Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập, tinh khiết hóa và xác định cấu trúc hóa học của chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ cao toàn phần thân rễ và rễ ngải bún. Thân rễ và rễ ngải bún thu mua tại thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016.
Trang 1PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC
CỦA HOẠT CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT CÓ TRONG CAO
CHIẾT THÂN RỄ VÀ RỄ NGẢI BÚN (BOESENBERGIA
PANDURATA (ROXB.) SCHLTR ZINGIBERACEAE)
Phạm Bền Chí * , Nguyễn Đinh Nga *
TÓM TẮT
Mở đầu: Boesenbergia pandurata Zingiberaceae là một trong những dược liệu của Việt Nam và được biết
đến với tên Ngải bún Thân rễ và rễ Ngải bún được sử dụng trong dân gian để hỗ trợ điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và nhiễm nấm
Mục tiêu: Phân lập, tinh khiết hóa và xác định cấu trúc hóa học của chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ
cao toàn phần thân rễ và rễ Ngải bún
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Thân rễ và rễ Ngải bún thu mua tại thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh
vào tháng 10/2016 Cao thân rễ và rễ Ngải bún (Cao NB): Bột thân rễ và rễ Ngải bún được ngâm lạnh với cồn 96% trong 24 giờ Sau khi bốc hơi dung môi, cao cồn được lắc phân bố tỉ lệ 1:1 với lần lượt với các dung môi n – hexan, dichloromethan, ethylacetat để thu được các cao phân đoạn (PĐ) Hoạt tính kháng vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn được thực hiện theo phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy và pha loãng trong môi trường rắn Sử dụng sắc ký cột cổ điển với sự hỗ trợ của sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hiện hình sinh học để phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật từ cao NB Kiểm tra độ tinh khiết bằng UPLC và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng vi sinh vật trong cao NB bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Kết quả và bàn luận: Cao NB và các cao phân đoạn cho hoạt tính kháng mạnh trên 3 chủng nấm da
Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum và Trichophyton mentagrophytes (MIC từ 90 – 120 µg/ml); kháng vừa trên S aureus và MRSA (MIC từ 1100 – 1500 µg/ml) Đã phân lập và xác định được hoạt chất kháng vi sinh vật có trong cao NB là pinocembrin Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây
Từ khóa: Thân rễ và rễ Ngải bún, kháng khuẩn, kháng nấm, pinocembrin
ABSTRACT
ISOLATING AND DETERMINING CHEMICAL STRUCTURE
OF ANTI MICROORGANISM SUBSTANCE FROM EXTRACT OF NGAI BUN
RHIZOME AND ROOTS (BOESENBERGIA PANDURATA (ROXB.) SCHLTR ZINGIBERACEAE)
Pham Ben Chi, Nguyen Dinh Nga
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018:469 - 474
Background – Objectives: B pandurata is one of the herbals in Viet Nam and is known as “Ngai bun” Its
rhizome and roots have been traditionally used in treatment infections The aim of the study to isolating, purifying and determining the chemical structure of antimicroorganism agent from the its extract
Material and methods: The rhizome and roots of B pandurata was collected in Tra Cu town, Tra Vinh
province in 10/2016 Its powder was extracted with 96% EtOH for 24 hours This extract was partitioned with n – hexane, DCM and EtOAc The antimicroorganism activity of these extracts were evaluated by applying disk
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2diffusion and agar dilution methods The antimicroorganism agent was isolated, purified by column chromatography in support with layer chromatography (TLC) and autobiography method Its purify was tested by UPLC method Its chemical structure was determined by NMR spectrum
Results: The EtOH, DCM and EtOAc extracts strongly effect against T mentagrophytes, T rubrum and
M gypseum with MIC values from 90 – 120 µg/ml, and have medium active on S aureus and MRSA with MIC values from 1100 – 1500 µg/ml The antimicroorganism agent was determined as pinocembrine
Conclusion: The results demonstrated the strong potential of the extracts of B pandurata for
pharmaceutical development
Keyword: Boesenbergia pandurata, rhizome and roots, antimicrobial, antifungal, pinocembrine
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm khuẫn, nhiễm nấm ảnh hưởng nhiều
đến chất lượng cuộc sống của con người Các
nhà khoa học trên thế giới liên tục tìm kiếm các
hợp chất mới từ các nguyên liệu có nguồn gốc
tổng hợp và tự nhiên để bổ sung nguồn hợp chất
kháng vi sinh vật và đối phó với hiện tượng
kháng thuốc của vi sinh vật Với điều kiện khoa
học kỹ thuật còn hạn chế, việc phát triển nguồn
nguyên liệu hóa dược tại Việt Nam gặp nhiều
thách thức Bên cạnh đó Việt Nam có nguồn tài
nguyên thiên nhiên phong phú với nhiều dược
liệu có tiềm năng nhưng vẫn chưa được khai
thác nhiều Từ lâu, một dược liệu thuộc họ Gừng
– Ngải bún (Boesenbergia pandurata
Zingiberaceae) đã được dân gian sử dụng để làm
gia vị và chữa một số bệnh như chốc lở, kháng
viêm, đầy bụng, giun sán, ung thư < nhưng
chưa được chứng minh bằng những bằng chứng
khoa học tại Việt Nam(2) Chính vì vậy, mục tiêu
của nghiên cứu này là chứng minh hoạt tính
kháng vi sinh vật của thân rễ và rễ Ngải bún
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Thân rễ và rễ Ngải bún được thu mua tại thị
trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016;
được định danh bằng cách khảo sát các đặc điểm
hình thái, giải phẫu thực vật và so sánh với tài
liệu tham khảo(8)
Vi khuẩn thử nghiệm: Staphylococus aureus
ATCC 29213, MRSA ATCC 43300, E Coli ATCC
25922, Pseudomonas aegrunosa ATCC 27853 Vi
nấm thử nghiệm: Trichophyton mentagrophytes, T
rubrum, Microsporum gypseum, Malassezia furfur
ATCC 44344, Candida albicans ATCC 10231.
Phương pháp nghiên cứu
Chiết xuất: Bột thân rễ và rễ Ngải bún được
chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với ethanol 96% (EtOH) 3 lần với tỷ lệ dược liệu: dung môi (1:10, 1:7,5 và 1:5) trong 24 giờ Dịch chiết ethanol được bay hơi dung môi đến còn khoảng 1/10 thể tích ban đầu (cao NB) Sau đó lắc phân bố dịch chiết này với n – hexan, dichloromethan (DCM), ethylacetat (EtOAc) với tỷ lệ 1:1, bốc hơi dung môi để thu được các cao phân đoạn
Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật có trong cao NB
Kỹ thuật hiện hình sinh học với sự kết hợp sắc ký lớp mỏng và xác định tác động kháng vi sinh vật của các hợp chất được phân tách trên bảng mỏng sắc ký.Điều kiện thực hiện: Cao NB được hòa tan trong CHCl3 chấm lên bản mỏng silicagel F254 (Merck); khai triển với pha động: CHCl3 – EtOAc (9:1); phát hiện vết bằng cách soi
UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm; vi sinh vật
thử nghiệm: M gypseum và S aureus.(3)
Cao NB được sử dụng để phân lập các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật bằng sắc ký cột cổ điển với các điều kiện sắc ký: Cột 50 cm
x 2 cm; pha tĩnh: 70 g silica gel cỡ 37 – 63 µm; pha động: CHCl3 – EtOAc (9:1) (Cột 1), n- hexan – EtOAc (5:2) (Cột 2); thể tích mỗi phân đoạn 5 ml, lượng mẫu nạp 2 g Gộp các phân đoạn có vết tương tự trên sắc ký lớp mỏng, khảo sát tác động kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật hiện hình sinh học
Trang 3Chất phân lập được xác định độ tinh khiết
bằng UPLC với các điều kiện: máy UPLC của
hãng Water; cột C18 Sunfire 4,6 x 150 mm, kích
thước hạt pha tĩnh 5 µm; pha động: nước –
acetonitril; chương trình chạy gradient (nước từ
90% đến 10%); thể tích tiêm mẫu 5 µl; tốc độ
dòng 0,8 ml/phút; đầu dò PDA phát hiện tại
bước sóng 288,7 nm; thời gian chạy 55 phút
Xác định cấu trúc của hoạt chất kháng vi sinh
vật trong cao NB bằng phổ NMR
Tác động kháng vi sinh vật của cao NB và các
cao phân đoạn Ngải bún được xác định bằng
phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy và
phương pháp pha loãng trong môi trường rắn
theo hướng dẫn của CLSI M38 – A2 Môi trường
sử dụng TSA cho vi khuẩn, SDA cho nấm da và
C albicans, m – Dixon cho M furfur.(7)
KẾT QUẢ
Chiết xuất
Từ 500 g bột Ngải bún khô (thu được từ 5
kg thân rễ và rễ Ngải bún tươi), sau khi ngâm lạnh với EtOH 96% thu được 66,64 g cao toàn phần NB
Từ 50 g cao toàn phần, sau khi lắc phân bố với các dung môi thu được các cao n – hexan (17,25 g), DCM (23,75 g), EtOAc (2,13 g) và cao nước còn lại (2,13 g)
Hoạt tính kháng vi sinh vật các cao toàn phần và cao phân đoạn từ ngải bún
Bảng 1: Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao NB và các cao PĐ (mm)
Cao Lượng cao trên 1 đĩa giấy
(mg)
Vi khuẩn Vi nấm
Sa MRSA Pa Ec Tm Tr Mg Ca Mf
Chú thích: Sa: S aureus, Pa: P aegrunosa, Ec: E coli, Tm: T mentagrophytes, Tr: T rubrum, Mg: M gypseum, Ca: C albicans, NH: n – hexan, DCM: Dicloromethan, “ – “: không xác định được, EtOAc: Ethylacetat, Mf: Malassezia furfur
Nhận xét: Kết quả ở bảng 1 cho thấy, cao
toàn phần và các cao phân đoạn DCM, EtOAc
cho phổ kháng khuẩn và kháng nấm tương tự
nhau Cả 3 loại cao này đều cho tác động trên T
mentagrophytes, T rubrum, M gypseum, S aureus
và MRSA; không có tác động kháng E coli, P
aeruginosa, C albicans và M furfur
Bảng 2: Kết quả MIC của cao toàn phần và cao phân đoạn trên các vi sinh vật thử nghiệm (µg/ml)
Nhận xét: Từ giá trị MIC ở bảng 2 cho thấy
cao DCM và cao toàn phần có hoạt tính kháng
vi sinh vật thử nghiệm tương đương nhau và
cao hơn so với cao EtOAc Giá trị MIC của cao
toàn phần trên S aureus thấp hơn so với kết
quả nghiên cứu của Ekkarin Pattaratanawadee
và cộng sự (3000 µg/ml)(5) Kết quả này tương đương với nghiên cứu của Souwalak Phongpaichit và cộng sự sử dụng dịch chiết thân rễ và rễ Ngải bún với các dung môi EtOH 96%, CHCl3 và methanol trên chủng M
gypseum có giá trị MIC từ 64 – 128 µg/ml(6)
Trang 4Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật trong
cao NB
Xác định vết có hoạt tính kháng vi sinh vật
bằng kỹ thuật hiện hình sinh học
Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao NB cho 18 vết
ở UV365, trong đó:
Vết số 8 với Rf = 0,58; cho phát quang màu
vàng cam cho vòng ức chế M gypseum
Vết 9 với Rf = 0,52; phát quang màu cam cho
vòng ức chế M gypseum và S aureus
Vết 10 với Rf = 0,48; phát quang (không xác
định được màu) cho vòng ức chế S aureus
Từ kết quả tự sinh đồ (hình 1), chúng tôi
chọn vết 9 làm mục tiêu phân lập
Hình 1: Kết quả kỹ thuật hiện hình sinh học phát hiện
vết có hoạt tính kháng vi sinh vật
Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển
Cao NB sau khi được triển khai qua cột 1 thu được 70 PĐ, gộp các PĐ có chứa mục tiêu phân lập thành 2 phân đoạn lớn: PĐ – A (42 – 49) và
PĐ – B (50 – 57) Phân đoạn B tinh khiết hơn, chỉ
có 2 vết
Sau khi triển khai sắc ký cột cổ điển PĐ – B (Cột 2), thu được 40 PĐ Từ kết quả SKLM, tiến hành gộp các PĐ có chứa mục tiêu, để bay hơi dung môi tự nhiên, thu được các cắn màu trắng lẫn vàng: PĐ – B1 (13 -15) 20mg, PĐ – B2(16 -18) 5mg, PĐ – B3 (19 – 20) 19,1 mg, PĐ – B4 (21 – 25) 23,9 mg Tiến hành rửa phân đoạn B1 bằng n- hexan và EtOAc để tách riêng phần bột màu trắng ngà, thu được chất NB1 (3,6 mg)
Kiểm tra độ tinh khiết của chất NB1 bằng UPLC
Kết quả ở hình 3 cho thấy sắc ký đồ của chất NB1 chỉ cho một đỉnh duy nhất tại 27,324 phút,
có độ tinh khiết lớn hơn 95%, đủ điều kiện để tiến hành xác định cấu trúc bằng phổ NMR
Hình 2: Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết chất NB1 bằng UPLC
Trang 5Xác định cấu trúc hợp chất NB1
NB1 tủa trong MeOH ở dạng bột vô định
hình, màu trắng ngà, dễ tan trong CHCl3, EtOAc,
MeOH, kém tan trong n – hexan Trên bản silica
gel 60 F254 cho vết tắt quang màu xanh nhạt dưới
UV254, màu hồng đậm với thuốc thử VS Đồng
thời NB1 cho kết quả dương tính với phản ứng
cyanidin Có thể sơ bộ kết luận NB1 là flavonoid
Phổ 13C – NMR của NB1 cho thấy sự hiện
diện của 12 tín hiệu carbon, nhưng có 2 tín hiệu
cao bất thường tại 128,89 ppm và 126,15 ppm
Vậy, cấu trúc của NB1 có đối xứng Thêm vào
đó, khi đ{nh giá phổ DEPT cường độ tín hiệu
của carbon tại 128,89 ppm cao hơn so với tín hiệu
tại 126,15 ppm, do đó tại vị trí 128,89 ppm là tổ
hợp của 3 tín hiệu carbon có độ dời hóa học như
nhau Từ những lý luận trên, cấu trúc của NB1
có 15 carbon, trong đó có:
1 nhóm CH2 (δC 43,36 ppm)
8 nhóm CH (δC 128,89; 126,15; 96,81; 95,53; 79,22 ppm)
6 carbon bậc 4, trong đó: 5 nhóm CIV sp3 (δC
164,93; 164,39; 163,17; 138,38; 103,16 ppm) và 1 nhóm >C=O (δC 195,71 ppm)
Các dữ liệu phổ NMR của NB1 gần như hoàn toàn phù hợp với pinocembrin và điều này được khẳng định qua dữ liệu phổ HSQC, HMBC, COSY(1,4) Dưới đ}y là dữ liệu phổ NMR của NB1 được so sánh với pinocembrin trình bày
ở bảng 3
Bảng 3: So sánh dữ liệu phổ 13 C – NMR (125 MHz) và 1 H – NMR (500 MHz) của NB1 và pinocembrin
C DEPT NB1 (CDCl 3 ) Pinocembrin (DMSO – d 6 )
δ C δ H (J, Hz) HMBC (H C n ) COSY δ C
(1)
δ H (J, Hz) (4)
2,72 dd (17,3)
Dưới đ}y là công thức khai triển của
pinocembrin (5,7 – dihydroxyflavanon)
Hình 3: Công thức khai triển của pinocembrin
Bằng kỹ thuật tự sinh đồ, chất NB1 có hoạt tính kháng các vi sinh vật thử nghiệm (hình 4)
T mentagrophytes S.aureus
Hình 4: Kết quả tự sinh đồ chất NB1 trên T
mentagrophytes và S aureus
Trang 6KẾT LUẬN
Các cao ethanol, các cao phân đoạn n-hexan,
dichloromethan và ethylacetat chiết từ thân rễ và
rễ Ngải bún cho tác động kháng S aureus, MRSA
với MIC trong khoảng 1100 – 1500 µg/ml; T
mentagrophes, T rubrum và M gypseum với MIC
trong khoảng 90 – 120 µg/ml Hợp chất cho tác
động kháng khuẩn và kháng nấm da đã được
phân lập bằng sắc ký cột cổ điển và xác định cấu
trúc hóa học bằng phổ NMR là pinocembrin
KẾT QUẢ
Các kết quả trên là tiền đề cho các nghiên
cứu tiếp theo để ứng dụng thân rễ và rễ Ngải
bún như nguồn nguyên liệu kháng vi sinh vật
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Agrawal P (2013) Carbon – 13 NMR of flavonoids pp 78 –
101, Elsevier, Amsterdam
2 Chahyadi A, Rika H, and Komar RW (2014) Boesenbergia
pandurata Roxb, an Indonesian medicinal plant: phytochemistry, biological activity, plant biotechnology
Procedia Chemistry 13, pp.13-37.
3 Choma I (2011) Bioautography detection in thin – layer
chromatography Journal of Chromatography A 1218, pp.2684 –
2691
4 Liu Y (1992) Isolation of potential cancer chemopreventive
agents from Eriodictyon californicum Journal of natural products
55, pp.357 – 363
5 Pattaratanawadee E (2006) Antimicrobial activity of spice extracts against pathogenic and spoilage microorganisms
Kasetsart J Nat Sc 40, pp 159 – 165
6 Phongpaichit S (2005) Antifungal activities of extracts from Thai medicinal plants against opportunistic fungal pathogens
associated with AIDS patients Mycoses 48, pp 333 – 338
7 Wayne P (2008) CLSI Document M38 – A2 Clinical and Laboratory Standards Institute
8 Wuzy (2000) Flora of China pp 367 – 368
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017