Mai***,
Ngô Diễm Ngọc***, Trần Vân Khánh****
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD Hơn 65%
trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả
Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD
Phương pháp: 18 mẫu DNA của bệnh nhân nam đã chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD và đã phát
hiện đột biến mất đoạn gen bằng multiplex PCR Được khảo sát 79 exon trên gen DMD bằng kit Salsa MLPA P034A2 và P035A2, điện di mao quản bằng CEQ 8000 và phân tích tự động bằng phần mềm Gene Marker
Kết quả: MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến,khảo sát được hết 79
exon của gen DMD, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao Mọi exon của gen DMD
bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ Bộ 3 multiplex PCR chỉ khảo sát được 25 exon và có những exon không được phát hiện
Kết luận: Kỹ thuật MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và ưu
điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR
Từ khóa: Bệnh loạn dưỡng cơ, Duchenne, Becker, bệnh di truyền, đột biến gen, exon, kỹ thuật PCR, kỹ
thuật MLPA
ABSTRACT
MLPA IN DETECTION OF DELETION MUTATIONS CAUSING DUCHENNE MUSCULAR
DYSTROPHY
Nguyen Khac Han Hoan, Quach Thi Hoang Oanh, Pham Ngoc Khoi, Nguyen Thi Phuong Mai, Ngo Diem Ngoc, Tran Van Khanh* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 14 - Supplement of No 4 - 2010: 53 - 60
Background: DMD and BMD are genetic disorders caused by DMD mutations More than 65% of cases
are deletion or duplication mutation Recently, MLPA is described as an effective method to dectect these mutations
Objective: Evaluate the effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations
Method: 15 DNA samples of male affected with DMD/BMD detected with deletion mutations by multiplex
PCR are tested for 79 exons with Salsa MLPA P034A2 và P035A2 kit, capillary electrophoresed with CEQ 8000 and automated analysis with Gene Marker software
Results: MLPA allows to detect the size of DNA fragment lost, the technique is easy, visual, rapid and
reproducible All 79 deleted exons are present in electropherograms Set of 3 multiplex PCR only detects 25 exons and some exons cannot be found by this set
Conclusion: MLPA helps to rapid detection all deletions of DMD gene and is prominent to multiplex PCR
* Khoa Di truyền y học – Bệnh viện Từ Dũ, ** Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Nông Lâm TPHCM,
*** Khoa Di truyền Tế bào và Phân tử – Bệnh viện Nhi Trung Ương, **** Đại học Y Hà nội
Tác giả liên lạc: BS Quách Thị Hoàng Oanh, ĐT: 084-913833666, Email: oanhqch@yahoo.com
Trang 2Key word: Muscular dystrophy, Duchenne, Becker, genetic disorder, mutation, exon, PCR, MLPA
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và
bệnh loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là bệnh di
truyền thần kinh cơ phổ biến nhất, với xuất độ
khoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống(7) Bệnh do đột
biến gen dystrophin (gen DMD) gây ra Đây là
gen lớn nhất ở người nằm dài 2400kb ở vị trí
Xp21.2, gồm 79 exon mã hóa 14 kb mRNA(1,8,15)
Thông tin chi tiết về gen được phổ biến tại
www.dmd.nl
Bệnh nhân DMD thường bị nhược cơ xuất
hiện sớm từ 2 – 3 tuổi, tiến triển nhanh, mất khả
năng đi lại và chết ở lứa tuổi 20 do vì tổn thương
cơ tim và rối loạn hô hấp Bệnh nhân BMD biểu
hiện bệnh nhẹ hơn, tiến triển chậm và có cuộc
sống kéo dài Tuy nhiên chất lượng cuộc sống
thường kém(7)
Hơn 65% trường hợp bệnh DMD và BMD
là do đột biến mất đoạn gen hoặc lập đoạn gen
dystrophin gây ra(2,10,17) Các loại đột biến khác
gồm có mất vài nucleotid, đột biến điểm và
chuyển đoạn Hầu hết các đột biến mất đoạn
tập trung chủ yếu ở hai vùng nóng (hot spot) ở
đầu 5’ (exon 3-20) và vùng trung tâm (exon
44-55)(3,4,7) Tuy nhiên không có sự tương quan
giữa kích thước của đoạn gen bị mất với mức
độ biểu hiện bệnh
Phát hiện đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa
rất lớn nếu áp dụng vào giai đoạn trước sinh
Trước đây kỹ thuật thường được sử dụng là
Southern blot Tuy nhiên đây là kỹ thuật đòi hỏi
tốn rất nhiều công và thời gian Để thể phát hiện
79 exon phải lai các hỗn hợp probe 7 – 8 lần Về
sau kỹ thuật multiplex PCR được Chamberlain
phát triển thành phương tiện chẩn đoán nhanh
hơn(2) Kỹ thuật realtime PCR gần đây cũng được
phát triển, tuy nhiên còn nhiều hạn chế(11) Tại
Việt Nam, phát hiện các đột biến mất đoạn
thường được dựa vào kỹ thuật đơn PCR(12,13)
hoặc kỹ thuật multiplex PCR(14)
Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex
Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời
với khả năng khuếch đại cùng lúc đến 45 vị trí DNA đích khác nhau trong một phản ứng(18,19) Mỗi probe MLPA gồm 2 đoạn oligonucleotide lai với trình tự DNA đích tại vị trí liền kề với nhau, dài 22-43 nucleotide và một PCR primer xuôi hoặc ngược giống nhau ở tất cả các probe
Để phân biệt sản phẩm khuyếch đại, các probe còn chứa một đoạn DNA gắn chèn không tham gia vào lai có kích thước thay đổi (19–364 nt) Sau khi lai qua đêm với trình tự DNA đích, 2 đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghép (ligation) với nhau Sản phẩm nối có cả primer xuôi và ngược và được khuếch đại bằng PCR Số lượng tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỉ lệ với số bản sao của trình tự đích trong mẫu khảo sát Kích thước khác nhau của các sản phẩm sẽ được nhận biết bằng hệ thống giải trình mao quản tự động và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ được định lượng(18,19)
Kỹ thuật đã được ứng dụng vào chẩn đoán đột biến mất đoạn gây DMD/BMD rất hiệu quả(18) Tuy nhiên đến nay Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về kỹ thuật này Vì thế, chúng tôi thực hiện thử nghiệm xác định đột biến mất đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA và so sánh hiệu quả với kỹ thuật multiplex PCR
Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá hiệu quả phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA và so sánh với kỹ thuật multiplex PCR trên các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne và Becker tại Bệnh viện Từ Dũ
VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm là 3ml máu tĩnh
mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA Đối tượng là 15 bệnh nhân nam được chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD
Ly trích DNA từ mẫu bệnh phẩm: DNA được
ly trích từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi bằng phương pháp kết tủa và ly tâm qua cột lọc với
bộ QiaAmp DNA blood mini kit (Qiagen) DNA sau khi cô lập được hòa tan trong dung dịch
Trang 3Tris-HCl 10mM (pH 9,0) Các mẫu DNA đều
được xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng
máy Biophotometter plus (Eppendorf) ở bước
sóng 260/280nm và lưu trữ ở 4oC trước khi chẩn
đoán và -300C sau khi phân tích
Kỹ thuật multiplex PCR phát hiện đột biến
mất đoạn Kỹ thuật multiplex PCR được thực
hiện tại Bệnh viện Nhi Trung Ương Ba bộ
multiplex PCR A, B và C được sử dụng để phát
hiện mất đoạn của 25 exon đặc hiệu tập trung ở
vùng hot spot của gen với trình tự mồi, điều kiện
phản ứng và kích thước sản phẩm khuếch đại
được thiết kế theo Chamberlain và cộng sự
(bảng 1)(2) Sản phẩm PCR được điện di trên gel
Nussieve agarose 3% trong dung dịch đệm TBE
1x bằng máy điện di Mupid Exu với điện thế
120V trong 30’, nhuộm với dung dịch ethidium
bromide 0,5ug/ml trong 20’ và chụp hình bằng
tia UV với máy Gel Doc XR (BioRad) (hình 1)
Các phản ứng PCR luôn kèm theo đối chứng
dương tính, âm tính (wild type) song song với
mẫu cần chẩn đoán
Bảng 1: Kích thước (bp) của các 25 exon được khuếch
đại trong 3 bộ multiplex PCR (2))
Multiplex A Multiplex B Mutiplex C
Exon Kích th ướ c Exon Kích th ướ c Exon Kích th ướ c
45 547 Pm 535 49 439
48 506 3 410 Pb 332
19 459 43 357 16 290
17 416 50 271 41 270
51 388 13 238 32 253
8 360 6 202 42 195
12 331 47 181 34 171
44 268 60 139
4 196 52 113
Hình 1: Kết quả phát hiện đột biến mất đoạn bằng 3
bộ multiplex A, B và C với thang 100bp Wt và m là chứng wildtype và người nam bị đột biến 29 là mẫu
08029 bị mất các exon: 3,4,6,8,12,13 30 là mẫu
08030 bị mất các exon: 47, 48, 49, 50, 51, 52 31 là mẫu 08031 bị mất các exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17,
19, 32, 34
Kỹ thuật MLPA Chúng tôi sử dụng bộ kit
Salsa MLPA do MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan sản xuất có chứa 80 đoạn dò cho 79 exon đích và exon DP427c (5,6) 80 probe này đưa chia đều vào 2 hỗn hợp probe P034A2 và P035A2 Ngoài ra, mỗi kit còn chứa 5 đoạn dò kiểm chứng (bảng 2)
Kỹ thuật MLPA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất 50 – 200ng DNA của mẫu khảo sát pha loãng trong 5ul TE được biến tính ở 98°C x 5’, làm lạnh trên đá rồi trộn với 3ul hỗn hợp probe và MLPA buffer Hỗn hợp DNA và probe này sau đó được ủ lai ở 95°C x 1’ và 60°C
x 16 giờ hoặc qua đêm Phản ứng nối ghép sau lai được thực hiện với 32ul hỗn hợp Ligase-65 và buffer ở 54°C x 15’ và bất hoạt ở 98°C x 5’
Bảng 2: Kích thước đoạn dò (bp) đặc hiệu các exon của kit Salsa MLPA P034 và P035
Kích th ướ c
ñ ạ n dò
DMD exon Trình t ự 20 nucleotid
quanh v ị trí ligation
Kích th ướ c
ñ ạ n dò
DMD exon Trình t ự 20 nucleotid
quanh v ị trí ligation
482* Exon DP427c CAGTAATAGA-ATGCTTTCAG 218 Exon 43 ATTGCAAAGT-GCAACGCCTG 138* Exon 1 CCCCCTACAG-GACTCAGATC 250 Exon 44 ACAGTTTCTC-AGAAAGACAC 170* Exon 2 CAAAAGAAAA-CATTCACAAA 290 Exon 45 AGATGCCAGT-ATTCTACAGG
210 Exon 3 CTCTTCAGTG-ACCTACAGGA 322 Exon 46 CATTGCTAGT-ATCCCACTTG
242 Exon 4 CCCTGAACAA-TGTCAACAAG 362 Exon 47 TCAAACAATT-AAATGAAACT
282 Exon 5 AGATGGAAAT-CATAAACTGA 394 Exon 48 GTTAAATCAT-CTGCTGCTGT
314 Exon 6 CCAACAGTGA-AAAGATTCTC 434 Exon 49 AAGAGATTTT-GTCTAAAGGG
354 Exon 7 GGAATAGTGT-GGTTTGCCAG 466 Exon 50 TAAACCGTTT-ACTTCAAGAG
Trang 4Kích th ướ c
ñ ạ n dò
DMD exon Trình t ự 20 nucleotid
quanh v ị trí ligation
Kích th ướ c
ñ ạ n dò
DMD exon Trình t ự 20 nucleotid
quanh v ị trí ligation
426 Exon 9 ACAGGGATAT-GAGAGAACTT 178* Exon 52 AGCCTCTTGA-TTGCTGGTCT
458 Exon 10 AGACAAGTCA-TTTGGCAGTT 218 Exon 53 GAGCAGGTCT-TAGGACAGGC
138 Exon 11 TTGACAGCCC-ATCAGGGCCG 250 Exon 54 GCAGACAAAT-GTAGATGTGG
170 Exon 12 AGCCTCTTGG-ACCTGATCTT 290 Exon 55 ACTCATAGAT-TACTGCAACA
210 Exon 13 GGTAGTTGAT-GAATCTAGTG 322 Exon 56 TCCTGTTACA-AAGACGTTTG
242 Exon 14 GGGCAAACAT-CTGTAGATGG 362 Exon 57 GAAAGATGAT-GAATTAAGCC
282 Exon 15 TGGCTTTCAG-AAAAAGAAGA 394 Exon 58 AGACTGTACG-AATATTTCTG
314 Exon 16 GCAATCCATG-GGCAAACTGT 434 Exon 59 GATGAGACCC-TTGAAAGACT
354 Exon 17 AACAGATCCT-GGTAAAGCAT 466 Exon 60 GCCTCTGAAA-GAGAACGTGA
386 Exon 18 AAGCTGTGTT-GCAGAGTCCT 162 Exon 61 GCAGCTGCAT-GAAGCCCAC
426 Exon 19 AAGCTGAGAA-GTTCAGAAAA 194 Exon 62 TCCCTGGGAG-AGAGCCATCT
458 Exon 20 GTGGATCGAA-TTCTGCCAGT 234* Exon 63 AAACAACTTG-CTGGGACCAT
154 Exon 21 AAGGACAAGG-ACCCATGTTC 266* Exon 64 CTGCAGTCTT-CGGAGTTTCA
186 Exon 22 AGGAGACCAT-GAGTGCCATC 306 Exon 65 GCTGCATGTG-ATGCCTTGGA
226 Exon 23 GGCCTATACT-ATCTCAGCAC 338 Exon 66 CTGTCTTTTA-AAACTGGCAT
258 Exon 24 GGCCTGCCCT-TGGGGATTCA 378* Exon 67 ACACTTGGCT-CAATGTTACT
298 Exon 25 CAGAAGATAA-AGAATGAAGC 410 Exon 68 GACTGGATGA-GACTGGAACC
330 Exon 26 GTAAGCCTCC-AGAAAGATCT 450 Exon 69 TTTTTTTCTG-GTCGAGTTGC
370 Exon 27 TGAGTCTGTA-AATAGTGTCA 482 Exon 70 CCCCGAATGG-GCTACCTGCC
402 Exon 28 GGCATGAGTT-ATTGTCATAC 162* Exon 71 TCTGATCAAC-TTCTGGCCAG
442 Exon 29 ACAGACCCTA-ACAGATGGCG 194 Exon 72 CCTCAGCTTT-CACACGATGA
474 Exon 30 AAGTTGCTTG-AACAGAGCAT 234* Exon 73 TATCATTTAG-ATAAGATCCA
154 Exon 31 GGAGGCTGCC-CAAAGAGTCC 266 Exon 74 CCAGATCTTG-ATTTCCTTAG
186 Exon 32 CTGCATTGGA-AACAAAGAGT 306 Exon 75 TGAGCTCATT-GCTGAGGCCA
226 Exon 33 TCTGAAGTGG-AAATGGTGAT 338 Exon 76 ACCTCTCTAC-AGAGGTCCGA
258 Exon 34 GAAAGGAAAT-GAATGTCTTG 378 Exon 77 CCAGGACACA-AGCACAGGGT
298 Exon 35 CCTGAAGAGT-ATCACAGAGG 410* Exon 78 TGGAAAGCCA-ATGAGAGAGG
330 Exon 36 ATCACAAAGT-GGATCATTCA 450 Exon 79 CCACATGGCA-GATGATTTGG 370* Exon 37 TGGCTGCAAA-TCGATGGTTG 64-70-76-82 Chứ ng ñị nh l ượ ng DNA, xu ấ t hi ệ n DNA < 100 ng
402 Exon 38 CTGAAATTCA-GCAGGGGGTG 88-92-96 Ch ứ ng DNA, tín hi ệ u th ấ p khi bi ế n tính không
hoàn toàn
442 Exon 39 TGCAAAGAGG-AGACAACTTA 100 Ch ứ ng ñặ c hi ệ u nhi ễ m s ắ c th ể X
474 Exon 40 AAGGCTCTAG-AAATTTCTCA 105 Ch ứ ng ñặ c hi ệ u nhi ễ m s ắ c th ể Y
146 Exon 41 GGGCTTGTCT-GAGGATGGG 118 Ch ứ ng ñặ c hi ệ u nhi ễ m s ắ c th ể Y, ch ỉ có ở P034
178 Exon 42 CGATGATGGT-GATGACTGAA
* là các probe đặc hiệu trình tự chuỗi DNA ngược hoặc có một phần trình tự intron Chữ đứng là kit P034, chữ in nghiêng là kit P035 Cả 2 kit đều có đoạn dò chứng
10µl sản phẩm nối ghép được trộn kỹ với
30µl PCR buffer và đặt vào máy luân nhiệt ở
60°C Liền ngay sau đó 10ul hỗn hợp phản ứng
có chứa dNTPs, Taq polymerase và primer
TAGA-3’) được thêm vào PCR được thực hiện
ở điều kiện luân nhiệt: (950C x 30” + 600C x 30” +
720C x 60”) x 35 chu kỳ + 720C x 20’ và giữ ở 40C
trên máy Master Cycler ProS (Eppendorf)
Các đoạn dò nếu không được ghép nối với nhau thì chỉ mang một primer cho nên không được khuếch đại
Sản phẩm sau khuếch đại được điện di phân tách đoạn trên hệ thống CEQ 8000 (Beckman Coulter) ở điều kiện: 2ul PCR + 0,5ul Beckman size standard 600 + 32ul sample loading solution; nhiệt độ mao quản 500C, biến tính 900C x 20’’; điện thế bơm mẫu vào 2kV x 30’’ và điện thế phân tách đoạn 4,8kV x 60’ Kích thước của mỗi
Trang 5peak được xác định nhờ so sánh với thang kích
thước và so sánh với mẫu chứng
Sau điện di, kết quả được xuất dưới dạng
file.esd, rồi được phân tích tự động tìm đột biến
bằng phần mềm Gene Marker version 1.85
(SoftGenetics)
Kết quả phân tích được biểu thị dưới dạng
biểu đồ sóng (electropherogram) và dưới dạng
bảng Các vị trí gen bị mất đoạn ở cá thể nam
(1 nhiễm sắc thể X) sẽ không có đỉnh tín hiệu
xuất hiện Hình 3 minh họa kết quả chẩn đoán
mẫu 08029
KẾT QUẢ
Từ ngày 1/3/2009 đến 31/5/2009 chúng tôi đã thực hiện chẩn đoán cho 15 mẫu và tất cả đều được phát hiện là mất đoạn bằng cả hai kỹ thuật
Số exon được phát hiện bị mất trong các mẫu rất
đa dạng Sử dụng kỹ thuật bộ 3 multiplex PCR,
có 2 mẫu không phát hiện được mất đoạn, và mẫu mất nhiều nhất là 25 exon Các band đặc hiệu cho exon khảo sát đều rõ Với kỹ thuật MLPA, số lượng exon bị đột biến mất đoạn cũng rất thay đổi, ít nhất là 1 exon, nhiều nhất toàn bộ
79 exon của gen DMD Kết quả phát hiện đột biến được nêu trong bảng 3
Bảng 3: Số exon được phát hiện bị mất trong 15 mẫu khảo sát
Multiplex PCR
Mã s ố MLPA
Exon phát hi ệ n ñượ c Exon không kh ả o sát
08029 2 – 13 3, 4, 6, 8, 12, 13 2, 5, 7, 9, 10, 11,
08031 3 – 34 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 21, 33
05020 45 – 52 45, 47, 48, 49, 50, 51,52 46
05060 3 – 29 32, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29
07009 31 – 40 32, 34, 41, 42, 43 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40
07047 3 – 17 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15
10013 45-53 45, 47, 48, 49, 50,52 46, 51, 53
10021 1-79 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34,41,42, 43, 44, 45,
47, 48, 49, 50, 51,52, 60
Các exon còn l ạ i
Trang 6Hình 3: Kết quả phân tích trên phần mềm GeneMarker của mẫu 08029 Hình trên là kit P034, hình dưới là kit
P035 Bệnh nhân bị mất đoạn từ exon 2 đến exon 13
BÀN LUẬN
Cả hai phương pháp đều có khả năng phát
hiện chính xác các exon bị mất đoạn của gen
DMD và phù hợp với chẩn đoán trên bệnh cảnh
lâm sàng Trong 15 mẫu khảo sát, có 3 mẫu bị
mất đoạn gen khá lớn, vượt ra ngoài vùng nóng đầu 5’; 1 mẫu mất đoạn không nằm trước vùng nóng trung tâm Kết quả phù hợp với y văn cho rằng gen DMD là gen rất dài và dễ bị đứt gẫy trong quá trình phân chia tế bào(1,11,16)
Trang 7Kỹ thuật multiplex PCR biểu thị các exon bị
mất đoạn bằng sự vắng mặt của band tương ứng
trên gel agarose Người đọc sẽ so band của mẫu
khảo sát với band của chứng wild type để xác
định sự hiện diện của đột biến Tuy nhiên
multiplex PCR là phương pháp định tính
Trường hợp cá thể nữ (46,XX) chỉ mang một gen
DMD bị mất đoạn trong số các exon được khảo
sát thì kỹ thuật này không phát hiện được
Do giới hạn về kỹ thuật multiplex, nên bộ 3
multiplex PCR chỉ khảo sát được 25 exon Số exon
khảo sát không liên tục, vì thế không thể kết luận
được có sự hiện diện hay không của những exon
nằm giữa 2 exon được phát hiện mất 10 trong 15
mẫu khảo sát đều có các exon bị mất ngoài khả
năng phát hiện của multiplex PCR
Multiplex PCR là kỹ thuật hiện nay được sử
dụng rộng rãi Tuy nhiên kỹ thuật này còn có
nhược điểm khó tối ưu cho nhiều cặp primer vì
các primer có điều kiện phản ứng rất khác nhau
Một thay đổi nhỏ về điều kiện cũng làm cho
phản ứng bị thất bại
MLPA cho phép phát hiện bất thường về
liều gen trong một giới hạn khá rộng Kỹ thuật
dựa trên nguyên tắc định lượng so sánh các
probe được khuếch đại bằng PCR với một cặp
primer duy nhất Vì thế MLPA loại bỏ được các
giới hạn trong tối ưu multiplex PCR và kiểm tra
được liều gen ở nhiều vị trí đích khác nhau một
cách dễ dàng hơn
Với bộ kit Salsa MLPA P034A2 và P035A2,
toàn bộ các exon của gen DMD được khảo sát
trong cùng một lần thử nghiệm, trên 2 ống phản
ứng khác nhau với cùng một điều kiện luân
nhiệt Kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan,
nhanh và có độ lập lại cao Mọi exon của gen
DMD bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ
Thời gian thao tác thực hiện kỹ thuật ngắn Tuy
nhiên, kỹ thuật đòi hỏi phải lai đoạn dò ít nhất
16 giờ hoặc qua đêm Kết quả của nghiên cứu
này phù hợp với các nghiên cứu đã nêu trước
đây(10,11,18,19)
MLPA còn cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến Điều này rất hữu ích khi xác định biến đổi của khung dịch mã
để suy đoán liên quan kiểu gen – kiểu hình Các đột biến gây lệch khung dịch mã thường dẫn đến bệnh DMD Nếu khung dịch mã không thay đổi thì bệnh nhân thường có kiểu hình bệnh BMD nhẹ hơn
Tuy nhiên MLPA có thể cho kết quả dương tính giả nếu chỉ có một probe bị thay đổi tín hiệu Điều này có thể xảy ra nếu như tại vị trí lai
và nối ghép của probe, DNA đích bị đột biến điểm hoặc bị một SNP Đây là nhược điểm chính của MLPA Vì thế cần làm PCR để xác định lại nếu kết quả MLPA cho thấy chỉ có 1 probe bị thay đổi tín hiệu
Ngoài ra, kỹ thuật MLPA còn có các đoạn dò đặc hiệu nhiễm sắc thể X và Y Đây là ưu điểm lớn giúp xác định giới tính của mẫu khảo sát hữu ích cho việc tiên lượng kiểu hình của bệnh nhân
và thai sau sinh(19,20) Ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh các trường hợp mất đoạn gen cho thai sẽ dễ dàng hơn và giúp giúp cho việc phòng bệnh chủ động bằng tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh trong tương lai giảm được gánh nặng cho xã hội
KẾT LUẬN
Bệnh loạn dưỡng cơ Duchene và Becker là rối loạn thần kinh cơ đơn gen phổ biến nhất ở nam giới Kỹ thuật MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR Ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh hứa hẹn đạt hiệu quả cao
Cám ơn: Các đồng nghiệp tại Khoa Di truyền y học Bệnh viện
Từ Dũ và Bệnh viện Nhi trung ương đã ủng hộ và giúp đỡ
chúng tôi thực hiện nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Beggs AH, Koenig M, Bobrow M, Bentley DR (1990) Detection of 98% of DMD/BMD gene deletion by polymerase chain reaction Human Genetics, 86: 45–48
2 Chamberlain JS, Gibbs RA, Raniel JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988) Deletion screening of the Duchenne muscular dytrophy locus via multiplex DNA amplification Nucleic Acids Research, 16: 11141–11156
Trang 83 Elhawary NA, Rabah MS, Nemat H (2004) Frameshift
deletion mechanisms in Egyptian Duchenne and Becker
muscular dystrophy families Molecular and Cells, 18: 141–
149
4 Forrest SM, Smith TJ, Cross GS et al (1987) Effective
strantergy for prenatal prediction of Duchenne and Becker
muscular dystrophy Lancet, 2: 1294–1296
5 Gatta V et al (2005) Identification of deletions and
duplications of the DMD gene in affected males and carrier
females by multiple ligation probe amplification (MLPA)
Hum Genet Jun;117(1):92-98
6 Janssen B et al (2005) MLPA analysis for the detection of
deletions, duplications and complex rearrangements in the
dystrophin gene: potential and pitfalls Neurogenetics.;
6(1):29-35
7 Kneppers ALJ, Ginjaar IB, Bakker E (2004) Duchenne and
Becker muscular dystrophy In: Rob Elles & Roger Mountford
(eds) Molecular diagnosis of genetic diseases, 2nd edition,
pp311-342 Humana Press, New Jersey
8 Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco AP, Feener C,
Kunkel LM (1987) Complete cloning of the Duchenne
muscular dystrophiy (DMD) cDNA and preliminary genomic
organization of the DMD gene in normal and affected
individuals Cell 50: 509–517
9 Kunkel, L M et al (1991) Searching for dystrophin gene
deletion in patients with atypical presentations In: Lindsten J,
Pettersson U (eds) Etiology of human disease at the DNA
level, pp 51–60 Ravel, New York
10 Lalic T et al (2005) Deletion & duplication screening in the
DMD gene using MLPA Eur J Hum Genet.13(11):1231-4
11 Lai KK et al (2006) Detecting exon deletions and duplications
of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification (MLPA) Clin Biochem 2006 Jan 11
12 Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thanh Liêm, Vũ Chí Dũng,
Nguyễn Thu Nhạn, Bùi Phương Thảo (2006) Đột biến mất
đoạn gene Dystrophin của các bệnh nhân loạn dưỡng cơ
Duchenne/ Becker Việt Nam Tạp chí Nhi khoa, tập 14 - số đặc
biệt: 202–208
13 Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng (2002) Kết quả bước đầu
phát hiện đột biến gien gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
Tạp chí Nhi khoa, tập 10, số đặc biệt chào mừng 100 năm
trường Đại học Y Hà Nội và hội nghị khoa học toàn quốc
14 Nguyễn Thị Phương Mai, Vũ Chí Dũng, Hoàng Thị Thanh
Mộc và cs (2007) Áp dụng kỹ thuật multiplex PCR thay thế
PCR cổ điển trong phân tích gen dystrophin ở các bệnh nhân
loạn dưỡng cơ Duchenne Hội nghị nhi khoa Việt Úc, Bệnh
viện Nhi Đồng 1 TPHCM, 111-111
15 Prior TW, Bridgeman SJ (2005) Experience and Strategy for
the Molecular testing of Duchenne Muscular Dytrophy
Journal of Molecular Diagnostics, 7:317-326
16 Roberts RG, Bobrow M, Bentley DR (1992) Point mutations in
the dystrophin gene Proceding National Academy of Science
of USA 89: 2331–2335
17 Roberts RG, Coffey AJ, Bobrow M, Bentley DR (1993) Exon
structure of the human dystrophin gene Genomics, 51: 919–
928
18 Schwartz M and Duno M (2005) Multiplex
ligation-dependent probe amplification is superior for detecting
deletions/duplications in Duchenne muscular dystrophy Clin
Genet.; 67(2):189-91
19 Schwartz M and Duno M (2004) Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the multiplex ligation-dependent probe amplification method Genet Test.; 8(4):361-7
20 White SJ et al (2006) Copy number variation in the genome; the human DMD gene as an example Cytogenetic and Genome Research, 115: 240-6 Review