Bài viết “Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất và xác định hàm lượng các ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” được thực hiện với mục đích xây dựng một quy trình chiết xuất và kiểm nghiệm để kiểm soát hàm lượng hoạt chất trong các chế phẩm sâm.
Trang 1TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
(Panax quinquefolius L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA
Nguyễn Thanh Tuyền * , Vũ Hải Đăng * , Ngô Kiến Đức *
TÓM TẮT
Mở đầu: Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) là một dược liệu quý thuộc chi Panax, có tác dụng tốt
trên nhiều hệ cơ quan khác nhau như hệ thần kinh, tim mạch, miễn dịch,… Các sản phẩm từ sâm và cao chiết sâm rất phong phú và đa dạng, tuy nhiên chất lượng của các sản phẩm này còn chưa được đảm bảo
Do đó, đề tài “Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất và xác định hàm lượng các ginsenosid Re, Rg 1 và Rb 1 trong sâm Hoa Kỳ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA” được thực hiện với mục đích xây dựng một quy trình chiết xuất và kiểm nghiệm để kiểm soát hàm lượng hoạt chất trong các chế phẩm sâm
Mục tiêu: Khảo sát tìm điều kiện chiết xuất tối ưu các ginsenosid trong sâm Hoa Kỳ Xây dựng và
thẩm định quy trình định lượng đồng thời các ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA
Đối tượng nghiên cứu: Re, Rg 1 và Rb 1 trong sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.)
Phương pháp nghiên cứu: tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid bằng mô hình Box-Behnken Xây
dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời ba ginsenosid Re, Rg 1 và Rb 1 theo hướng dẫn của ICH
2005
Kết quả: Quy trình định lượng đồng thời ba ginsenosid Re, Rg 1 và Rb 1 đã được xây dựng và thẩm định và đạt các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác cao Xác định được ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết lên hiệu suất chiết ginsenosid Điều kiện chiết xuất tối ưu các ginsenosid là ethanol 69,4%, tỉ lệ dung môi/dược liệu 51,4 ml/ 1 g với thời gian chiết 6,1 giờ
Kết luận: Quy trình chiết xuất ginsenosid với các thông số tối ưu và quy trình định lượng đồng thời
ba ginsenosid trong sâm Hoa Kỳ có thể được ứng dụng trong kiểm nghiệm nhằm đảm bảo chất lượng các sản phẩm có chứa sâm
Từ khóa: ginsenosid, sâm Hoa Kỳ, mô hình Box-Behnken, Panax quinquefolius L
ABSTRACT
OPTIMIZATION OF EXTRACTION AND DETERMINATION OF GINSENOSIDE RE, RG 1 AND
RB 1 IN AMERICAN GINSENG (Panax quinquefolius L.)
BY HPLC WITH PDA DETECTOR
Nguyen Thanh Tuyen, Vu Hai Dang, Ngo Kien Duc
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 108-115
Background - Objectives: American ginseng (Panax quinquefolius L.) is a precious medicinal plant
in Panax genus, which has various benefits on nervous, circulatory, and immune system,… There are many products from ginseng and ginseng extracts, however, the quality of these products is not consistent
* Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2Therefore, the aim of this study was to optimize condition of extraction and develop a HPLC method for assay of Re, Rg 1 and Rb 1 to ensure quality and consistency of ginseng products
Method: Extraction conditions of ginsenosides was optimized using Box – Behnken design A HPLC –
PDA method for assay of Re, Rg 1 and Rb 1 was developed and validated according ICH 2005 guidelines
Results: The HPLC - PDA method for determination of ginsenoside Re, Rg 1 and Rb 1 was developed and validated The method requirement of system suitability, specificity, linearity, high accuracy and precision The effects of ethanol concentration, solvent/sample ratio and extraction time on extraction yield
of ginsenosides was evaluated The optimized condition for ginsenosides extraction was 69.4% ethanol, a ratio of 51.4 ml solvent to 1 g sample and an extraction time of 6.1 hours
Conclusion: The extraction process with optimized parameters and the method for
simultaneous determination of three ginsenosides in American ginseng can be applied for quality control of ginseng products
Keywords: ginsenosides, American ginseng, Box-Behnken design, Panax quinquefolius L
ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.), còn
gọi là sâm Wisconsin là một loại dược liệu
quý thuộc chi Sâm (Panax) Sâm Hoa Kỳ
khác biệt với sâm Hàn Quốc về tỉ lệ các loại
ginsenosid và do đó có những tác dụng sinh
học tương đối khác nhau Theo một số các
nghiên cứu(6), sâm Hoa Kỳ có tác dụng trên
nhiều hệ cơ quan khác nhau như hệ thần
kinh, tim mạch, hô hấp, tiêu hóa, miễn dịch,
có tác dụng tốt đối với các bệnh tiểu đường,
ung thư Ở Việt Nam trong những năm gần
đây, sâm Hoa Kỳ ngày càng được nhiều
người biết đến và sử dụng Các sản phẩm
từ sâm và cao chiết sâm ngày càng phong
phú và đa dạng, tuy nhiên chất lượng của
nhiều sản phẩm này vẫn chưa được kiểm
soát Để kiểm tra chất lượng của các chế
phẩm sâm, người ta thường xác định hàm
lượng hoạt chất ginsenosid trong sâm bằng
kỹ thuật HPLC(7) Đề tài được thực hiện dựa
trên nhu cầu thực tế là cần kiểm soát hàm
lượng ginsenosid trong các sản phẩm từ sâm
để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các
sản phẩm
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Re, Rg1 và Rb1 trong sâm Hoa Kỳ (Panax
quinquefolius L.)
Mẫu nghiên cứu
Sâm Wisconsin (Panax quinquefolius L.)
nhập khẩu bởi công ty CPĐT Thảo Dược Xanh
Chất đối chiếu, hóa chất và dung môi
Chất đối chiếu ginsenosid Re, hàm lượng 94,28% tính trên nguyên trạng, số lô: GRe-001-0913; ginsenosid Rg1, hàm lượng 96,43% tính trên nguyên trạng, số lô: GRg1.Ref.012011; ginsenosid Rb1, hàm lượng 99,17% tính trên nguyên trạng, số lô: GRb1.Ref.012011 do Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh cung cấp
Dung môi dùng cho nghiên cứu bao gồm: ethanol 96% (Việt Nam), acetonitril và methanol (J.T.Baker, Mỹ)
Trang thiết bị
Cân phân tích Mettler Toledo XP26 (Mỹ); Cột sắc ký SunfireTM C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) (Mỹ);
Hệ thống HPLC/PDA HP Series 1050 (Mỹ)
Lựa chọn điều kiện phân tích
Theo các nghiên cứu đã được công bố,
để phân tích ginsenosid thì cột sắc ký thường sử dụng là cột pha đảo C18 với kích thước 150 - 250 x 4,6 mm, 3 - 5 μm; hệ dung môi là H2O – acetonitril; kiểu rửa giải gradient; bước sóng phát hiện là 203 nm Đa số các phương pháp HPLC trong Dược điển Mỹ(5)
và các nghiên cứu(1,5) đều có thời gian phân tích rất dài với chương trình gradient từ 60
Trang 3phút trở lên, gây tốn kém thời gian, dung môi,
không thích hợp cho việc khảo sát và tối ưu
hóa điều kiện chiết xuất Do đó, đề tài lựa
chọn phương pháp của công ty Dionex (Mỹ)
với thời gian phân tích tương đối ngắn là 25
phút, sau đó tiến hành khảo sát lại và điều
chỉnh các thông số sắc ký cho phù hợp với
điều kiện trang thiết bị ở phòng thí nghiệm
Điều kiện sắc ký được đề nghị như sau:
Cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm)
Pha động: A nước và B acetonitril
Chương trình gradient: 0 – 3 phút pha
động có tỉ lệ 70% A + 30% B, 3 – 8 phút A và B
thay đổi tỉ lệ theo thởi gian để đến 8 phút pha
động có tỉ lệ 60% A + 40% B, 8 – 15 phút A và
B thay đổi tỉ lệ theo thởi gian để đến 15 phút
pha động là 100% B, 15 – 20 phút pha động là
100% B, 20 – 21 phút A và B thay đổi tỉ lệ theo
thởi gian để đến 21 phút pha động có tỉ lệ 70%
A + 30% B, 21 – 27 phút pha động có tỉ lệ 70%
A + 30% B
Bước sóng phát hiện: 203 nm
Nhiệt độ cột: 50oC
Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu 5 µl
Chuẩn bị mẫu
Dung dịch đối chiếu gốc: Cân chính xác
20,167 mg chất đối chiếu Rb1 cho vào bình
định mức 5 ml, thêm khoảng 2 ml methanol,
lắc cho tan hết, thêm methanol đến vạch, lắc
đều, thu được dung dịch đối chiếu gốc Rb1
nồng độ 4000 μg/ml Tiến hành tương tự chất
đối chiếu Re và chất đối chiếu Rg1 sẽ thu được
các dung dịch đối chiếu gốc Re nồng độ 1600
μg/ml và Rg1 nồng độ 800 μg/ml
Dung dịch đối chiếu hỗn hợp: Hút chính xác
lần lượt 1,25 ml; 1,25 ml và 0,625 ml các dung
dịch đối chiếu gốc Rb1, Re và Rg1, cho vào bình
định mức 5 ml, thêm methanol đến vạch, lắc
đều, thu được dung dịch đối chiếu hỗn hợp Rb1,
Re và Rg1 có nồng độ lần lượt là 1000 μg/ml, 400 μg/ml và 100 μg/ml Dung dịch đối chiếu hỗn hợp được lọc qua màng lọc 0,45 μm trước khi tiến hành sắc ký
Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất
Chiết hồi lưu 1 g bột sâm Hoa Kỳ với các điều kiện thay đổi về nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết Thí nghiệm tối
ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid được thiết kế theo mô hình Box-Behnken(2) 3 yếu tố với
15 thí nghiệm Các dịch chiết của từng thí nghiệm được xác định hàm lượng ginsenosid chiết được bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA Kết quả của 15 thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm MODDE 5.0 để xác định mối tương quan giữa các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu, thời gian chiết với hiệu suất chiết ginsenosid; xây dựng phương trình bề mặt đáp ứng và dự đoán điều kiện cho hiệu suất tối ưu
Thẩm định quy trình phân tích
Quy trình định lượng các ginsenosid Re, Rg1
và Rb1 được thẩm định theo hướng dẫn của ICH (2005)(3) về các yếu tố: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đúng và độ chính xác
KẾT QUẢ Tối ưu hóa hiệu suất chiết ginsenosid
Thiết lập mô hình tối ưu hóa
Thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid được thiết kế theo mô hình Box-Behnken 3 yếu tố với 15 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần Khoảng khảo sát tối
ưu của các yếu tố nồng độ ethanol (50-96%), tỉ lệ dung môi/dược liệu (30/1-70/1) và thời gian chiết (4-8 giờ) được lựa chọn dựa trên nghiên cứu của Kim và cộng sự (2007)(4), Dược điển Trung Quốc
2015(1) và Dược điển Mỹ 40(5) Kết quả các thí nghiệm tối ưu hóa được trình bày trong bảng 1
Trang 4Từ các kết quả trong bảng 1, sử dụng
phần mềm MODDE 5.0 để phân tích sự ảnh
hưởng của các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ
dung môi/dược liệu và thời gian chiết lên
hàm lượng ginsenosid chiết được Phương
trình hồi quy của mô hình tìm được là:
= -200,7277 + 3,6787C + 2,4264R + 28,0417T
– 0,0268C2 – 0,0253R2 – 2,3240T2 + 0,0014CR –
0,0050CT + 0,0121RT
Trong đó: là hàm lượng ginsenosid
chiết được (mg/g); C là nồng độ ethanol (%); R
là tỉ lệ dung môi/dược liệu; T là thời gian
chiết (giờ)
Bảng 1: Kết quả các thí nghiệm tối ưu hóa
nghiệm
Nồng
độ ethanol (%)
Tỉ lệ dung môi/dược liệu
Thời gian chiết (giờ)
Hàm lượng ba ginsenosid (mg/g)
Bảng 2: Kết quả phân tích ANOVA của phương trình hồi quy
R 2 = 0,985, R 2 hiệu chỉnh = 0,957
Bảng 3: Kết quả phân tích ANOVA các hệ số trong phương trình hồi quy
Hình 1: Đường biểu diễn dự đoán ảnh hưởng của các yếu tố lên hàm lượng ginsenosid chiết được
Trang 5Kết quả phân tích ANOVA (Bảng 5) cho
thấy mô hình có ý nghĩa thống kê và có sự
tương thích với thực nghiệm: giá trị P mô hình
< 0,05; giá trị P của Lack of fit > 0,05; R2 hiệu
chỉnh = 0,957 ở độ tin cậy 95%
Ảnh hưởng của các yếu tố đối với hiệu suất
chiết ginsenosid
Dựa vào kết quả bảng 3, các giá trị của yếu tố
nồng độ và giá trị bậc hai của cả ba yếu tố nồng
độ, tỉ lệ, thời gian đều thể hiện mức độ ý nghĩa
tin cậy cao (P < 0,05) khi tham gia vào mô hình
Như vậy, các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ dung
môi/dược liệu và thời gian chiết đều có ảnh
hưởng đến hiệu suất chiết ginsenosid (Hình 1)
Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất
Dựa trên phương trình hồi quy của mô hình, sử dụng công cụ tối ưu hóa (Optimizer) của phần mềm MODDE 5.0 cho phép xác định giá trị hàm lượng mong muốn và các giá trị tương ứng của các yếu
tố Kết quả giá trị hàm lượng tối đa tìm được là 74,7 mg/g khi chiết bằng ethanol 69,4% với tỉ lệ 51,4 ml/ 1 g trong 6,1 giờ Điều kiện này tương đương với điều kiện của thí nghiệm trung tâm và giá trị hàm lượng dự đoán được cũng xấp xỉ với giá trị hàm lượng quan sát được từ các thí nghiệm trung tâm
Thẩm định phương pháp
Tính phù hợp hệ thống
Bảng 4: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu đối chiếu hỗn hợp (n=6)
lưu TB
RSD% của thời gian lưu
Diện tích pic TB RSD% của diện
tích pic (S)
Hệ số bất đối (A s )
Số đĩa lý thuyết (N)
Độ phân giải (R s )
Nhận xét: RSD của các thông số sắc ký cho
các lần tiêm lặp lại đều nhỏ hơn 2% Hệ số bất
đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, số đĩa lý
thuyết lớn hơn 2000, độ phân giải lớn hơn
hoặc bằng 1,5 Vậy quy trình phân tích đạt
tính phù hợp hệ thống
Tính đặc hiệu
Tiến hành sắc ký mẫu trắng (methanol),
mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn
Kết quả cho thấy mẫu trắng không xuất hiện
pic tại thời gian lưu của các ginsenosid, sắc ký
đồ mẫu thử có 3 pic có thời gian lưu tương
ứng với thời gian lưu của 3 pic ginsenosid
trong mẫu chuẩn Các pic của ginsenosid tách
hoàn toàn với các pic khác trong sắc ký đồ
Diện tích của các pic ginsenosid trong mẫu
thử thêm chuẩn tăng lên so với các pic tương
ứng trong mẫu thử Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic cho thấy các pic
Re, Rg1 và Rb1 đạt độ tinh khiết pic (hệ số tinh khiết (purity factor) nằm trong ngưỡng giới hạn tính được (calculated threshold limit)) Như vậy, quy trình phân tích có tính đặc hiệu Sắc ký đồ của các mẫu được minh họa ở hình 2, 3, 4 và 5
Tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác
Tính tuyến tính
Tiến hành pha 5 dung dịch đối chiếu hỗn hợp có nồng độ khác nhau trong khoảng 20-150% so với nồng độ trung bình mẫu thử Tiến hành sắc ký từng dung dịch
Độ đúng
Hút 900 μl dung dịch thử cho vào eppendorf
2 ml Thêm một lượng xác định dung dịch chuẩn
Trang 6rồi thêm MeOH vừa đủ 1,5 ml sao cho nồng độ
của mẫu thử pha chuẩn nằm trong khoảng tuyến
tính của 3 ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 ở ba mức
nồng độ 80%, 100% và 120% so với nồng độ trung
bình của mẫu thử Ở mỗi mức nồng độ, tiến hành
định lượng 3 lần
Độ lặp lại
Chuẩn bị 6 mẫu thử, tiến hành sắc ký từng
mẫu trong cùng một ngày
Độ chính xác trung gian
Chuẩn bị mẫu như độ lặp lại, tiến hành sắc ký 3 ngày khác nhau
Kết quả thống kê cho thấy quy trình phân tích
có khoảng tuyến tính từ 80 – 600 μg/ml đối với Re,
từ 20 – 150 μg/ml đối với Rg1 và từ 200 – 1500 μg/ml đối với Rb1 Quy trình có tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng từ 88,3-109,8% Quy trình có độ chính xác với RSD cùng ngày ≤ 1,9% và RSD khác ngày ≤ 3,1%
Hình 2: Sắc ký đồ mẫu trắng
Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn
Hình 4: Sắc ký đồ mẫu thử
Trang 7Hình 5: Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn
Bảng 5: Kết quả khảo sát tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Pha loãng dung dịch đối chiếu thành các
nồng độ thấp dần Tiến hành sắc ký và thiết
lập tỷ số tín hiệu trên nhiễu S/N Nồng độ
mà tại đó có S/N lớn hơn và gần với 3 nhất
là giới hạn phát hiện (LOD) Tương tự, nồng
độ mà tại đó có S/N lớn hơn và gần với 10
nhất là giới hạn định lượng (LOQ) Kết quả
thu được như sau: LOD của Re và Rg1 là 6
ppm, của Rb1 là 4 ppm; LOQ của Re và Rg1
là 16 ppm, của Rb1 là 14 ppm
Các ginsenosid Re, Rg1 và Rb1 trong sâm
Hoa Kỳ (Panax quinquefolius L.) được định
lượng bằng phương pháp HPLC với đầu dò
PDA được thẩm định theo hướng dẫn của
ICH (2005):
- Tính phù hợp hệ thống
- Tính đặc hiệu
- Tính tuyến tính với miền giá trị từ 20 -
150 μg/ml đối với Rg1, từ 80 - 600 μg/ml đối
với Re và từ 200 - 1500 μg/ml đối với Rb1
- Giới hạn phát hiện: 6 ppm đối với Rg1 và
Re, 4 ppm đối với Rb1
- Giới hạn định lượng: 16 ppm đối với Rg1
và Re, 14 ppm đối với Rb1
- Độ đúng với tỷ lệ phục hồi từ 88,3-109,8%
- Độ chính xác với RSD cùng ngày ≤ 1,939% và RSD khác ngày ≤ 3,107%
BÀN LUẬN
Đề tài đã sử dụng phần mềm MODDE 5.0 với mô hình Box-Behnken để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất ginsenosid từ sâm Hoa Kỳ bằng cách khảo sát biến phụ thuộc là hàm lượng ba ginsenosid chiết được với các biến độc lập là nồng độ ethanol, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời gian chiết Các kết quả trên cho thấy nồng độ ethanol có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất chiết ginsenosid, theo đó ethanol 70% cho hiệu suất chiết ginsenosid tăng đáng kể so với ethanol 50% Điều này có thể do ethanol 70% có khả năng hòa tan tốt ginsenosid Khi nồng độ ethanol tăng lên trên 70%, hiệu suất chiết giảm Nguyên nhân là
Trang 8protein trong dược liệu có thể bị đông tụ
trong ethanol nồng độ cao, làm sức cản
khuếch tán tăng lên
Tương tự, tỉ lệ dung môi/dược liệu và thời
gian chiết cũng có ảnh hưởng đáng kể đến
hiệu suất chiết ginsenosid Hiệu suất chiết
tăng dần khi tỉ lệ tăng từ 30:1 lên 50:1, điều
này phù hợp với nguyên lý chuyển khối do
càng tăng lượng dung môi thì gradient nồng
độ giữa khối dược liệu và khối chất lỏng càng
lớn nên khả năng khuếch tán tăng Khi tăng
lượng dung môi lên hơn nữa thì hiệu suất lại
giảm Nguyên nhân cho vấn đề này chưa rõ,
tuy nhiên cũng có nghiên cứu ghi nhận sự
giảm hiệu suất chiết khi tăng lượng dung
môi sử dụng đối với phương pháp chiết siêu
âm Hiệu suất chiết thay đổi theo thời gian
chiết, cụ thể là hiệu suất chiết tăng khi thời
gian chiết tăng từ 4 giờ đến 6 giờ và bắt đầu
giảm dần sau 6 giờ Nguyên nhân là do quá
trình tiếp xúc lâu với nhiệt độ cao có thể làm
biến đổi một số ginsenosid như Rg1, Re,
Rb1,…dẫn đến hàm lượng tính theo các
ginsenosid này bị giảm
Điều kiện chiết xuất tối ưu cho sâm Hoa
Kỳ xác định được từ mô hình Box-Behnken là
chiết bằng ethanol 69,43% với tỉ lệ 51,44: 1
trong 6,10 giờ Kết quả này cũng phù hợp với
nghiên cứu của Kim và cộng sự về các yếu tố
ảnh hưởng đến việc chiết xuất ginsenosid từ
rễ sâm Hàn Quốc
KẾT LUẬN
Quy trình phân tích đã thiết lập có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác, có thể được ứng dụng để kiểm tra chất lượng của các sản phẩm sâm Hoa Kỳ trên thị trường Đề tài đã xác lập được điều kiện tối ưu để chiết xuất hoạt chất ginsenosid trong sâm: sử dụng ethanol 69,4% với tỉ lệ 51,4 ml trên 1 g dược liệu và thời gian chiết là 6,1 giờ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Chinese Pharmacopoeia Commission (2015) Chinese Pharmacopoeia of the People's Republic of China (Vol 1),
pp 131-132
2 Ferreira S, et al (2007) Box-Behnken design: An alternative
for the optimization of analytical methods Analytica
Chimica Acta, 597(2): pp.179-186.
3 International Council on Harmonization (2005) Validation
of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1),
pp 125-154
4 Kim S, et al (2007) Parameters affecting the extraction of ginsenosides from the adventitious roots of ginseng (Panax
ginseng C.A Meyer) Separation and Purification Technology,
56 (3): pp.401-406
5 The United States Pharmacopoeial Convention (2017), USP 40-NF 35, pp 6786-6790
6 Vuksan V, et al (2000) American Ginseng (Panax quinquefolius L) Reduces Postprandial Glycemia in Nondiabetic Subjects and Subjects With Type 2 Diabetes
Mellitus Archives of Internal Medicine, 160(7): pp.1009.
7 Wang Y, et al (2015) Chemical analysis of Panax
quinquefolius (North American ginseng): A review Journal
of Chromatography A, 1426: pp.1-15.