Đề tài đặt vấn đề và đưa ra mục tiêu nghiên cứu sau: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene blaOXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp chúng kháng carbapenem. Xây dựng qui trình evagreen real‐time PCR phát hiện các gen blaoxa ở acinetobacter baumannii
Trang 1Nguyễn Tuấn Anh * , Huỳnh Minh Tuấn ** , Nguyễn Văn Vĩnh Châu *** , Hồ Huỳnh Thùy Dương *,****
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính
đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene bla OXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp chúng kháng carbapenem.
Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình real‐time PCR phát hiện các gene bla OXA‐23/‐51/‐58 ở A. baumannii.
Phương pháp: Qui trình được xây dựng từ khâu thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi, xác định
thành phần và chương trình real‐time PCR tối ưu cho phản ứng nhân bản các gene bla OXA‐23/‐51/‐58.
Kết quả: Kết quả cho thấy qui trình có khả năng phát hiện chính xác các gene bla OXA‐23/‐51/‐58 đặc trưng của A. baumannii với độ nhạy (1,42x10 0 ‐1,42x10 1 bản sao/μl) và độ đặc hiệu cao.
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình EvaGreen real‐time PCR phát hiện các nhóm gene
bla OXA‐23/‐51/‐58 ở A. baumannii. Qui trình có thể được sử dụng để phát hiện nhanh các chủng A. baumannii mang các gene này và tiềm năng trở thành công cụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện các gene
bla OXA ở A. baumannii trong môi trường bệnh viện.
Từ khóa: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen
ABSTRACT
DEVELOPMENT OF AN EVAGREEN REAL‐TIME PCR PROTOCOL FOR THE DETECTION OF SEVERAL bla OXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII
Nguyen Tuan Anh, Huynh Minh Tuan, Nguyen Van Vinh Chau, Ho Huynh Thuy Duong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 197 ‐ 201
Backgrounds: Acinetobacter baumannii currently is the most leading and dangerous factor causing
nosocomial infections for their multidrug resistant traits. Aspecially, A. baumannii harbours bla OXA genes with ability of producing carbapenemase, helping them resist to carbapenem, the so‐called present strongest antibiotic, commonly used in multidrug resistant bacterial infections.
Objectives: To set up and optimize an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of bla OXA‐23, ‐51,
‐58 genes in A. baumannii
Methods: The process was constructed through basic steps: specific primer design and experimental check,
optimization of real‐time PCR components and temperature program using the intercalating dye, EvaGreen, and finally evaluating the specificity and sensitivity of the system.
Results: The results showed that the protocol could be used to detect correctly bla OXA‐23/‐51/‐58 genes specific to A. baumannii with high specificity and sensitivity.
Conclusions: We built up successfully an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of bla OXA‐23/‐ 51/‐58 genes in A. baumannii. The protocol can also be used to identify rapidly strains of A. baumannii possessing these genes and potentially becomes a tool to study bla OXA‐owning A. baumannii infection
* Công ty TNHH CNSH Khoa Thương ** Khoa Kiểm soát Nhiễm khuẩn, BV ĐH Y Dược Tp.HCM
*** Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp.HCM. **** Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh
Trang 2Keywords: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen
ĐẶT VẤN ĐỀ
Acinetobacter baumannii (A. baumannii), trực
khuẩn Gram (‐) không lên men glucose, đang
trở thành tác nhân nhiễm trùng bệnh viện
nguy hiểm nhất, đặc biệt ở những bệnh viện
đông bệnh nhân(2,1). Vì sự xuất hiện và gia tăng
những chủng A. baumannii đa kháng thuốc,
carbapenem được lựa chọn để điều trị khi
nhiễm những chủng này. Carbapenem, điển
hình là imipenem và meropenem, có phổ hoạt
tính rất rộng, kháng lại vi sinh vật Gram (+) và
Gram (‐), bao gồm cả vi khuẩn yếm khí. Đặc
biệt, carbapenem là lựa chọn để điều trị những
trường hợp nhiễm khuẩn nặng, có biểu hiện
kháng β‐lactamase phổ rộng (ESBL) và AmpC
β‐lactamase(4,9).
Carbapenem thuộc nhóm kháng sinh β‐
lactam, bao gồm penicillin, cephalosporin và
carbapenem, là nhóm kháng sinh quan trọng,
được sử dụng để điều trị nhiễm trùng gây ra bởi
nhiều loại vi khuẩn, trong đó có A. baumannii, vì
tính hiệu quả và an toàn; ngoài ra hoạt tính của
nhóm kháng sinh này dễ dàng được tăng lên
nhờ những cải biến trong cấu trúc phân tử(10,9).
Nhóm kháng sinh này hoạt động kìm hãm sinh
trưởng và phân chia tế bào vi khuẩn bằng cách
bất hoạt peptidoglycan transpeptidase(1), enzyme
có vai trò quan trọng trong hình thành mạng
lưới peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn. Sự
bất hoạt enzyme này dẫn đến làm chết tế bào vi
khuẩn. Tuy nhiên, enzyme β‐lactamase là
enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn, với hoạt tính
phân hủy kháng sinh β‐lactam, có vai trò bảo vệ
vi khuẩn khỏi kháng sinh và cũng là nguyên
nhân chính dẫn đến tính kháng đối với nhóm
kháng sinh này.
Enzyme β‐lactamase được phân chia thành
bốn nhóm phân tử riêng biệt, gồm lớp A, B, C và
D, dựa trên tính tương đồng về trình tự amino
acid. Oxacillinase (OXA) là β‐lactamase lớp D, có
đặc tính thủy phân oxacillin nhanh hơn hơn
penicillin hoặc benzylpenicillin(3). Điều đặc biệt,
một số enzyme trong nhóm này có hoạt tính thủy phân carbapenem(10). Các enzyme OXA có khả năng thủy phân carbapenem được chia thành 8 nhóm phụ, trong đó có 4 nhóm đã được phát hiện ở A. baumaniii là OXA‐23(9), OXA‐
24(2), OXA‐51(11), OXA‐58(13). Dịch tễ phân tử cho thấy các nhóm gen
blaOXA hiện diện trên khắp thế giới(7). Chủng A.
baumannii mang nhóm gene blaOXA‐23 phổ biến
ở United Kingdom, Brazil, Argentina, China, Korea, Singapore, Vietnam, USA, Libya, Pakistan, Australia và Columbia(7,15). Các chủng
A. baumannii với nhóm gene blaOXA‐58 được phát hiện đầu tiên ở Pháp và hiện nay đã xuất hiện ở Argentina, Colombia, Bolivia, Chile, Venezuela, Spain, Turkey, Romania, United Kingdom, Italy, Poland, Switzerland, Germany, Ireland, Portugal, Hungary, Bulgaria, Greece, USA, Oceania và Asia(7,12). Nhóm gene blaOXA‐24 ban đầu là nhóm ít phổ biến hơn các nhóm còn lại, nhưng hiện đã xuất hiện ở Brazil, Taiwan, France, Croatia, Chile, Spain, Belgium, Czech Republic, USA và Iran(17). Một số chủng A.
baumannii kháng với carbepenem với vai trò chủ
yếu là của nhóm gene blaOXA‐51. Nhóm gene này được cho là tồn tại tự nhiên gần như ở tất cả
các chủng A. baumannii(2,16).
Carbapenemase phổ biến nhất ở A.
baumannii là β‐lactamase mã hóa bởi blaOXA(17). Nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình phát hiện các gene blaOXA‐23, ‐51, ‐58 phục vụ cho mục đích nghiên cứu dịch tễ học phân tử và cơ chế biểu hiện của những gene này. Từ đó, có cơ
sở để xác định những chủng nguy hiểm, nguy cơ cao gây nhiễm trùng bệnh viện.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu
Vi khuẩn A. baumannii chuẩn (ATCC 19606) mang gene OXA‐51 và các mẫu vi khuẩn A.
baumannii được phân lập từ bệnh phẩm của
bệnh nhân điều trị ở bệnh viện Đại học Y Dược
Trang 3TP. Hồ Chí Minh trong thời gian từ tháng
01/2012 đến tháng 12/2013.
Thiết kế mồi
Các cặp mồi đặc hiệu cho từng nhóm gene
blaOXA‐23, ‐51, ‐58 và một cặp mồi đặc hiệu cho
gene 16S rRNA của A. baumannii (Bảng 1) làm
đối chứng nội phản ứng được thiết kế và đánh giá bằng một số phần mềm sinh học phân tử chuyên dụng như PrimerQuest, Oligo Analyzer, Annhyb, và Blast (NCBI). Mồi được đặt tổng hợp tại công ty IDT (Integrated DNA Technologies, USA).
Bảng 1. Trình tự các mồi được thiết kế
Phương pháp tách chiết DNA của A.
baumannii
Khuẩn lạc đặc trưng của A. baumannii được
thu nhận và tăng sinh trong môi trường LB ở
điều kiện 370C trong 24 giờ. Sau khi kết thúc
tăng sinh, DNA bộ gene của A. baumannii được
tách chiết theo nguyên tắc hấp phụ đặc hiệu
lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách chiết
“DNA column‐based extraction kit” (Khoa
Thương). Tất cả mọi thao tác đều được thực
hiện theo đúng hướng dẫn trong bộ kit của
nhà sản xuất.
Thành phần phản ứng EvaGreen real‐time
PCR
Hỗn hợp phản ứng EvaGreen real‐time PCR
có thành phần gồm 1X AptaTaq Fast DNA
polymerase (Roche), 200 nM cho từng cặp mồi
xuôi và ngược (IDT) OXA23‐F/R, OXA51‐F/R,
OXA58‐F/R hoặc IC‐F/R, 1X EvaGreen (Biotium), 5μl DNA trong tổng thể tích là 25μl. Chu trình nhiệt cho phản ứng EvaGreen real‐time PCR: 40 chu kỳ gồm 15 giây ‐ 95oC và 15 giây ‐ 60oC. Chương trình phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tương ứng với quá trình tăng nhiệt độ
từ 65oC lên 95oC, mỗi bước tăng 0,5oC và lưu trong 20 giây.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hiệu quả nhân bản của mồi
Chúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của từng cặp mồi thiết kế bằng phản ứng EvaGreen real‐time PCR trên mẫu DNA tách chiết từ vi
khuẩn A. baumannii sau tăng sinh. Các mẫu vi
khuẩn này đã được xác định sở hữu các gene
blaOXA tương ứng bằng phương pháp giải trình
tự gene.
Hình 1. Hiệu quả nhân bản của mồi
Kết quả (Hình 1) cho thấy chỉ một đỉnh chảy
đặc trưng tương ứng với mỗi cặp mồi, không
hiện diện các đỉnh chảy (sản phẩm) ký sinh. Như
vậy, bộ mồi thiết kế hoạt động nhân bản hiệu quả trong phản ứng PCR. Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các sản phẩm nhân bản trình tự gen
Trang 4OXA23 (114 bp), OXA51 (148 bp), OXA58 (110
bp) và IC (199 bp) tương ứng được xác định là
80,0oC; 78,5oC; 78,5oC và 84,0oC. Như vậy, căn cứ
vào nhiệt độ nóng chảy đặc trưng có thể nhận
diện được các sản phẩm nhân bản của các cặp
mồi tương ứng.
Tính đặc hiệu của mồi
Tính đặc hiệu của các cặp mồi được kiểm
tra với DNA đặc trưng của A. baumannii và của
các vi khuẩn khác như E. coli (ATCC 25922,
35218, 35401), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603),
Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella typhimurium (ATCC 29946), Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Vibrio parahaemolyticus
(ATCC 17802), Shigella sonnei (ATCC 29030),
Shigella flexneri (ATCC 15391), Shigella boydii
(ATCC 8700).
Hình 2. Tính đặc hiệu của mồi
Kết quả cho thấy các cặp mồi OXA23‐F/R,
OXA51‐F/R và OXA58‐F/R đặc hiệu với những
đỉnh chảy đặc trưng, không nhân bản DNA của
các vi khuẩn không phải là A. baumanniii (Hình
2). Riêng với cặp mồi OXA58‐F/R, đỉnh chảy ở
nhiệt độ 71oC được xác định là của nhị phân mồi
(primer‐dimer). Cặp mồi IC‐F/R được thiết kế
đặc hiệu với 16S rRNA của A. baumannii, không
đặc hiệu với 16S rRNA của các vi khuẩn khác. Vì
thế, phản ứng kém với DNA của vi khuẩn khác,
thể hiện qua tín hiệu định lượng thấp (không thể
hiện ở đây) và những đỉnh chảy với nhiệt độ
không đặc trưng.
Tối ưu hóa nhiệt độ lai (Ta)
Chúng tôi khảo sát các nhiệt độ lai từ
50,0oC đến 65,0oC, bao gồm các nhiệt độ sau:
50,0oC; 51,0oC; 53,0oC; 55,9 oC; 59,5oC; 62,5oC;
64,1oC; 65,0oC. Mẫu DNA A. baumannii sử
dụng có nồng độ 1,42x101 bản sao/μl. Tiêu chí
tối ưu là giá trị Ct của phản ứng real‐time PCR
càng nhỏ càng tốt.
Bảng 2. Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai của mồi
OXA23-F/R 28,8 28,7 28,2 27,4 26,6 26,9 26,8 27,1
OXA51-F/R 30,3 29,7 29,6 29,3 28,5 28,1 27,3 28,5
OXA58-F/R 33,8 33,4 32,1 31,9 30,4 30,1 30,2 30,3
IC-F/R 31,8 31,6 31,1 29,2 28,8 28,6 28,5 28,1
Kết quả cho thấy khoảng nhiệt độ lai phù hợp cho cả bốn cặp mồi là từ 59,5oC đến 65,0oC. Với khoảng nhiệt độ này, phản ứng nhân bản trên cả bốn cặp mồi cho hiệu quả ổn định, giá trị
Ct thấp và các đỉnh chảy phân tách rõ ràng. Nhiệt độ lai tối ưu được chọn là 62,5oC.
Tối ưu hóa nồng độ mồi
Thí nghiệm được tiến hành với 3 nghiệm thức 1, 2 và 3 với nồng độ mồi lần lượt là 100,
200 và 300 nM. Bốn loại mồi được tối ưu riêng
rẽ. Nhiệt độ lai sử dụng như đã tối ưu ở trên.
Mẫu DNA A. baumannii sử dụng có nồng độ như
trên. Mỗi mẫu được lập lại 3 lần chạy.
Bảng 3: Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi
Nghiệm thức OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R
1 31,4±0,7 34,7±0,2 36,6±0,6 32,6±0,4
2 29,2±0,1 30,3±0,1 33,2±0,5 29,6±0,3
3 28,9±0,1 30,1±0,1 32,2±0,6 28,8±0,1 Kết quả (Bảng 3) cho thấy với mỗi mẫu thử, giá trị Ct ở nồng độ mồi 200 và 300 nM tương đương nhau và luôn tốt hơn giá trị Ct của nồng
độ mồi 100nM. Vì vậy, nồng độ mồi 200 nM được chọn tối ưu cho mỗi loại mồi khảo sát, do lượng cần dùng trong phản ứng ít hơn.
Độ nhạy của phản ứng
Để kiểm tra độ nhạy của phản ứng EvaGreen real‐time PCR, thí nghiệm được tiến
Trang 5A. baumannii sau tăng sinh (1.42x106 bản sao/μl),
được pha loãng theo bậc 10. Điều kiện phản ứng
sử dụng như đã tối ưu ở trên. Mỗi mẫu được lập
lại 3 lần chạy.
Bảng 4: Giá trị Ct khảo sát độ nhạy của phản ứng
EvaGreen real‐time PCR
1 1.42x105 15,2±0,4 16,2±0,5 19,2±0,4 16,0±0,5
2 1.42x104 18,2±0,1 19,5±0,3 22,4±0,2 19,2±1,0
3 1.42x103 21,7±0,1 23,2±0,1 26,7±0,8 23,6±0,6
4 1.42x102 24,7±0,3 26,5±0,0 29,5±0,5 26,8±0,9
5 1.42x101 28,9±0,2 31,0±0,1 33,8±0,8 31,5±0,3
6 1.42x100 33,4±0,7 35,2±0,3 N/A 36,0±0,6
(*) đơn vị nồng độ: bản sao/μl
Kết quả (Bảng 4) cho thấy phản ứng
EvaGreen real‐time PCR đối với mồi OXA23‐
F/R, OXA51‐F/R và IC‐F/R cho tín hiệu dương
tính ổn định với mẫu DNA có nồng độ 1.42x100
bản sao/μl; Trong khi đó, tín hiệu dương tính
của mồi OXA58‐F/R ổn định ở mẫu DNA nồng
độ 1.42x101 bản sao/μl.
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình
EvaGreen real‐time PCR để phát hiện các nhóm
gene blaOXA‐23, blaOXA‐51 và blaOXA‐58 của vi
khuẩn A. baumannii. Quy trình có thể được ứng
dụng để khảo sát dịch tễ học phân tử các gene
này ở các chủng A. baumannii khác nhau trong
lâm sàng và hỗ trợ trong chẩn đoán nhiễm A.
baumannii ở người bệnh như là một chọn lựa bổ
sung bên cạnh quy trình nuôi cấy truyền thống.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bonfiglio G, Russo G, and Nicoletti G (2002). Recent
developments in carbapenems. Expert Opin Investig Drugs
11(4), p. 529‐44.
2 Bou G, Oliver A, and Martinez‐Beltran J (2000). OXA‐24, a
novel class D beta‐lactamase with carbapenemase activity in
an Acinetobacter baumannii clinical strain. Antimicrob
Agents Chemother 44(6), p. 1556‐61.
3 Bush K, Jacoby GA, and Medeiros AA (1995). A functional classification scheme for beta‐lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother 39(6), p. 1211‐33.
4 Donald HM, et al. (2000). Sequence analysis of ARI‐1, a novel OXA beta‐lactamase, responsible for imipenem resistance in Acinetobacter baumannii 6B92. Antimicrob Agents Chemother 44(1), p. 196‐9.
5 Green DW (2002). The bacterial cell wall as a source of
antibacterial targets. Expert Opin Ther Targets 6(1), p. 1‐19.
6 Heritier C, et al. (2005). Characterization of the naturally occurring oxacillinase of Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 49(10), p. 4174‐9.
7 Higgins PG, et al. (2010). Global spread of carbapenem‐ resistant Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother 65(2), p. 233‐8.
8 Livermore DM and Woodford N (2006). The beta‐lactamase threat in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter. Trends Microbiol 14(9), p. 413‐20.
9 Nicolau DP (2008). Carbapenems: a potent class of antibiotics.
Expert Opin Pharmacother 9(1), p. 23‐37.
10 Nordmann P and Poirel L (2002). Emerging carbapenemases
in Gram‐negative aerobes. Clin Microbiol Infect 8(6), p. 321‐
31.
11 Peleg AY, Seifert H, and Paterson DL (2008). Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin Microbiol Rev 21(3), p. 538‐82.
12 Poirel L and Nordmann P (2006). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology. Clin Microbiol Infect 12(9), p. 826‐36.
13 Poirel L, et al. (2005). OXA‐58, a novel class D {beta}‐lactamase involved in resistance to carbapenems in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 49(1), p. 202‐8.
14 Theaker C, Azadian B, and Soni N (2003). The impact of Acinetobacter baumannii in the intensive care unit.
Anaesthesia 58 (3), p. 271‐4.
15 Turton JF, et al. (2005). Detection and typing of integrons in epidemic strains of Acinetobacter baumannii found in the United Kingdom. J Clin Microbiol 43(7), p. 3074‐82.
16 Turton JF, et al. (2006). Identification of Acinetobacter baumannii by detection of the blaOXA‐51‐like carbapenemase gene intrinsic to this species. J Clin Microbiol 44(8), p. 2974‐6.
17 Zarrilli R, et al. (2009). Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of
an emerging problem in health care facilities. J Infect Dev Ctries 3(5), p. 335‐41.