Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ chimerism trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy dị ghép tế bào gốc tạo máu. 20 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của bệnh nhân bạch cầu cấp dòng tủy và người cho tế bào gốc tạo máu.
Trang 1Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013
Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học
170
BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT CHIMERISM TRÊN BỆNH NHÂN DỊ GHÉP
TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR STR
Cao Sỹ Luân * , Phan Thị Xinh *,**
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định tỷ lệ chimerism trên bệnh nhân (BN) bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) dị ghép tế bào
gốc tạo máu (TBGTM).
Đối tượng và phương pháp: 20 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của BN BCCDT và người cho
TBGTM. Thực hiện phản ứng multiplex PCR Short Tandem Reapeat (STR) để xác định các dấu ấn STR có giá
trị theo dõi điều trị sau ghép và tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT dị ghép TBGTM.
Kết quả: Trong 18 STRs, chúng tôi đã xác định được 4 dấu ấn STR có giá trị theo dõi điều trị sau ghép trên
cặp người cho‐người nhận là CMR‐04 và 5 dấu ấn STR đối với các cặp CMR‐01 và CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐03. Đồng thời, xác định được tỷ lệ chimerism của các BN sau ghép tại nhiều thời điểm khác nhau. Ngoài ra, kết quả chimerism tương đồng với kết quả xác định giới tính bằng kỹ thuật FISH trong trường hợp
người cho‐người nhận khác giới tính.
Kết luận: Xây dựng thành công quy trình xác định chimerism bằng kỹ thuật multiplex PCR STR, giúp
theo dõi việc mọc mảnh ghép trên BN dị ghép TBGTM tại Bệnh viện truyền máu huyết học.
Từ khóa: bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT), short tandem repeat (STR), chimerism, tế bào gốc tạo máu
(TBGTM).
ABSTRACT
DETECTION OF CHIMERISM IN ALLOGENEIC HEMATOPOIETIC STEM CELL
TRANSPLANTATION USING MULTIPLEX STR‐PCR
Cao Sy Luan, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 169 ‐ 174
Purpose: To detect chimerism in acute myeloid leukemia (AML) patients after allogeneic hematopoietic
stem cell transplantation (HSCT).
Material and Methods: Twenty bone marrow or peripheral blood samples of AML patients and donors
were collected. Using a commercial multiplex PCR amplification of fluorescent labeled short tandem repeat (STR) markers to detect informative STRs and analyze chimerism after allogeneic HSTC.
Result: Among 18 STRs, we found 4 informative STRs in CMR‐04, 5 informative STRs in CMR‐01
and CMR‐02, 6 informative STRs in CMR‐03. Simultaneously, patient/donor cell chimerism was detected
at several times during the post‐transplant period. Moreover, the result of chimerrism analysis by STR‐ PCR‐based is similar to result of FISH‐based in cases sex‐mismatched transplantation.
Conclusion: We successfully established the procedure of chimerism analysis by using multiplex STR‐
PCR to help monitoring engraftment in patient after allogeneic HSTC in Blood Transfusion and Hematology hospital
Key words: acute myeloid leukemia (AML), short tandem repeat (STR), chimerism, hematopoietic stem
cell transplantation (HSCT).
* Bệnh viện Truyền máu‐Huyết học TP.HCM ** Đại học Y Dược TP.HCM.
Tác giả liên lạc: TS.BS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932728115 Email: phanthixinh@yahoo.com
Trang 3Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013
Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học
170
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong điều trị các bệnh lý ác tính về máu thì
dị ghép tế bào gốc tạo máu (TBGTM) là một
trong những phương pháp hiệu quả và ưu tiên
được lựa chọn cho bệnh nhân (BN), đặc biệt đối
với BN thuộc nhóm tiên lượng trung bình và
xấu hoặc BN tái phát sau điều trị hóa trị liệu.
Việc xác định tỷ lệ tế bào của người cho trong cơ
thể người nhận hay còn gọi là chimerism để qua
đó đánh giá việc mọc mảnh ghép là thành công
hay thất bại là một trong những bước cần thiết
của dị ghép tủy. Để đánh giá việc mọc mảnh
ghép thì có thể dựa trên cơ sở là sự khác nhau về
giới tính, nhóm máu, HLA hay các dấu ấn phân
tử như Short Tandem Reapeat (STR) và Single
Nucleotide Polymorphism (SNP). Hiện nay, có 3
kỹ thuật di truyền học phân tử để xác định
chimerism là kỹ thuật FISH (yêu cầu phải có sự
khác biệt về giới tính giữa người cho và người
nhận), PCR khuếch đại các đoạn STR và SNP.
Trong đó, kỹ thuật PCR khuếch đại các đoạn
STR để xác định tỷ lệ chimerism được sử dụng
ngày càng phổ biến với ưu điểm là độ nhạy cao,
khả năng ứng dụng rộng và chỉ cần một lượng
mẫu nhỏ để phân tích(8).
STR là những trình tự ngắn DNA trên
nhiễm sắc thể với chiều dài thường từ 2‐6 bp và
có tính lặp lại. Có nhiều loại STR khác nhau:
dinucleotide, trinucleotide, tetranucleotide,
pentanucleotide và hexanucleotide. Có hơn
20.000 tetranucleotide STR được xác định ở
người(2). STR chiếm khoảng 3% trong tổng bộ
gen người(5). Có nhiều kiểu sắp xếp các STR với
nhau, hoặc là lặp lại nhiều STR của cùng một
kiểu hoặc là lặp lại của nhiều kiểu STR khác
nhau. Sự khác nhau về kích thước của các STR
trên mỗi cá nhân khác nhau là do khác nhau về
số đơn vị lặp lại. Do đó, các STR có thể được
xem như là dấu ấn để phân biệt giữa các cá thể
với nhau. Vì vậy, với những ưu điểm là tính đa
hình cao, kích thước nhỏ nên các STR thường
được sử dụng để xác định chimerism bằng kỹ
thuật PCR(6). Có nhiều nhóm nghiên cứu sử
dụng multiplex PCR khuếch đại các STR có gắn
huỳnh quang để xác định nhanh các STR mang thông tin, tức là các STR có sự khác nhau về kích thước giữa người cho và người nhận(9). Hiện nay, PCR khuếch đại các STR có gắn huỳnh quang được xem như là tiêu chuẩn vàng để xác định chimerism sau ghép và kết quả đánh giá việc mọc mảnh ghép rất khả quan(1).
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
20 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của
BN bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) và người cho TBGTM tương ứng được thu thập tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học (BVTMHH) TP. HCM từ tháng 5/2013 đến tháng 7/2013. Trong
đó, có 4 mẫu máu ngoại vi của 4 BN BCCDT trước ghép và 4 mẫu máu của 4 người cho TBGTM tương ứng, 12 mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi của người bệnh sau ghép tại các thời điểm khác nhau. Các cặp ghép này được đặt tên mã nghiên cứu là CMR‐01, CMR‐02, CMR‐03 và CMR‐04.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Mô tả loạt ca, triển khai kỹ thuật mới.
Phương pháp tiến hành
Ly trích DNA từ mẫu tủy xương hoặc máu ngoại vi bằng GenElute blood genomic DNA kit
(Sigma, Mỹ). Sản phẩm DNA sau ly trích được
kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy đo quang phổ ở hai bước sóng 260 nm và 280 nm. Thực hiện phản ứng multiplex PCR với 18 cặp mồi (bảng 1) bằng PowerPlex 18D system kit (Promega, Mỹ). Lượng DNA dùng cho phản ứng multiplex PCR là 10ng và chương trình luân nhiệt gồm 96oC trong 2 phút, 26 chu kỳ của 94oC trong 10 giây và 60oC trong 1 phút, hoàn thành ở
60oC trong 20 phút trên máy GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems, Mỹ).
Bảng 1: Danh sách 18 kiểu dấu ấn STR của kit
PowerPlex 18D system
Loại STR
Màu huỳnh quang
Kích thước sản phẩm PCR
Số kiểu đơn vị lặp lại
Trang 4Loại STR
Màu
huỳnh
quang
Kích thước sản phẩm PCR
Số kiểu đơn vị lặp lại
D21S11 FL 203-259
24, 24.2, 25, 25.2,
26-28, 28.2, 29, 29.2,30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.2,
33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36-38 TH01 FL 152-195 3-9, 9.3, 10-11,13.3
FGA TMR-ET 314-460
14-18, 18.2, 19, 19.2,
20, 20.2, 21, 21.2, 22, 22.2, 23, 23.2, 24, 24.2,
25, 25.2, 26-30, 31.2, 32.2, 33.2, 42.2, 43.2, 44.2, 45.2, 46.2, 48.2, 50.2
Amelogeni
D19S443 CXR-ET 163-215
5.2, 6.2, 8-12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 15, 15.2,
16, 16.2, 17, 17.2, 18, 18.2 Hỗn hợp dung dịch điện di gồm 10μl Hi‐Di,
1μl ILS500 và 1μl sản phẩm PCR được biến tính
ở 960C trong 3 phút và sốc nhiệt ở 00C trong 3
phút trước khi tiến hành điện di mao quản bằng
máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐4
polymer và capillary 36 cm (Applied
Biosystems). Kết quả điện di được phân tích
bằng phần mềm GeneMapper.
Kết quả điện di mẫu DNA của người cho
TBGTM và BN trước ghép sẽ được phân tích để
chọn ra các kiểu dấu ấn STR mang thông tin, có
giá trị theo dõi điều trị sau ghép, còn đối với kết
quả điện di mẫu DNA của BN sau ghép thì sử dụng diện tích vùng đỉnh của các dấu ấn STR này để xác định tỷ lệ chimerism. Mỗi một dấu
ấn STR mang thông tin sẽ được sử dụng để tính một tỷ lệ chimerism tương ứng. Tỷ lệ chimerism của BN sau ghép là trung bình tỷ lệ chimerism từng dấu ấn STR.
Các dấu ấn STR được sử dụng để phân tích chimerism phải thỏa mãn các tiêu chuẩn là phải
có ít nhất một allele khác nhau về kích thước giữa người cho và người nhận, khoảng cách giữa 2 allel tối thiểu là hai đơn vị lặp lại. Đồng thời, chiều cao các đỉnh của các STR khi điện di phải >50 RFU và không vượt quá thang đo RFU(7).
Tỷ lệ chimerism được tính theo công thức sau:
Trong đó: ‐ ∑D: tổng diện tích vùng đỉnh của các dấu ấn STR mang thông tin ở người cho ‐ ∑R: tổng diện tích vùng đỉnh của các dấu
ấn STR mang thông tin ở người nhận
KẾT QUẢ
Với lượng mẫu DNA sử dụng cho phản ứng multiplex PCR là 10ng cho kết quả là chiều cao các đỉnh của người cho và người nhận trước ghép cũng như của người nhận sau ghép đều trong tiêu chuẩn cho phép, thỏa điều kiện là chiều cao tối thiểu >50 RFU và không vượt quá thang đo RFU. Đối với mẫu trước ghép chúng tôi xác định được 4 dấu ấn STR mang thông tin trên cặp người cho‐người nhận có mã số là CMR‐04, 5 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐01 và CMR‐02, 6 dấu ấn STR đối với cặp CMR‐03. Đối với mẫu sau ghép, chúng tôi xác định được tỷ lệ chimerism trên BN BCCDT sau ghép
ở những thời điểm khác nhau (bảng 2). Trong 4 cặp người cho‐người nhận thì cặp CMR‐02 và CMR‐04 là dị ghép TBGTM nửa thuận hợp HLA, còn cặp CMR‐03 và CMR‐01 là dị ghép TBGTM thuận hợp HLA hoàn toàn.
Trang 5Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013
Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học
172
Bảng 2: Kết quả chimerism của BN BCCDT sau
ghép TBGTM
Mã BN
Ngày sau ghép
CMR-02 (%)
CMR-04 (%)
CMR-03 (%)
CMR-01 (%)
Đối với BN CMR‐02 sau ghép 7 ngày, dựa
trên diện tích vùng đỉnh của 5 kiểu dấu ấn STR
mang thông tin chúng tôi tính được tỷ lệ
chimerism của từng kiểu dấu ấn STR và tỷ lệ
chimerism trung bình là 58,45% (bảng 3).
Bảng 3: Kết quả chimerism của BN CMR‐02 sau
ghép 7 ngày
Diện tích peak
CMR (%)
Diện tích peak
CMR (%)
CSF1PO
61.47
D8S1179
55.49
TPOX
59.01
FGA
64.86
Người cho
Người nhận
Người nhận sau ghép
Hình 1: Kết quả diện di một số dấu ấn STR của người cho, người nhận trước và sau ghép ngày 7 trên BN
CMR‐02
Trang 7Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013
Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học
172
Trong hình 1 là kết quả của 5 trên 18 dấu ấn
STR của người cho, người nhận trước và sau
ghép ngày 7 trên BN CMR‐02. Chúng ta có thể
thấy trong 5 dấu ấn STR (D3S1358, TH01,
D21S11, D18S51 và Penta E) thì chỉ có Penta E là
dấu ấn mang thông tin và đủ tiêu chuẩn để sử
dụng cho mục đích phân tích chimerism. Kết
quả cũng cho thấy ở người bệnh sau ghép ngày
7 thì vừa xuất hiện những đỉnh đặc trưng của
người cho và người nhận.
BÀN LUẬN
Lượng DNA sử dụng cho phản ứng
multiplex PCR là 10 ng, với kết quả chiều cao các
đỉnh thu được của người cho, người nhận trước
và sau ghép đều đạt tiêu chuẩn. Kết quả này
chứng tỏ 10 ng là lượng DNA phù hợp để thực
hiện phản ứng multiplex PCR STR cho mục đích
xác định tỷ lệ chimerism trên BN dị ghép
TBGTM.
Kết quả chimerism trong bảng 2 cho thấy tỷ
lệ tế bào của người cho trong cơ thể người nhận
tăng dần theo thời gian đối với trường hợp dị
ghép TBGTM nửa thuận hợp HLA. Chẳng hạn,
đối với CMR‐02 sau ghép 7 ngày thì tỷ lệ
chimerism là 58,45%, tới ngày 14 thì tỷ lệ này là
95,5% và đến ngày 21 thì đạt 100%. Trong khi
đó, đối với trường hợp dị ghép TBGTM thuận
hợp HLA hoàn toàn thì tỷ lệ này là gần 100% ở
các thời điểm khác nhau sau ghép. Theo nghiên
cứu của Dodero A và cộng sự thì tỷ lệ chimerism
trong máu ngoại vi sau ghép 30 ngày trên hầu
hết BN (92%) đạt >95%(3). Tương tự, trong một
nghiên cứu khác của Doney KC và cộng sự khi
đánh giá chimerism tại ngày 28 sau ghép thì
45/47 BN có tỷ lệ chimerism trong tủy là > 90%(4).
Do đó, Từ các kết quả chimerism sau ghép trên 4
BN có thể đưa ra nhận định là bước đầu mảnh
ghép đã mọc tốt trong cơ thể BN sau ghép.
Đồng thời, kết quả chimerism dựa trên PCR
các dấu ấn STR và FISH trong bảng 4 cũng cho
thấy có sự tương đồng về tỷ lệ tế bào của người
cho trong cơ thể người nhận sau ghép giữa hai
kỹ thuật. Kết quả ở bảng 4 cho thấy, đối với ca
CMR‐02 sau ghép ngày 14 thì tỷ lệ chimerism
được xác định bởi kỹ thuật multiplex PCR STR
là 95,5% tương ứng với kết quả FISH cũng là 95,5% hay sau ghép ngày 21 thì cả hai kỹ thuật cũng đều cho kết quả là 100%. Tương tự, kết quả chimerism đối với ca CMR‐04 được xác định bằng kỹ thuật multiplex PCR STR và FISH sau ghép ngày 14 lần lượt là 100% và 98% hay sau ghép ngày 21 là 98,1% và 97,5%. Điều này chứng
tỏ việc xác định tỷ lệ chimerism bằng kỹ thuật PCR STR là một kỹ thuật đáng tin cậy để theo dõi tiến triển của việc mọc mảnh ghép trên BN BCCDT sau dị ghép TBGTM. Ngoài ra, trong 4 cặp BN di ghép TBGTM thì chỉ có 2 cặp có thể
sử dụng kỹ thuật FISH để đánh giá việc mọc mảnh ghép, là 2 cặp mà người cho và người nhận có sự khác biệt về giới tính. Trong khi đó,
kỹ thuật multiplex PCR STR thì có thể đánh giá được trên cả 4 cặp BN mà cần không quan tâm người cho và người nhận có cùng giới tính hay không. Điều này cho thấy khả năng ứng dụng rộng của dấu ấn STR và một lần nữa khẳng định giá trị của kỹ thuật multiplex PCR STR trong việc xác định chimerism.
Bảng 4: Kết quả chimerism và FISH của BN BCCDT
sau ghép TBGTM
Mã BN Ngày
sau ghép
CMR-02 CMR-04 CMR(%) FISH(%) CMR(%) FISH(%)
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình xác định chimerism bằng kỹ thuật multiplex PCR STR. Kết quả nghiên cứu giúp xác định tỷ
lệ chimerism trên BN sau ghép. Qua đó, góp phần hỗ trợ đánh giá tiến triển của việc mọc mảnh ghép cũng như dự đoán sự thành công hay khả năng thải ghép trên BN BCCDT dị ghép TBGTM được hiệu quả hơn.
Trang 81 Bader P, Niethammer D, Willasch A, et al (2005). How and
when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell
transplantation. Bone Marrow Transplantation; 35, 107–119.
2 Collins JR, Stephens RM, Gold B, et al (2003). An exhaustive
DNA micro‐satellite map of the human genome using high
performance computing. Genomics; 82, 10‐19.
3 Dodero A, Carniti C, Raganato A, et al (2009). Haploidentical
stem cell transplantation after a reduced‐intensity
conditioning regimen for the treatment of advanced
hematologic malignancies: posttransplantation CD8‐depleted
donor lymphocyte infusions contribute to improve T‐cell
recovery. Blood ; 113, 4771‐4779.
4 Doney KC, Loken MR, Bryant EM, et al (2008). Lack of utility
of chimerism studies obtained two to three months after
myeloablative haematopoietic cell transplantation for acute
lymphocytic leukaemia. Bone Marrow Transplant; 42, 271–
274.
5 Lander ES, Linton LM, Birren B, et al. Initial sequencing and
analysis of the human genome. Nature 2001; 409, 860‐921.
6 Lawler M, Humphries P, McCann SR (2009). Evaluation of
mixed chimerism by in vitro amplification of dinucleotide
repeat sequences using the polymerase chain reaction. Blood;
77,2504–2514.
7 Lion T, Watzinger F, Preuner S, et al (2012). The
EuroChimerism concept for a standardized approach to chimerism analysis after allogeneic stem cell transplantation.
Leukemia; 26, 1821 – 1828.
8 Thiede C, Bornhauser M, Ehninger G (2004). Evaluation of STR informativity for chimerism testing ‐ comparative analysis of 27 STR systems in 203 matched related donor
recipient pairs. Leukemia; 18, 248–254.
9 Thiede C, Florek M, Bornhauser M, et al (1999). Rapid
quantification of mixed chimerism using multiplex amplification of short tandem repeat dấu ấns and
fluorescence detection. Bone Marrow Transplant ; 23, 1055–
1060.
Ngày nhận bài báo: Ngày 30 tháng 7 năm 2013 Ngày phản biện: ngày 09 tháng 9 năm 2013 Ngày bài báo được đăng: 22 tháng 10 năm 2013