Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá cấu trúc siêu vi của tế bào gốc (TBG) trung mô não giữa chuột cống trắng trước và sau nuôi cấy. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
Trang 1CẤU TRÚC SIÊU VI CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ NÃO GIỮA
CHUỘT CỐNG TRẮNG NUÔI CẤY
Nguy ễn Thanh Hoa*; Nguyễn Thị Bình* Nguyễn Phúc Hoàn*; Nguyễn Mạnh Hà*
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá cấu trúc siêu vi của tế bào gốc (TBG) trung mô não giữa chuột cống
trắng trước và sau nuôi cấy Đối tượng và phương pháp: phẫu tích lấy mô sàn não giữa phôi
chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi, tạo thành dịch treo tế bào (TB) và nuôi cấy trong môi
trường DMEM/F12 có bổ sung các yếu tố tăng trưởng, kháng sinh và kháng nấm trong tủ 37 0
C
và 5% CO 2 Sau 6 - 8 ngày nuôi cấy, các TB tăng sinh nhanh phủ kín phiến nuôi cấy Làm tiêu
bản hiển vi điện tử và quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét và xuyên Kết quả: các nơ ron có
cấu trúc siêu vi điển hình với đầy đủ bào quan trong bào tương Các nhánh của nơ ron dài và
tạo liên kết synap với các nơ ron khác Kết luận: nuôi cấy làm tăng sinh và trưởng thành các TB
của mô sàn não giữa
* Từ khóa: Sàn não giữa; Nuôi cấy tăng sinh; Biệt hoá; Cấu trúc siêu vi
Ultrastructure of Rat Embryonic Ventral Mesencephalic Precursor
Cells in Culture
Summary
Objectives: To investigate ultrastructure of rat ventral mesencephalic precursor cells before
and after culture Subjects and methods: Dissected the ventral mesencephalon of rat embryos
on day 12.5 - 13.5, then created cell suspension and expansion cultured in DMEM/F12 medium
supplemented with growth factors, antibiotics, antifungal After 6 - 8 days of culture, precursor
cells proliferated quickly to completely cover culture disk Samples were prepared and observed
under the scanning and transmission electronmicroscope Results: Neurons contained particular
ultrastrutures with many organelles, elongated processes and synaptic contact with another
neurons Conclusion: Ventral midbrain precursor cells cultures were proliferative and differentiated
into neurons after 6 - 8 days
* Keywords: Vetral mesencephalon; Proliferation; Differentiation; Ultrastruture
ĐẶT VẤN ĐỀ
Parkinson là một bệnh thoái hóa thần
kinh phổ biến thứ hai sau bệnh Alzheimer,
đặc trưng bởi sự thoái hóa các TB thần
kinh tiết dopamin trên con đường thể vân -
liềm đen ở não Bệnh Parkinson có nhiều phương pháp điều trị Hiện nay, việc ứng dụng công nghệ TBG vào điều trị là một phương pháp mang lại nhiều triển vọng mới cho bệnh Parkinson Phương pháp này có nhiều ưu điểm vượt trội vì không chỉ
Trang 2* Trường Đại học Y Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thị Bình (nguyenthibinh_mp@yahoo.com.vn)
Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017
cải thiện được các triệu chứng lâm sàng
của bệnh, mà còn làm ngừng tiến triển bệnh
Các TBG ngoại bì thần kinh bào thai khi
ghép vào thể vân sẽ biệt hóa thành TB
sản xuất dopamin, tạo ra các synap với
TB thần kinh của người bệnh [3] Các nơ
ron tiết dopamin chỉ chiếm khoảng 1% tổng
số nơ ron trong n o, nhưng đóng vai trò
quan trọng trong nhiều chức năng của não
như vận động tự chủ, giải phóng hormon
thần kinh nội tiết, nhận thức, điều khiển
hành vi cảm xúc, stress và trí nhớ Khi số
lượng các TB thần kinh này bị giảm sút sẽ
dẫn đến nhiều rối loạn thần kinh nghiêm
trọng, nổi bật nhất là bệnh Parkinson [4]
Ở người, số lượng TB thần kinh tiết dopamin
rất ít, chỉ khoảng 400.000
Ở động vật có vú, các TB tiết dopamin
được phân chia thành 9 nhóm, nằm rải
rác từ não giữa tới hành khứu Theo
Nguyễn Thanh Hoa và CS (2015), sàn
não giữa phôi chuột cống trắng là nơi tập
trung nhiều TB tiết dopamin [2] Mỗi lần
ghép để điều trị Parkinson cần tới 40.000
TBG ngoại bì thần kinh não giữa và để có
được số lượng TB này cần tới 4 não giữa
phôi [5, 6] Vì vậy, nuôi cấy để tăng sinh
số lượng nơ ron nói chung và số lượng
nơ ron tiết dopamin là cần thiết Các TB
của sàn não giữa sẽ thay đổi thế nào sau
khi nuôi cấy in vitro? Để trả lời câu hỏi này,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm:
- Nghiên cứu cấu trúc siêu vi của mô
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
- 10 mẫu mô sàn não giữa phôi chuột cống trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi
- 10 mẫu TBG trung mô sàn não giữa phôi chuột cống trắng sau nuôi cấy 6 - 8 ngày
2 Phương pháp nghiên cứu
- Tạo phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi (20 phôi)
- Phẫu tích lấy sàn não giữa (20 mảnh)
- Dùng Dispase II , trypsin - EDTA và lực
cơ học để tạo dịch treo TB (10 mẫu)
- Nuôi cấy trong môi trường cơ bản: DMEM/F12 có bổ sung thêm các yếu tố tăng trưởng, kháng sinh, kháng nấm
- Cấy TBG ngoại bì thần kinh não giữa phôi chuột với mật độ 1,5 x 104 cm2 trên giếng nuôi cấy hoặc trong chai flask, trong
tủ ấm 370C, 5% CO2
- Thay môi trường mỗi 2 ngày/lần, đồng thời đánh giá sự phát triển của TB bằng kính hiển vi soi nổi
- Các mảnh mô sàn não giữa và mẫu TB nuôi cấy được làm tiêu bản hiển vi điện tử: + Cố định bằng glutarandehyt 2,5%/ cacodylate 0,1 M, pH 7,2 - 7,4 qua đêm
ở 40C
+ Rửa mẫu bằng dung dịch cacodylate
Trang 3đúc block, cắt lát mỏng 30 - 40 nm, nhuộm
bằng uranyl acetate trong 10 phút và citrate
chì trong 5 phút
+ Kính hiển vi điện tử quét: khử nước, phủ
vàng
trúc của TB và bào quan trước và sau nuôi cấy
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Cấu trúc siêu vi sàn não giữa phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi
(Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), đám glycogen (Gl), bộ golgi (Gol), nhân TB (Nu))
Các TB nằm sát nhau dạng biểu mô (hình 1A) Tỷ lệ nhân/bào tương của TB cao Trong bào tương của TB, số lượng bào quan và chất vùi tăng r rệt: lưới nội bào có hạt dài, lòng rộng, mặt ngoài ít ribosom bám; ty thể nhiều và đa dạng; bộ golgi điển hình; glycogen tập trung thành những đám khá lớn (hình 1B, C) Một số TB có hình thái của TBG với nhân lớn, trong bào tương ít bào quan (hình 1D)
D
C
B
A
Trang 4
12,5 - 13,5 ngày tuổi
(Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhánh bào tương (*))
Các TB biệt hóa thành nơ ron có nhánh bào tương Trong các nhánh có nhiều tơ thần kinh và một số bào quan như lưới nội bào có hạt và ty thể Một số nhánh bào tương có phần tận cùng phình to và tiếp xúc với TB khác Tuy nhiên, chưa quan sát thấy hình ảnh tạo synap giữa các TB (hình 2A, B, C)
2 Siêu cấu trúc của TB sàn não giữa chuột cống trắng sau nuôi cấy 6 - 8 ngày
Trang 5
(A: liên kết giữa các nơ ron; B: các nhánh bào tương (*); C: nón tăng trưởng (*); D: synap giữa các nơ ron; E: bào tương của nơ ron; F: nguyên bào thần kinh;
Ty thể (Mi), lưới nội bào có hạt (RER), nhân TB (Nu))
Các nơ ron liên kết với nhau chằng chịt
rất nhiều và rất dài (hình 3B) Đầu của các
nhánh phình to, tiếp xúc với nơ ron khác
synap với cấu trúc điển hình (hình 3D)
Trong bào tương, lưới nội bào có hạt
phát triển, thành có nhiều ribosom bám
biểu hiện nhân to, bào tương ít bào quan
(hình 3F)
BÀN LUẬN
Trong quá trình phát triển phôi thai, khi
máng thần kinh mới khép thành ống thần
kinh là biểu mô gồm một hàng TB gọi là
biểu mô thần kinh Ở não giữa, thành não
dày lên do tăng sinh mạnh các TB biểu
mô làm thành ống có dạng biểu mô trụ
giả tầng, gồm 2 loại TB là nguyên bào
xốp và nguyên bào thần kinh Các nguyên
bào thần kinh sẽ di cư ra vùng ngoại vi
của thành ống thần kinh Sự di cư, biệt
hóa của những TB này chia thành ống
thành 3 lớp: lớp nội tủy, lớp áo và lớp
màn rìa Những nguyên bào thần kinh và
nguyên bào thần kinh đệm nằm ở lớp áo Các TBG ngoại bì thần kinh ở não giữa bắt đầu phát triển, tăng sinh và biệt hóa bằng sự xuất hiện TB thần kinh xuyên tâm Nhiều nghiên cứu cho thấy: chính những TB này biệt hóa thành nơ ron tiết dopamin sau này [7, 8, 9] Ở thời điểm phôi 12,5 - 13,5 ngày tuổi, trong sàn não giữa các TB đứng sát nhau Trong bào tương TB, bào quan như lưới nội bào,
ty thể, bộ golgi phát triển Xen giữa các
TB có nhánh bào tương trong có xơ thần kinh Theo Sturrock R.R (1982), đây là những nhánh bào tương của TB thần kinh đệm hoặc là một giai đoạn phát triển sợi trục của nơ ron [10] Có những nhánh bào tương có đầu tận cùng phình to và tiếp xúc với nhánh hoặc thân TB khác Đây chính là hình ảnh của nón tăng trưởng Điều này chứng tỏ, ở sàn não giữa phôi chuột 12,5 - 13,5 ngày tuổi các TB đ
di cư Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, chúng tôi chưa thấy tạo synap giữa các TB trong thành não giữa, như vậy quá trình biệt hóa thành các nơ ron chưa kết thúc
Trang 6Khi tiến hành nuôi cấy, chúng tôi dùng
enzym và tác động cơ học để ly giải mô
sàn não giữa thành dịch treo TB Trong
dịch treo gồm hỗn hợp các loại TB ở
dạng gốc và đang phát triển ở những giai
đoạn khác nhau Sau nuôi cấy 6 - 8 ngày,
TB tăng sinh nhanh chóng Trong chai
nuôi cấy, chúng tôi thấy có những đám
TB dạng biểu mô, TB ít nhánh, TB sao và
nơ ron Theo thời gian, các nơ ron xuất
hiện càng nhiều, nhánh dài và liên kết với
nhau chằng chịt khi quan sát dưới kính
hiển điện tử quét Trên các lát cắt siêu vi
của mẫu nuôi cấy, chúng tôi thấy nơ ron
đang phát triển ở các giai đoạn khác nhau:
có nơ ron giữ nguyên tính gốc, có nơ ron
có nhánh ngắn, có nơ ron với các nhánh
tạo thành nón tăng trưởng Đặc biệt,
chúng tôi đ quan sát thấy synap tạo
thành giữa các nơ ron Như vậy, sau 6 - 8
ngày nuôi cấy đ xuất hiện những nơ ron
được biệt hóa hoàn toàn Trong số các
nơ ron này có những nơ ron dương tính
với marker TH, là marker đặc hiệu cho TB
thần kinh tiết dopamin Điều này chứng tỏ
một số TBG đ được biệt hoá thành các
nơ ron tiết dopamin sau nuôi cấy
KẾT LUẬN
Quan sát bằng kính hiển vi điện tử,
chúng tôi nhận thấy:
- Các TB sàn não giữa phôi chuột cống
trắng 12,5 - 13,5 ngày tuổi đ bắt đầu di cư
và biệt hóa, nhưng sự biệt hóa các nơ ron
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Văn Chương Bệnh học thần
kinh NXB Y học Hà Nội 2011
2 Nguyễn Thanh Hoa, Nguyễn Thị Bình, Nguyễn Mạnh Hà Biến đổi siêu cấu trúc não
giữa phôi chuột cống trắng 10,5 - 13,5 ngày tuổi Tạp chí Y học Việt Nam 2015, 1 (433), tr.35-39
3 Brundin P, Kordower J.H Neuropathology
in transplants in Parkinson’s disease: Implications for disease pathogenesis and the future of cell therapy Prog Brain Res 2012,
200, pp.221-241
4 Chinta S.J, Andersen J.K Dopaminergic
neurons The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005, 37 (5), pp.942-946
5 Olanow C.W, Goetz C.G, Kordower J.H, Stoessl A.J, Sossi V et al A double-blind
controlled trial of bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson’s disease Ann Neurol 2003, 54, pp.403-414
6 Lindvall O, Bjorklund A Cell Therapeutics
in Parkinson’s Disease Neurotherapeutics 2011
7 Ono Y, Nakatani T, Sakamoto Y et al
Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells Development
2007, 134 (17), pp.3213-3225
8 Shults C.W, Hashimoto R, Brady R.M
et al Dopaminergic cells align along radial
glia in the developing mesencephalon of the rat Neuroscience 1990, 38 (2), pp.427-436
9 Hebsgaard J.B, Nelander J, Sabelstrom
H et al Dopamine neuron precursors within