Nghiên cứu thực vật học, phân lập các diterpenlacton từ dược liệu xuyên tâm liên góp phần xây dựng chuyên luận dược liệu xuyên tâm liên cho Dược điển Việt Nam, chuẩn hoá dược liệu và các chế phẩm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA XUYÊN TÂM TÂM
LIÊN (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)
Nguyễn Ngọc Chương∗∗∗∗, Nguyễn Ngọc Vinh∗∗∗∗∗∗∗∗,Võ Thị Bạch Huệ∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗
TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu thực vật học, phân lập các diterpenlacton từ dược liệu Xuyên tâm liên góp phần xây dựng
chuyên luận dược liệu xuyên tâm liên cho Dược ñiển Việt Nam, chuẩn hoá dược liệu và các chế phẩm
Đối tương và phương pháp nghiên cứu: Dược liệu Xuyên tâm liên do Trung tâm nghiên cứu dược liệu miền
trung cung cấp Mô tả ñặc ñiểm hình thái thực vật, ñặc ñiểm vi học qua kính hiển vi, xác ñịnh các nhóm họat chất hóa
học bằng các phản ứng hóa học ñặc trưng Chiết xuất và phân lập các diterpenlacton dựa vào ñộ phân cực khác nhau của dung môi Đánh giá ñộ tinh khiết các chất chiết xuất bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng, phổ UV, phổ IR,
HPLC và khối phổ
Kết quả: Đã xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái thực vật, ñặc ñiểm vi học và hóa học của Xuyên tâm liên Phân lập ñược
Andrograrpholid, dehydroandrographolid và chúng ñã ñược ñánh giá mức ñộ tinh khiết
Kết luận: Kết quả nghiên cứu có thể góp phần xây dựng chuyên luận dược liệu Xuyên tâm liên cho Dược ñiển
Việt Nam Các chất phân lập ñược rất cần thiết ñể chuẩn hóa dược liệu này và các chế phẩm có chứa Xuyên tâm liên
Từ khóa: Andrographolid, dehydroandrographolid, Diterpenlacton, Xuyên tâm liên, thực vật học, chiết xuất,
phân lập
ABSTRACT
STUDIES ON MICROSCOPIC CHARACTERISTICS AND CHEMICAL COMPONENTS OF
Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees
Nguyen Ngoc Chuong, Nguyen Ngoc Vinh, Vo Thi Bach Hue
Objective: The phytology research on Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees and isolation diterpenlactons
from this traditional medicinal plant to contribute a special issue of medicinal plant for Vietnamese Pharmacopoeia and to standardize this plant and preparations
Materials and methods: The plants were provided by The Medicinal plant research Center of Midle of Viet Nam
Botanical characteristics were described by observation Microscopic characteristics determined by microscopy method Identify the chemical components by mean of chemical reaction Extraction and isolation diterpenlactons base on polarization of the solvents The purity of isolated substances were evaluated on the basic of chemical reaction, thin layer chromatography, UV spectral, IR spectral, HPLC and MS
Results: Botany characteristics, Microscopic characteristics, chemical components were determined
Androgarpholid and dehydroandrographolid were isolated and evaluated the purity
Conclusion: The results can contribute a special issue of Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees for
Vietnamese Pharmacopoeia The isolated substances are necessary for standardizing of this plant and preparations
Key words: Andrographolid, dehydroandrographolid, Diterpenlacton, Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees,
phytology, extraction, isolation
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Xuyên tâm liên có tên khoa học là Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees, ñã có một thời gian ñược sử
dụng phổ biến, rất nhiều người quan tâm và ñược xem là một vị thuốc không thể thiếu ñược với tủ thuốc gia ñình, trạm y tế và các bệnh viện ở nước ta, là thần dược cho các bệnh kèm theo sốt, các bệnh của gan và mắt [7],[10],[11] Nhiều năm qua ở Việt Nam, Xuyên tâm liên dần dần ñã bị lãng quên, trong khi ñó các nhà khoa học và nhiều hãng dược phẩm nước ngoài ñã chứng minh giá trị của dược liệu này bằng nhiều kết quả nghiên cứu và ñã có nhiều ứng dụng thực tế trên lâm sàng, cho thấy nó có các tác dụng kháng viêm, thải ñộc, nâng cao sức ñề kháng, kháng vi khuẩn
và virus [3],[4],[6],[8] Hiện nay, nước ta ñang có nhiều nơi phát triển vùng trông Xuyên tâm liên, tạo ñiều kiện khôi phục lại sản xuất và sử dụng dược liệu quý này Mặt khác Dược ñiển Việt nam cũng chưa có chuyên luận về dược liệu này Vì vậy việc xác ñịnh ñặc ñiểm vi học và thành phần hóa học của xuyên tâm liên là cần thiết giúp cho việc tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu và các chế phẩm có chứa Xuyên tâm liên
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Địa chỉ liên hệ: ThS Nguyễn Ngọc Chương ĐT: 0913640750 Email: ngngchuong@yahoo.fr
Trang 2Cây Xuyên tâm liên do Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền trung cung cấp Chuẩn làm việc andrographolid và dehydroandrographolid do Viện công nghệ hóa học cung cấp, ñã xác ñịnh cấu trúc
Dung môi, hóa chất, thuốc thử
Chloroform, methanol (Trung Quốc, Merck), acetonitril (Merck), H3PO4, nước cất 2 lần
acid 3,5-dinitrobenzoic, kali hydroxid, acid sulfuric, vanillin, acid acetic băng, than hoạt tính
Thuốc thử Vanillin sulfuric, Thuốc thử Kedde
Máy móc – dụng cụ
Bản mỏng silicagel F 254, bể nước ñun cách thủy, bể siêu âm Ultrasonic Branson 3510, cân phân tích Metler Toledo AB-204, máy cô quay Buchi, kính hiển vi quang học Olympus, tủ sấy Shellab 1330 FX, cân phân tích Mettler Toledo AB265-S, các loại dụng cụ thủy tinh chính xác, lò nung Heraeus D6450, máy ño ñiểm chảy Stuart smp3, máy
ño phổ hồng ngoại FTIR NICOLET MAGNA 760, máy HPLC LC-20AD (SHIMADZU), ñầu dò PDA SPD-M20AD, máy sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ AGILENT 1100 LC-MSD
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Khảo sát về thực vật học: ñặc ñiểm hình thái, vi phẫu, soi bột, hóa thực vật
Bằng cảm quan mô tả ñặc ñiểm thực vật học dựa trên quan sát cây tươi Cắt ngang vi phẫu thân, lá nhuộm vi phẫu bằng phương pháp nhuộm kép (dùng ñỏ carmin và lục iod) quan sát bằng kính hiển vi và mô tả Nhận xét cảm quan bột dược liệu và quan sát dưới kính hiển vi các ñặc ñiểm của lông che chở, mạch dẫn, sợi, tế bào mô cứng, hạt tinh bột, tinh thể của dược liệu Xác ñịnh mẫu thực vật bằng các khảo sát hóa học dựa trên nguyên tắc chiết 50 g dược liệu bằng ethanol thu ñược 50 ml dịch chiết, thực hiện phản ứng hóa học với các thuốc thử chuyên biệt nhằm xác ñịnh các nhóm hoạt chất diterpenlacton, flavonoid
Chiết xuất diterpen lacton toàn phần từ xuyên tâm liên
Nguyên liệu là phần trên mặt ñất của cây Xuyên tâm liên ñược xay nhỏ, ngấm kiệt với dung môi ethanol Loại tạp bằng than hoạt tính Cô dịch chiết ñể thu ñược cao lỏng dược liệu chứa diterpen lacton toàn phần
Phân lập andrographolid, dehydroandrographolid
Tiến hành tách andrographolid từ cao lỏng bằng phương pháp kết tinh trong ethanol và tái kết tinh nhiều lần trong MeOH
Dehydroandrographolid có tỉ lệ thấp hơn, ñược tách qua sắc ký cột bằng cách thay ñổi ñộ phân cực của dung môi
ly giải Sau ñó chúng cũng ñược tái kết tinh nhiều lần qua methanol
Tiến hành khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký trên sắc ký bản mỏng ñối với chất chuẩn và chất cần khảo sát Trước tiên là chọn hệ bắt ñầu chạy cột là hệ ñẩy ñược các tạp chất phía trên chất cần tách ñến vị trí có Rf > 0,2 và chất cần tách không di chuyển Tiếp theo là hệ ñẩy ñược chất cần tách ñến vị trí có Rf > 0,2 và các tạp chất phía dưới chất cần tách không di chuyển
Khảo sát chất ñã chiết tách dùng làm chất chuẩn
Khảo sát chất ñã chiết tách so với chất chuẩn andrographolid và Dehydroandrographolid chuẩn theo các chỉ tiêu sau: cảm quan, phản ứng hóa học, ñiểm nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phổ tử ngoại UV, phổ hồng ngoại IR, HPLC, phổ MS
KẾT QUẢ
Khảo sát thực vật học về ñặc ñiểm hình thái, vi phẫu, soi bột của Xuyên tâm liên
Thân: cỏ ñứng, cao 0,5-1 m, phân nhánh nhiều Thân vuông, nhẵn; ở thân già mấu lá thường phình to Lá: ñơn,
nguyên, mọc ñối chéo chữ thập Phiến lá thuôn dài hình mũi mác có ñáy hẹp hoặc hình xoan thon hẹp do men dần xuống cuống, ñỉnh nhọn, dài 4-8 cm, rộng 1,5-2,5 cm, nhẵn Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, có 4-5 cặp gân phụ Cuống lá rất ngắn, khoảng 1-2 mm không có lá kèm Cụm hoa: là chùm kép ở nách lá hoặc ở ngọn cành Nhánh
mang hoa còn non cong lên ở ñỉnh Hoa: nhỏ, dài khoảng 1,2-1,3 cm, màu trắng, ñiểm những ñốm hồng tím, không
ñều, lưỡng tính, mẫu 5, cuống hoa dài khoảng 4-6 mm Lá bắc: dài khoảng 2 mm, dạng dải hẹp, lá bắc con dạng sợi màu xanh nhỏ hơn lá bắc Lá ñài: 5, rời, ñều, dài khoảng 3 mm, dạng tam giác hẹp màu xanh, có lông thưa trắng Cánh hoa: hợp thành ống hình trụ dài 6 mm, có lông, phần trên loe ra và chia thành 2 môi 2/3 rõ, môi trên có thùy cạn,
Trang 3Vi phẫu Thân: Mặt cắt ngang vi phẫu có hình vuông, 4 góc lồi Tế bào biểu bì khá ñều, một số tế bào phình to mang
bào thạch xù xì, không cuống Lông che chở ña bào từ 3-5 tế bào và lông tiết ñầu ña bào, chân ngắn Mô dày góc nhiều ở 4 góc, ít hơn ở cạnh vi phẫu, những ñoạn không có mô dày thường gặp các lỗ khí hơn Mô mềm vỏ ñạo, 3-8 lớp tế bào hình tròn, vách mỏng Nội bì ñai Caspary, trụ bì gồm từ 2-3 lớp tế bào nhỏ hơn nội bì, hóa mô cứng rải rác
Hệ thống dẫn tạo thành vòng liên tục, libe ở ngoài, gỗ ở trong Libe 1 bị ép dẹp vào sát trụ bì Gỗ 1 tập trung nhiều ở 4 góc và 2 cạnh, 2 cạnh còn lại ít thấy gỗ 1 Mô mềm tủy khuyết, tế bào lớn, vách cellulose hoặc hóa gỗ ít Mô mềm tủy
và vỏ rải rác có tinh thể calci oxalat hình khối
Vi phẫu Gân giữa lá: Biểu bì trên lồi thành 2-3 thùy rõ, biểu bì dưới lồi thành 2 thùy nhọn hướng về hai phía, ñáy
phẳng Tế bào biểu bì kích thước lớn, hình chữ nhật hoặc ña giác, mang lông che chở ña bào và lông tiết ña bào chân ngắn, cutin mỏng Dưới biểu bì có từ 2-8 lớp mô dày góc Mô mềm gồm các tế bào gần tròn, kích thước không ñều, vách mỏng Cung libe gỗ gần như liên tục, gỗ ở trên và libe ở dưới
Vi phẫu Thịt lá: Biểu bì tương tự như gân giữa, mô mềm giậu chỉ có 1 lớp tế bào ngắn, dưới mỗi tế bào biểu bì có
2-3 tế bào mô giậu Mô mềm có chứa các khuyết to
Đặc ñiểm bột dược liệu: Bột thân lá màu lục xám, không mùi, vị rất ñắng Thành phần gồm: mảnh biểu bì mang lỗ
khí, bào thạch không cuống có bề mặt sần sùi hoặc u lồi; mảnh mô mềm; các mảnh mạch xoắn, mạch mạng, mạch vạch
Khảo sát hóa học nhóm hoạt chất
Bảng 1 Kết quả khảo sát hóa học nhóm hoạt chất
H ợ p ch ấ t Thu ố c th ử K ế t qu ả ph ả n
ứ ng hóa h ọ c
Diterpenlacton TT Kedde +++
Flavonoid Mg/HCl ññ +++
Quy trình chiết chiết xuất và phân lập
Từ 6 kg Xuyên tâm liên phơi khô, loại bỏ rễ thu ñược 1,6 kg dược liệu, sau ñó xay nhỏ thành bột Làm ẩm bột rồi cho vào bình ngấm kiệt dung tích 5 lít, ngâm 24 giờ với 3 lít Ethanol Tiến hành rút dịch chiết với tốc ñộ 10 ml/phút,
bổ sung dung môi ñến khi thu ñược 5 lít dịch chiết ethanol màu xanh ñậm (tỉ lệ 1 dược liệu: 3 dung môi) Loại tạp chất bằng 250 g than hoạt, lọc qua phễu Buchner ñể loại than Cô thu hồi 5 lít dịch chiết trên máy cô quay, thu ñược khoảng 500 ml dung dịch Để kết tinh lạnh, lọc qua phễu Buchner thu ñược khoảng 200 g hỗn hợp các chất và dịch lọc 1 Hòa tan hỗn hợp các chất này trong Methanol nóng vừa ñủ, loại tạp bằng than hoạt, kết tinh lạnh lọc qua phễu Buchner thu ñược khỏang 450 mg chất A1 và dịch lọc 2 Gom dịch lọc 1 và 2 cô còn 50 g [1],[2],[3], [9]
Trang 4Mảnh mạch xoắn Mảnh mạch mạng Mảnh mô mềm
Mô dày
Gỗ Libe
Mô mềm vỏ Biểu bì
Toàn vi phẫu thân
Biểu bì trên
Biểu bì dưới
Mô mềm khuyết
Mô mềm giậu
Lỗ khí
Biểu bì
Mô dày
Mô mềm vỏ
Gỗ 2
Libe 2
Gỗ 1 Libe 1
Nội bì ñai Caspary
Lông che chở ña bào
Hình 1 Đặc ñiểm bột dược liệu xuyên tâm liên
Trang 5(1) (2)
Sơ ñồ 1 Quy trình chiết xuất và phân lập andrographolid (1) và dehydroandrographolid (2)
Chất A1 tiếp tục rửa kết tinh và tái kết tinh trong MeOH ñể thu ñược tinh thể hình phiến màu trắng, ñạt ñộ tinh khiết cao
Để phân lập dehydroandrographolid, chọn quy trình sử dụng sắc ký cột cổ ñiển Nghiền mịn 50 g cao D1, áp dụng phương pháp nhồi nhồi cột khô Lượng silicagel gấp khoảng 50 lần lượng mẫu
Khảo sát dung môi cho sắc ký cột: Do dehydroandrographolid là chất kém phân cực nên khi triển khai trên bản mỏng silica gel F 254 với các hệ dung môi có ñộ phân cực tăng dần thì vết dehydroandrographolid có khuynh hướng
di chuyển xa hơn các chất khác Vì vậy ñể phân lập dehydroandrographolid cần phải sử dụng hỗn hợp dung môi có ñộ phân cực tăng dần từ CHCl3 ñến CHCl3 – MeOH (99:2)
CHIẾT TÁCH
Hình 3 SKLM dịch chiết thu ñược từ SK cột
CHCl3:MeOH (99:1)
Trang 6Cảm quan
A có tinh thể hình phiến, không màu, không mùi, vị rất ñắng, tan trong MeOH, EtOH, ít tan trong CHCl3 và
CH2Cl2, rất ít tan trong nước
Dcó tinh thể hình kim, màu trắng, không mùi, vị ñắng, tan trong MeOH, EtOH, CHCl3 và CH2Cl2, rất ít tan trong nước
Nhận xét: Tính chất của A, D, phù hợp với tài liệu [5]
Phản ứng hóa học
Phản ứng tạo màu với thuốc thử Kedde, cho màu hồng tím ñặc trưng của vòng lacton 5 cạnh Cho vào ống nghiệm khoảng 1 mg tinh thể, thêm 1 ml MeOH vào hòa tan, nhỏ thêm 250 µl thuốc thử Kedde A và 250 µl thuốc thử Kedde B, lắc ñều
Nhận xét: A, D có phản ứng của vòng lacton 5 cạnh
Sắc ký lớp mỏng
- Thuốc thử, dụng cụ
Bản mỏng Silicagel 60 F 254
Dung môi khai triển: chloroform – ethyl acetate -methanol (4:3:0,4)
Đèn UV 254 nm và dung dịch VS
- Tiến hành
Mẫu thử: cân khoảng 1mg tinh thể A và 1mg tinh thể D hòa tan trong 10ml MeOH, dùng dung dịch này ñể chấm sắc ký
Mẫu chuẩn: Cân khoảng 1mg chất chuẩn andrographolid và 1mg Dehydroandrographolid hòa tan trong 10ml MeOH
Phát hiện: soi UV 254 nm, phun thuốc thử VS Sau khi phun, sấy bản mỏng ở 1050C trong vài phút ñể hiện màu Kết quả: quan sát và mô tả sắc ký ñồ, dung dịch mẫu thử phải cho vết có màu sắc và vị trí Rf tương ứng với vết của dung dịch ñối chiếu
Hình 4 Sắc ký lớp mỏng của chất A và D so với chuẩn AD, DH
Ghi chú: A và D là chất ñã chiết tách từ Xuyên tâm liên CA, DC lần lượt là chuẩn andrographolid và Dehydroandrographolid
Trang 7Phát hiện ở bước sóng hấp thu cực ñại của andrographolid 225 nm và dehydroandrographolid 250 nm
Kết quả: Sắc ký ñồ của chất A có một pic có tR = 5,853 phút chiếm hàm lượng 100% so với tổng diện tích pic trên sắc ký ñồ Đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 225 nm, ñộ tinh khiết của pic ñạt 100% Sắc ký ñồ của chất D có một pic có
tR = 16,787 phút chiếm hàm lượng 100% so với tổng diện tích pic trên sắc ký ñồ Đỉnh hấp thu UV ở bước sóng 250
nm, ñộ tinh khiết của pic ñạt 99,91%
Hình 5 Sắc ký ñồ của hỗn hợp A và D
Hình 6 Sắc ký ñồ chất A và D tại nhiều bước sóng
Hình 7 Sắc ký ñồ trong không gian 3 chiều của hỗn hợp A và D
Thực hiện các thử nghiệm song song và cùng ñiều kiện với chất chuẩn ñối chiếu cho thấy các thông số thời gian lưu trên so sánh trên HPLC không thấy có sự khác biệt giữa chất A, chất D ñã chiết tách so với chuẩn làm việc andrographolid, dehydroandrographolid Trên phổ 3D chất A và chất D thể hiện ñộ tinh khiết pic là 100%
Điểm chảy
Điểm nóng chảy của chất A và D phù hợp với tài liệu, chứng tỏ A và D là 2 chất tinh khiết
Trang 8Bảng 2 Kết quả ño ñiểm nóng chảy của A, D-
A Andrographolid [3],[8],[9]
Điểm nóng
chảy (0C)
228 226-230
D Dehydroandrographolid
[3],[8],[9]
Điểm nóng
chảy (0C)
204 203-204
Phổ IR
Phồ IR của chất A và D có các ñỉnh hấp thu C=O (1727.5 và 1738), và C=C (1674 và 1637) phù hợp với tài liệu công bố về andrographolid, dehydroandrographolid
Phổ UV
Không có sự khác biệt về phổ UV của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu thử thêm chuẩn
Hình 8 Phổ UV của chất A và andrographolid chuẩn
Hỉnh 7 Phổ UV của chất D và dehydroandrographolid chuẩn
MS của chất chiết tách
Điều kiện triển khai HPLC-MS:
Pha ñộng: ACN-CHCOONH (40 : 60)
Trang 9KẾT LUẬN
Đã khảo sát hình thái thực vật, ñặc ñiểm vi học, ñặc ñiểm bột dược liệu Xuyên tâm liên, có thể góp phần hữu ích cho việc xây dựng chuyên luận dược liệu Xuyên tâm liên cho Dược ñiển Việt Nam
Chiết xuất và phân lập ñược 2 chất ñối chiếu tinh khiết Andrographolid và Dehydroandrographolid dùng ñể chuẩn hóa dược liệu và các chế phẩm có Xuyên tâm liên
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Akowuah G.A., Zhari I., Norhayati I., Mariam A (2006), "HPLC and HPTLC densitometric determination of
andrographolides and antioxidant potential of Andrographis paniculata", Journal of Food Composition and
Analysis, 19, pp.118-126
2 Akowuah G.A , Zhari I., Norhayati I., Mariam A (2006) , “HPLC and HPTLC densitometric determination
of andrographolides and antioxidant potential of Andrographis paniculata”, Journal of Food Composition
and Analysis, 19, pp.118–126
3 Alpana Srivastava, Himanshu Misra, Ram K Verma, Madan M Gupta (2004), "Chemical Fingerprinting of
Andrographis paniculata using HPLC, HPTLC and Densitometry", Phytochem Anal., 15, pp.280-285
4 Chaman Patarapanich, Suwana Laungcholatan, Nuntakan Mahaverawat, Chaiyo Chaichantipayuth and Sunibhond Pummangura (2007), "HPLC determination of active diterpene lactones from Andrographis
paniculata Nees planted in various season and regions in Thailand", Thia J Pharm Sci., 31, pp.91-99
5 Koteswara Rao Y., Vimalamma G., Venkata Rao, Yew-Min Tzeng C., (2004), “Flavonoids and
andrographolides from Andrographis paniculata”, Phytochemistry, pp 65, 2317–2321
6 Prajapati/Purohit/Sharma/Kumar, (2003), “Handbook of Medicinal plants”, 45, pp 123
7 Pharmacopoeia of Republic of China (2005), pp.121-122
8 Siddartha K Mishar, Neelam S Sangwan and Rajender S Sangwan.(2007), Pharmacognosy review
Andragraphid paniculata, 1, pp 20-26
9 Trần Công Luận,Nguyễn Trọng Bằng (2008), “Nghiên cứu quy trình ñịnh lượng diterpenlacton trong cây
Xuyên tâm liên”, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ ñại học Tp HCM
10 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và ñộng vật làm thuốc ở Việt Nam, 3, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật,
Hà Nội, tr.1138-1143
11 Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt nam, NXB Giáo dục, tr.81-83