Trong đề tài này nhằm nghiên cứu quy trình chiết tách carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng phương pháp HPLC với hệ thống knauer smarline 2500 system.
Trang 1XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CAROTENOID TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG
Võ Xuân Hoài*, Phan Thanh Dũng*, Trần Cát Đông*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm giàu carotenoid đang lưu hành như: carotenoid
từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), tảo và gần đây là từ vi khuẩn, tuy nhiên trong nước chưa có quy trình định lượng cụ thể cho các chế phẩm này
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu quy trình chiết tách
carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng phương pháp HPLC với hệ thống Knauer Smarline 2500 system
Kết quả và bàn luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy, phá vỡ tế bào bằng tán trong bể siêu âm và chiết
carotenoid với chloroform - methanol (2:1) cho hiệu quả chiết tách carotenoid từ vi khuẩn cao nhất (94,82%) Hàm lượng carotenoid từ vi khuẩn và các chế phẩm được xác định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ nhạy cao, trên cột RP C18 ở nhiệt độ phòng, hệ dung môi pha động là acetonitril- methanol - dichloromethal (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với tốc độ dòng 1ml /phút, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát hiện tại 450 nm Phương pháp HPLC cho tương thích cao với các thông số sắc ký có RSD < 2% Phương pháp được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích hợp với tỷ lệ phục hồi của carotenoid từ chế phẩm đạt 99,83%
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công trình định lượng bằng kỹ thuật HPLC để kiểm tra hàm lượng
carotenoid trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường Qui trình được thẩm định và áp dụng thành công trên một số sinh khối vi khuẩn giàu carotenoid và chế phẩm chứa carotenoid trong nước và ngoại nhập
Từ khóa: HPLC, carotenoid, betacaroten, thực phẩm chức năng,
ABSTRACT
ESTABLISHMENT OF A METHOD FOR CAROTENOIDS QUANTIFICATION
IN SOME COMMERCIAL PRODUCTS USING HPLC METHOD
Vo Xuan Hoai, Phan Thanh Dung, Tran Cat Dong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 2 - 2014: 182 - 187
Introduction: Nowadays, there are many rich carotenoid products on the market Carotenoids in these
products come from plants: carrot, gac fruit (Momordica cochinchinensis), tomato, seaweed and recently from bacteria Although they are popularly used but the suitable quantity method is not yet available for these products
in Vietnam.
Materials and methods: In this work, we studied methods for extraction of carotenoid from bacteria and
developed the carotenoid quantitative method for products containing carotenoid based on HPLC with Knauer Smarline 2500 system
Results and disscussions: The result show that, cells breaking process by using ultrasonic bath and extract
carotenoid with chloroform/methanol (2:1) are the most effective with performance about 94,82% The content of carotenoids from bacteria and other products were determined by HPLC method, that is rapid and high sensitivity with RP C18, at room temperature The mobile phase is acetonitrile – methanol - dichloromethal (70:20:10, v/v/v)
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: DS Phan Thanh Dũng ĐT: 0983957158 Email: dungpharm@yahoo.com
Trang 2supplemented with ammonium acetate 10 mM, with flow 1ml/minute, inject volume 20 μl, UV detector at 450
nm The HPLC method is highly suitable with RSD of chromatography parameters were less than 2% The method was validated for the acceptable accuracy and precision with the recovery rate is 99.83%
Conclusion: We have succesfully established an HPLC protocol for qualification of carotenoid in commercial
products The protocol has been validated and applied to determining the carotenoid contents of several different bacterial biomasses and some domestic and imported products
Keywords: HPLC, carotenoid Betacarotene, functional food
ĐẶT VẤN ĐỀ
Carotenoid là nhóm sắc tố terpenoid phổ
biến trong tự nhiên, nhất là trong các sinh vật
sống được dưới ánh nắng mặt trời bao gồm thực
vật, động vật, vi khuẩn, tảo, nấm…(3) Kể từ khi
được phát hiện cho đến nay, carotenoid được
ứng dụng rộng rãi để làm phụ gia tạo màu cho
thực phẩm, bổ sung những chất dinh dưỡng,
giúp gia tăng giá trị thẩm mỹ cho cho ngành
thủy sản (7) Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dịch
tễ học và kết quả thực nghiệm đã chứng minh
các carotenoid với vai trò là chất chống oxi hóa
đã mang lại lợi ích cho sức khỏe con người bằng
cách ngăn ngừa hay trì hoãn các bệnh mạn tính
như ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh
thể và một số bệnh khác Do đó, carotenoid cũng
đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều
trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm(1)
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế
phẩm giàu carotenoid được lưu hành như:
carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua),
carotenoid từ tảo, carotenoid từ vi khuẩn
(3)…tuy nhiên hàm lượng carotenoid trong các
chế phẩm này thường chỉ ghi chung chung,
không được xác định chính xác và không thể xác
định hoạt tính của các chế phẩm này Do đó vấn
đề đặt ra là phải xây dựng một quy trình chiết
tách và xác định hàm lượng carotenoid trong chế
phẩm cũng như xác định các loại carotenoid có
trong chế phẩm để xác định hoạt tính của chế
phẩm Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Xây dựng qui trình định lượng carotenoid
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
DD1.1, Bacillus indicus HU36, Bacillus infantis
AT14, độ ẩm 5%, mật độ tế bào 1010 CFU/g sinh khối, được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược – Khoa Dược – ĐH Y Dược TP HCM, 41 Đinh Tiên Hoàng Q1
Các chế phẩm chứa carotenoid trên thị trường: Dầu gấc Vinaga (Số lô 4306, hạn sử dụng 6/2013), dầu gấc Gấc Việt Nam (Số lô
4609, hạn sử dụng 6/2013), Super Antioxidant của Holland & Barrett (Số lô 375324, hạn sử dụng 1/2015), Mỹ, Beta-Carotene của Holland
& Barrett (Số lô 375221, hạn sử dụng 1/2015),
Mỹ, Tảo Spiruline của Teva S Switzerland (Số
lô 4609, hạn sử dụng 9/2013)
Khảo sát phương pháp phá vỡ màng tế bào
vi khuẩn
Chúng tôi tiến hành khảo sát các phương pháp phá vỡ màng tế báo vi khuẩn như nghiền trong nitơ lỏng, tán siêu âm đầu dò, dùng bể siêu âm và sử dụng lysozym với lượng sinh khối khảo sát là 200 mg dung môi chiết là cloroform
và methanol với tỷ lệ 1:2 (3,4,5)
Khảo sát dung môi chiết carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn
Bảng 1: Tỉ lệ các dung môi chiết
Thể tích (ml)
Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ dung môi chiết carotenoid với nhiều tỉ lệ khác nhau, dựa trên hai dung môi chính là methanol và cloroform, nhằm tìm ra tỉ lệ dung môi chiết tối
ưu nhất Chiết tách carotenoid theo quy trình đã
Trang 3khảo sát ở trên với tỉ lệ hệ dung môi bổ sung
được thay đổi như Bảng 1
Phương pháp chiết carotenoid từ chế phẩm
Đối với các chế phẩm có chứa carotenoid
(carotenoid được chiết ở dạng bột hoặc dầu)
chiết theo quy trình sau: cân 1/3 lượng dầu
(bột) trong 1 viên chế phẩm vào ống Falcon 50
ml Thêm vào 10 ml NaOH 1 N pha trong
methanol, lắc rung mạnh trong 1 phút Thêm
10 ml aceton, lắc rung cho đều Để ở nhiệt độ
phòng trong 15 phút Thêm 10 ml n-hexan, lắc
rung cho đều Thêm 10 ml nước khử khoáng,
lắc rung cho đều Để ở nhiệt độ phòng trong
10 phút Ly tâm 9600 vòng /10 phút ở 4oC Thu
lớp n-hexan Lớp n-hexan sau đó loại nước
bằng Na2SO4 Dịch chiết với n-hexan được bay
hơi đến cắn Hòa lại cắn vào 1 ml cloroform và
4 ml dung môi pha động(2,1)
Xây dựng quy trình định lượng carotenoid
bằng phương pháp HPLC và thẩm định
quy trình định lượng
Chúng tôi tiến hành thăm dò hệ dung môi
pha động để tách tốt nhất các loại carotenoid có
trong dịch chiết Dựa vào tính chất carotenoid là
chất kém phân cực nên chọn hệ dung môi pha
động kém phân cực Các hệ dung môi pha động
khảo sát gồm có: acetonitril-methanol,
acetonitril-methanol-dicloromethan là các hệ
dung môi thường sử dụng để phân tích
carotenoid với đầu dò UV, bước sóng phát hiện
450 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút trên hệ thống
Knauer Smarline 2500 system Các mẫu chuẩn
được chọn gồm các loại carotenoid thông dụng
thuộc 2 nhóm xanthophyl và carotenoid:
astaxanthin, canthaxanthin, lutein, lycopen và
β-caroten để tiến hành quá trình thăm dò hệ dung
môi để chọn hệ pha động tối ưu(1,3,5)
Sau khi xây dựng quy trình định lượng
chúng tôi tiến hành hẩm định quy trình định
lượng và ứng dụng qui trình đã thẩm định để
định lượng trên một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường(1-Error! Reference source not found.)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát các phương pháp chiết, tách carotenoid
Qua kết quả thực nghiệm nhận thấy, phương pháp phá vỡ màng tế bào trong bể siêu âm và chiết bằng hỗn hợp cloroform - methanol tỉ lệ 2:1 cho hiệu quả cao nhất với tỷ
lệ hồi phục 94,82%
Xây dựng quy trình định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC
Dựa vào tính chất phân cực của carotenoid (nhóm caroten không phân cực và nhóm xanthophyl phân cực) để thăm dò hệ dung môi phân tích bằng phương pháp HPLC Tiến hành thăm dò hệ dung môi pha động gồm acetonitril - methanol, acetonitril – methanol - dicloromethan với các tỉ lệ khác nhau để tách tốt nhất hỗn hợp 5 chất chuẩn gồm: astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin, lycopen và β- caroten Kết quả khảo sát cho thấy hệ dung môi phân tích carotenoid tốt nhất là acetonitril – methanol - dicloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích là 12 phút (Hình 1-G) Dung môi pha động isocratic bổ sung amonium acetat 10 mM với A ACN -MeOH (50:50,tt/tt), B ACN -MeOH (60:40,tt.tt), C ACN -MeOH (70:30,tt/tt), D ACN - MeOH (80:20,tt/tt),
E ACN MeOH (90:10,tt/tt), F ACN –MeOH -DCM (70:25:5, tt/tt/tt), G ACN –MeOH DCM (70:20:10, tt/tt/tt), H ACN –MeOH -DCM
(70:15:15, tt/tt/tt)
Trang 4th C
in Z
in Z
D
F
H
G
E
C
Hình 1: Thăm dò hệ dung môi
Thẩm định quy trình phân tích
Tính phù hợp hệ thống
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6)
Astaxanthin
RSD %
Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc
ký chọn lựa là phù hợp cho việc phân tích định
lượng carotenoid với RSD của thời gian lưu,
diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết của cột sắc ký
đều nằm trong giới hạn RSD ≤ 2% Các thông số
như hệ số đối xứng nằm trong giới hạn từ 0,8≤
As ≤1,5 và độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5 Như vậy phương pháp phân tích carotenoid đạt được tính phù hợp hệ thống
Trang 5Time (min)
Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống
acetonitril:Methanol:dicloromethan (70:20:10,
tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM, cột
RP- C18 (250 mm, 5 µm), phát hiện UV 450
nm, ở nhiệt độ phòng
Bảng 3: Kết quả thẩm định phương pháp định lượng
Carotenoid
Độ đúng (Tỉ lệ hồi
phục, n=9)
Khoảng tuyến tính Ŷ = 363,86 x – 55,953
Ŷ = 240,5 x + 37,616
Qui trình định lượng carotenoid đã thẩm
định
Phá vỡ màng tế bào bằng tán trong bể siêu
âm Chiết carotenoid với hệ dung môi
chloroform - methanol với tỉ lệ 2:1 Tiến hành
phân tích HPLC với hệ thống Knauer theo các
điều kiện: Dung môi pha động: acetonitril –
methanol - dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ
sung amonium acetat 10 mM Cột sắc ký:
Europher RP C18 (250 mm, 4,6 mm, 5 µm) phát hiện UV 450 nm Tốc độ dòng: 1 ml/phút nhiệt
độ phòng, Thể tích bơm mẫu: 20 µl
Ứng dụng quy trình định lượng trên chế phẩm
Bảng 4: Kiểm tra hàm lượng carotenoid của sinh khối
vi khuẩn
Chủng vi khuẩn
RT (phút)
Nhóm carotenoid
Hàm lượng carotenoid trung bình (µg/g)
RSD
Bacillus indicus
Bacillus infantis
Bacillus marisflavi
Bảng 5: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong dầu
gấc
Sản phẩm
Hàm lượng β-caroten Trên nhãn (mg %)
Hàm lượng β-caroten định lượng (mg%)
RSD
Bảng 6: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong các chế phẩm ngoại nhập
carotenoid
Hàm lượng trên nhãn (mg/viên)
Hàm lượng định lượng
% hàm lượng
Tảo Spiruline
Trang 6KẾT LUẬN
Carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn được
chiết tách bằng phương pháp tán siêu âm đầu
dò có hiệu quả tốt nhất trong việc phá vỡ
màng tế bào với hệ dung môi thích hợp là
chloroform-methanol (2:1, tt/tt), hiệu suất chiết
đạt khoảng 95%
Carotenoid được định lượng bằng phương
pháp HPLC sử dụng cột pha đảo C18 với hệ
dung môi phân tích là acetonitril- methanol-
dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung
amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích
là 12 phút Qui trình đã được thẩm định đáp
ứng các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính
đặc hiệu, độ đúng, độ lập lại của một phương
pháp phân tích dựa trên HPLC Áp dụng qui
trình đã thẩm định xác định hàm lượng
carotenoid của một số nguyên liệu vi khuẩn của
phòng thí nghiệm và chế phẩm chứa carotenoid
đang lưu hành: trong đó các sản phẩm
carotenoid trong nước chưa đạt hàm lượng
carotenoid ghi trên nhãn, các chế phẩm ngoại
nhập có hàm lượng carotenoid đạt thông số ghi
trên nhãn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Asean guideline for for validation of analytical procedures
2008 p 1-17
2 Barua AB (2001) Improved normal-phase and reversed-phase gradient high-performance liquid chromatography procedures for the analysis of retinoids and carotenoids in human serum, plant and animal tissues J Chromatogr A, 936(1-2):71-82
3 Bùi Minh Giao Long, Vũ Thanh Thảo and Trần Cát Đông (2010) Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh carotenoid từ biển và các
hô tôm ở Việt Nam Y học TP Hồ Chí Minh, 2010,14 (1):1-5 Duc Le H, Fraser PD, Tam NK, et al (2006) Carotenoids present in halotolerant Bacillus spore formers FEMS Microbiol Lett, 255(2):215-24
4 Johnson EA and Schroeder WA (1996) Microbial carotenoids Adv Biochem Eng Biotechnol, 1996 53:119-78
5 Khaneja R., Perez-Fons L, Fakhry S, et al (2010) Carotenoids found in Bacillus Journal of Applied Microbiology, 2010 108(6):1889-1902.(9)
6 Lowe, G M., R F Bilton, I G Davies, et al (1999) Carotenoid composition and antioxidant potential in subfractions of human low-density lipoprotein Ann Clin Biochem, 1999 36:323-32
7 Trần Hùng (2006) Chuyên đề: Các chất chống oxi hóa trong
tự nhiên Nxb Đại học Y Dược Tp HCM
8 Võ Thị Ngọc Mỹ (2010) Nghiên cứu quy trình thu nhận và định lượng carotenoid từ một số chủng Bacillus sp 2010, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM
Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20.03.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014