Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách các kháng sinh họ β – lactam bởi sắc ký điện di mao quản . Được thực hiện trên hệ thống điện di 1602A 3D của hãng Agilent, mao quản có lớp phủ silica với chiều dài 75,5cm. Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH= 6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin và Penicillin-G trong đó Ampicilin được tách ra ở 16 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là ≤ 0,7 µg/ml cho mỗi kháng sinh. Rồi áp dụng phương pháp này để xác định trong mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2- 105,8%.
Trang 1295
KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH
ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH HỌ β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI
Nguyễn Thị Ánh Tuyết 1 , Nguyễn Văn Ri 2
1 Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên
2 Đại học quốc gia Hà Nội
TÓM TẮT
Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách các kháng sinh họ β – lactam bởi sắc ký điện di mao quản Được thực hiện trên hệ thống điện di 1602A 3D của hãng Agilent, mao quản có lớp phủ silica với chiều dài 75,5cm Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH= 6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin và Penicillin-G trong đó Ampicilin được tách ra ở 16 phút Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là ≤ 0,7 µg/ml cho mỗi kháng sinh Rồi áp dụng phương pháp này để xác định trong mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2- 105,8%.
Từ khóa: Mao mạch phát hiện giới hạn, phục hồi
MỞ ĐẦU
β- lactam được dùng như các thuốc kháng
khuẩn từ hơn 80 năm nay mà vẫn là một
nhóm quan trọng của kháng sinh Mỗi loại
kháng sinh lại có tác dụng nhất định, có thể
hạn chế hay tiêu diệt được mầm bệnh trong y
học, chăn nuôi hay sản xuất[1] Tuy nhiên
liều lượng của nó cũng để lại hậu quả rất lớn
đối với sức khỏe của con người, do đó việc
xác định hàm lượng kháng sinh là rất cần
thiết Bên cạnh kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng
cao, điện di mao quản cũng là một kỹ thuật
đầy triển vọng để tách các chất phân tích có
mang điện tích cũng như trung tính và được
ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau
Trong những năm gần đây phương pháp này
đã thu hút rất nhiều nhà khoa học bởi những
ưu điểm nổi bật như kỹ thuật dể sử dụng, tính
linh hoạt cao, tiết kiệm hóa chất và khả năng
tách tốt hơn nữa phương pháp cũng cho độ tin
cậy cao[2,3]
Trong nghiên cứu này, chúng tôi công bố điều kiện tách và xác định một số kháng sinh họ β – lactam bằng phương pháp điện di mao quản
điện động học kiểu mixen(dùng mao quản
Highsensitip)
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp tách và xác định các β-Lactam
sử dụng chất hoạt động bề mặt, sodium dodecyl sunfate- SDS làm pha tĩnh, là các mixen mang điện tích âm, còn gọi là các pha tĩnh giả Các mixen mang tính anion, được pha chế trong dung dịch đệm, chứa trong mao quản hẹp bằng silic, có đường kính 50 µm
Áp vào hai đầu mao quản trường điện áp cao (10-30KV), khi đó dung dịch đệm di chuyển
từ cực dương sang cực âm, các mixen cũng di chuyển về phía cực âm nhưng có tốc độ khác với tốc độ dung dịch đệm Các mixen có chức năng hấp thu các chất phân tích ở mức độ khác nhau tùy thuộc vào tính tương tự về độ phân cực giữa các mixen và từng chất phân tích.
Hình 1 Tách các β-Lactam bằng phương pháp MEKC*
*
Trang 2Nhờ sự phân bố khác nhau, các β-Lactam di
chuyển với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau
Điều kiện rất quan trọng là giá trị pH, nồng
độ đệm, thế điện di để phương pháp tách có
hiệu quả cao nhất
THỰC NGHIỆM
Thiết bị và hóa chất
- Máy điện di model 1602A của hãng Agilent,
HP3D, detector DAD, mao quản silica trần
d=50µm, chiều dài 75.5 cm, hiệu dụng 70 cm
- Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat
Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt SDS,
NaOH … của hãng Merk Nước deion được
lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore
Các chất chuẩn: amoxicillin – AMO,
ampicillin – AMP, penicillin G – PENG,
oxacillin – OXA, cloxacillin – CLO,
cephalexin – CEP, do Viện kiểm nghiệm Bộ
Y tế cung cấp
Nghiên cứu điều kiện tách các β- Lactam
bằng phương pháp điện di
Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di đến
khả năng tách các β- Lactam
Nghiên cứu này, ảnh hưởng của pH trong
dung dịch đệm điện di được khảo sát với
dung dịch điện di chứa các chất kháng sinh
cùng nồng độ 2 µg/ml, 15mM đệm Borat +
75mM SDS Mao quản được đặt ở nhiệt độ
280C, điện áp phân cực 22kV Mẫu được bơm
ở áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 10s
Các giá trị pH thay đổi là 6,5; 6,8; 7,0; 7,2
Trong nghiên cứu này, cặp CEP-AMP có ∆t
giảm dần theo chiều tăng của pH, cặp
OXA-CLO có ∆t thay đổi không đáng kể Sự thay
đổi pH làm thay đổi lớp điện kép của thành
mao quản, do đó làm ảnh hưởng đến sự điện
di của các chất
Như vậy tăng pH của dung dịch đệm, rút ngắn thời gian phân tích, tuy nhiên khả năng tách giảm, nên phải chọn một giá tri pH phù hợp
Ở pH = 6,5 các β- Lactam tách tốt nhưng có
một píc nhỏ dính vào píc của PEN-G làm cho diện tích của píc không chính xác nên chúng tôi chọn pH = 6,8 để tách các β-Lactam trong
những nghiên cứu tiếp theo Khảo sát ảnh
hưởng của nồng độ đệm
Chất điện ly trong pha động cũng có vai trò quan trọng vì nó là chất dẫn điện, tạo dòng
điện di thẩm thấu Trong thực tế, người ta cố
gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính
là chất điện giải của sắc ký điện di Chúng tôi chọn Natritetraborat vừa là chất đệm pH vừa
là chất điện giải
Khảo sát nồng độ đệm tại 4 gía trị là 10mM; 15mM; 20 mM; 25mM với 75mM SDS, pH = 6,8 Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 250C Các chất kháng sinh cùng nồng độ 1µg/ml Kết quả cho thấy tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của 6 kháng sinh β-Lactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan tăng nhưng hiệu quả tách cũng không tốt Theo dõi sự chênh lệch thời gian lưu ( ∆ tR) của các cặp: CEP-AMP; PENG- OXA cho thấy quy luật biến đổi ∆ tR theo nồng độ dung dịch đệm cũng không giống nhau (bảng 2) Nồng độ đệm 20mM, lực ion thấp hơn, giảm
được dòng điện di, tăng sự hấp phụ của mẫu
lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém, hai pic của CEP và AMP dính vào nhau Chúng tôi chọn nồng độ 15mM đệm Borat là
điều kiện tối ưu
Bảng 1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam
Khoảng cách 2 pic, ∆ tR 0,416 1,018 0,731 0,306
Khoảng cách 2 pic , ∆ tR 0,268 0,999 0,792 0,568
Khoảng cách 2 pic, ∆ tR 0,566 1,321 0,564 0,732
Khoảng cách 2 pic, ∆ t R 0,624 1,362 1,345 0,805
Trang 3297
Bảng 2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu (phút)
Nồng độ
đệm
Thời gian di chuyển của β-Lactam, phút
∆ tR của 2 β-Lactam 0,268 0,586
∆ tR của 2 β-Lactam 0,794 0,835
∆ t R của 2 β-Lactam 0,304 0,069
25 mM 7,505 10,012 12,879 12,932 15,375 16,873 16,934 ∆ tR của 2 β-Lactam 0,053 0,061
Hình 2 Sắc đồ điện di của 6 kháng sinh họ β-lactam tại điều kiện tối ưu: pH = 6,8; 15 mM đệm borat,
75 mM SDS, thế 22 kV, nhiệt độ mao quản 25 0 C, bơm mẫu 8s, nồng độ các chất 2µg/ml Thứ tự các
chất: 1- AMO; 2- PENG; 3-OXA; 4-CLO; 5-CEP và 6- AMP
Khảo sát ảnh hưởng của thế điện di và các
điều kiện khác
Khi tăng thế điện từ 18kV đến 25kV thì thời
gian di chuyển của các β-Lactam càng giảm
do độ linh động điện di tỷ lệ thuận với thế
Mặt khác thế càng cao, nhiệt sinh ra trong
mao quản càng tăng, làm cho sự chênh lệch
nhiệt độ giữa thành mao quản và trong lòng
của nó, dẫn đến độ nhớt chênh lệch đây chính
là nguyên nhân làm giảm hiệu quả tách Tại
thế 18kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt,
nhưng thời gian lưu lớn (20,6 phút cho AMP),
nhưng thế 25kV thời gian lưu ngắn hơn
nhưng hiệu quả tách kém hơn, pic CEP và
CLO dính chân vào nhau Vì vậy chúng tôi
chọn thế tại 22kV là phù hợp nhất để tách các
β-Lactam
Để có được píc rõ ràng và độ hấp thụ píc cao
nhất thì thời gian bơm mẫu cần 8s cho nồng
độ từ 0,2- 15 µg/ml ,nồng độ SDS 75mM,
nhiệt độ mao quản 250C
Đánh giá phương pháp phân tích
Tiến hành lập đường chuẩn của 6 chất kháng sinh β-lactam tại các nồng độ khác nhau: với AMO, CEP, CLO thì nồng độ khảo sát từ 0,2-10µg/ml còn các chất AMP, OXA và PEN-G nồng độ khảo sát từ 0,3-10µg/ml Mỗi nồng
độ được đo lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung
bình Sử dụng origin 8.0 xử lý, kết quả thu
được trình bày ở bảng 3
Để đánh giá độ chính xác của phương pháp
phân tích, chúng tôi tiến hành chọn 3 mẫu tương ứng với điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính đó là 1µg/ml; 5µg/ml và 10µg/ml Tiến hành đo các mẫu trên với điều kiện tối ưu, mỗi mẫu đo lặp lại 5 lần Kết quả cho thấy độ chính xác nằm trong giới hạn cho phép <15% Do đó chúng tôi áp dụng phương pháp này vào phân tích mẫu dược phẩm
Trang 4Bảng 3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Chất phân
tích
Phương trình
y = Ax+ B
R Độ lệch chuẩn
(S y )
LOD µg/ml
LOQ µg/ml
Bảng 4 Kết quả tính hàm lượng kháng sinh trong mẫu dược phẩm
Tên thuốc,
hoạt chất ∆C
Chiều cao pic (mAU)
Hiệu suất trung bình
%H
Khối lượng
TB 1 viên thuốc (mg)
Khối lượng (mg) Trên
nhãn
Tìm thấy
Ampicillin
(AMP)
0 11,5
1,48
Amoxicilin
(AMO)
0 13,1
1,13
Cloxacillin
(CLO)
Oxacillin
Sodium
Capsule
(OXA)
0 22,3 2,24
94,70
582,2 500 642,43
Cephalexin
(CEP)
0 14,6
Hình 3 Sắc đồ điện di của mẫu thuốc chứa amoxicilin và cloxacillin
Trang 5299
Phân tích mẫu dược phẩm
Các mẫu dược phẩm AMO,CLO, AMP, CEP,
OXA được mua từ các đại lý dược khác nhau
Mẫu phân tích được chuẩn bị bằng cách trộn
đều 4 viên con nhộng, lấy mẫu đại diện, đem
cân khối lượng thích hợp m=0,02(g) hòa tan
bằng nước đêion, siêu âm trong vòng 15 phút,
định mức trong bình 20ml bằng nước đêion
Rồi lọc qua màng lọc 0,45µm Hút 2,5ml dịch
lọc pha loãng 100 lần ta được dung dịch B
(bµg/ml) Từ dung dịch B pha thành dung
dịch có nồng độ thấp hơn (Cxµg/ml) được
dùng trong ngày Tiến hành đo bằng phương
pháp thêm chuẩn đối với 5 mẫu thuốc, chạy
lặp lại mỗi mẫu phân tích 3 lần với điều kiện
tối ưu như chạy đường chuẩn, lấy kết quả
trung bình, sử lý bằng phần mềm origin 8 và
excel, kết quả thu được ở bảng 4
KẾT LUẬN Chúng tôi đã đưa ra một phương pháp có độ tin cậy dựa trên quá trình điện di dùng detector DAD để phát hiện, xác định đồng thời 6 chất kháng sinh β-lactam Rồi áp dụng phương pháp này vào xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu dược phẩm
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Vũ Thị Bảy – Nguyễn Châu Hải – Doãn Huy
Khắc – Nguyễn Thị Tâm – Định lượng kháng sinh, Nhà xuất bản Y học (1983)
[2] M I Bailon-Perez, L Cuadros Rodr´ ıguez, C
Cruces-Blanco, Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 43(2007) pp 746–752
[3] W.J Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy D.G,
Analyst, 119(12), (1994) 2595-2601
Công trình được sự tài trợ của đề tài QG 11.14
SUMMARY
STUDY OF CONDITION OF SEPARATION AND DETERMINATION OF
β -LACTAM ANTIBIOTICS BY CAPILLARY ELECTROKINETIC
CHROMATOGRAPHY
Nguyen Thi Anh Tuyet *1 , Nguyen Van Ri 2
1 College of Medicine and Pharmacy - TNU
2 Hanoi National University
In the study, condition of seperation of β – lactam antibiotics by capillary electrokinetic chromatography is investigated The electrophoresis system is 1602A 3D from Agilent The capillary is coating silica with 75,5cm length, 50 µ m id The background electrolyte is solution of Natritetraborat 15mM with 75mM SDS, pH of 6,8 Amoxicilin, Ampicillin, Cloxacillin, Oxacillin, Penicillin-G, Cephalexin, ampicillin are separated in 16 minutes Limit of detection (LOD) of method is ≤ 0,7µg /ml for each The method is applied for detemination of β – lactam antibiotics in pharmaceutical products, recovery is from 94,2 -105,8%
Keyword: capillary electrokinetic, detection limits, recovery
*