Bài viết trình bày định tính thành phần hóa học, định lượng flavonoid toàn phần và đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết cây Hạ khô thảo nam (Blumea lacera).
Trang 1NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA HẠ KHÔ THẢO NAM
(Blumea lacera (Burn.F.) DC)
Trịnh Khánh Linh 1 ; Trần Văn Cường 1 ; Nguyễn Văn Thư 2
TÓM TẮT
Mục tiêu: định tính thành phần hóa học, định lượng flavonoid toàn phần và đánh giá tác dụng
chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết cây Hạ khô thảo nam (Blumea lacera) Đối tượng và
phương pháp: định tính phân đoạn dịch chiết từ phần trên mặt đất của Hạ khô thảo nam qua một số
nhóm hợp chất hóa học bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, định lượng flavonoid toàn phần
bằng phương pháp tạo màu với AlCl 3 trong môi trường kiềm-trắc quang, đánh giá tác dụng
chống oxy hóa thông qua khả năng dọn gốc tự do DPPH ( 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) Kết quả và
kết luận: Hạ khô thảo nam có chứa một số nhóm hợp chất như alcaloid, flavonoid, tanin,
saponin, sterol, terpenoid, polysaccharid, carotenoid Hàm lượng flavonoid toàn phần đạt 13,08
mg/g Các phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, trong đó
phân đoạn BLE có tác dụng tốt nhất
* Từ khóa: Hạ khô thảo nam; Dọn gốc tự do; Hóa thực vật; Chống oxy hóa
Phytochemical Investigation and Antioxidant Activity of Blumea
lacera (Burn.F.) DC
Summary
Objectives: To evaluate the phytochemical constituents and to investigate the antioxidant
activity of extracts from aerial part of Blumea lacera Materials and methods: Crude ethanol
extract from aerial part of B lacera and its derived fractions were assessed for phytochemical
classes Total flavonoid content was determined by aluminium chloride colorimetric method
Antioxidant activity was determined using 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical
scavenger methods Results and conclusion: B lacera is a source of various
phytoconstituents such as alkaloids, flavonoids, tannins, saponin, sterol, carotenoid, polysaccharide
and terpenoids Total flavonoids in the methanol extract were 13.08 ± 1.23 mg/g quercetin
equivalents With regards to DPPH experiments, all of the fractions from ethanol extract showed
DPPH free radical scavenging capacity The highest activity was obtained from the fraction ethyl
acetate with the SC 50 value of 18.56 mg/mL
* Keywords: Blumea lacera; Free radical scavenging; Phytochemical; Antioxidant.
1 Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
2 Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thư (thu_vmmu@hotmail.com)
Ngày nhận bài: 10/08/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 15/09/2018
Ngày bài báo được đăng: 26/09/2018
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Hạ khô thảo nam có tên khoa học là
Blumea lacera (Burn.f.) DC., thuộc họ Cúc
(Asteraceae) Theo Đông y, Hạ khô thảo
nam được dùng làm thuốc trị tràng nhạc,
nhọt lở, cầm máu vết thương, băng huyết,
chảy máu cam, tức ngực, ho có đờm,
táo bón, mất ngủ, đái vàng và nóng [1]
Hạ khô thảo nam có nhiều tác dụng sinh
học như gây độc đối với một số dòng tế
bào ung thư (dạ dày, ruột kết, ung thư vú),
kháng bệnh bạch cầu in vitro, ức chế
Herpes virut týp 1 và 2 (HSV1 và HSV2),
kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa,
tiểu đường [3, 4, 5, 6, 7] Nhiều nghiên
cứu trước đây cho thấy Hạ khô thảo nam
có chứa các nhóm hoạt chất flavonoid,
terpen glycosid, polyphenol, tinh dầu,
terpenoid keton, sterol [8] Ở Việt Nam,
nguồn nguyên liệu Hạ khô thảo nam rất
dồi dào nhưng nghiên cứu về thành phần
hóa học và hoạt tính sinh học của dược
liệu này vẫn còn hạn chế Bài báo này
trình bày kết quả nghiên cứu về thành
phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa
của một số phân đoạn dịch chiết cây Hạ
khô thảo nam
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu:
Phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo
nam được thu hái năm 2018 tại Sa Pa
(Lào Cai) Mẫu được Viện Sinh thái Tài
nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam thẩm định tên
khoa học
* Hóa chất và dung môi:
Chất chuẩn axít gallic (hàm lượng ≥ 98%)
và thuốc thử folin - ciocalteu (Hãng Sigma Aldrich) Chất chuẩn quercetin hàm lượng 90,87% (Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương) Các dung môi, hóa chất trong phòng thí nghiệm: ethanol (EtOH), methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc),
dicloromethan (DCM), n-hexan, natri
carbonat, nhôm clorid, axít acetic, natri acetat (Hãng Merck); axít ascorbic, DPPH (Hãng Sigma)… đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích
* Thiết bị:
Máy đo hàm ẩm tự động Shimadzu-Moc 63U (Nhật Bản); máy đo quang UV-Vis Biochrom Libra S70 PC (Anh); cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,1 mg (Trung Quốc); máy chiết siêu âm gia nhiệt Sineo Uwave - 1000 (Trung Quốc); pipet chính xác, bình định mức (loại A); cốc có mỏ, bình nón, ống nghiệm các loại và những dụng cụ, thiết bị khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm
2 Phương pháp nghiên cứu
* Chiết xuất các phân đoạn dịch chiết:
Cân 1,1 kg bột thô phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam, chiết hồi lưu
3 lần với EtOH 96%, để nguội, lọc, tập trung dịch lọc, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn EtOH Sau đó, phân tán cắn EtOH trong nước nóng (70oC), lần lượt lắc với các dung môi có độ phân
cực tăng dần: n-hexan, dicloromethan,
ethyl acetat thu được các phân đoạn dịch chiết Các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cắn
n-hexan (BLH; 5,2 g), cắn dicloromethan
(BLD; 10,7 g), cắn ethyl acetat (BLE; 8,6 g)
Trang 3Phần dịch nước còn lại cô dưới áp suất
giảm, sấy khô đến cắn (BLW; 17,9 g)
* Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ
bằng phản ứng hóa học đặc trưng:
Tiến hành phản ứng hóa học đặc trưng
theo quy trình về phương pháp nghiên cứu
cây thuốc [2]
* Định lượng flavonoid toàn phần:
Định lượng flavonoid toàn phần theo
phương pháp có biến đổi của Meda và
CS [9]
Dung dịch quercetin chuẩn: pha quercetin
chuẩn trong MeOH:H2O (1:1) có nồng độ
1 mg/ml Từ chuẩn gốc pha ra thành các
dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ
175, 150, 125, 100 và 75 µg/ml
Dung dịch thử: cân chính xác 10,0 g
bột dược liệu cho vào bình nón 250 ml,
thêm 150 ml dung dịch MeOH:H2O (1:1),
chiết siêu âm ở 50oC trong 60 phút
(150 ml/lần × 3 lần), lọc thu được dịch chiết
Dịch chiết được cô thu hồi dung môi còn
1/5 thể tích, sau đó thủy phân bằng dung
dịch HCl 20% ở 85oC trong 3 giờ Dịch đã
thủy phân để nguội, lắc với 15 ml ethylacetat
(15 ml/lần × 3 lần), gộp các dịch chiết cho
vào bình định mức 50 ml và bổ sung dung
môi đến vạch
Phản ứng tạo màu: hút chính xác 1 ml
dung dịch phân tích (dung dịch chuẩn
hoặc dung dịch thử) cho vào bình định
mức 25 ml, thêm 0,5 ml dung dịch natri
citrat 1% Thêm tiếp 2,0 ml dung dịch
AlCl3 0,5% Sau đó, bổ sung dung dịch
axít acetic 5% pha trong methanol đến
vạch Lắc đều, để yên 45 phút, tiến hành
đo quang ở bước sóng 425 nm
Hàm lượng flavonoid toàn phần được tính theo công thức sau:
At - b
X (mg/g) =
m.a.(100 - h) × 125
Trong đó:
X (mg/g): hàm lượng flavonoid toàn phần ở phần trên mặt đất của Hạ khô thảo nam
At: độ hấp thu ở bước sóng 425 nm của mẫu thử
m: khối lượng dược liệu (g)
a, b: các hệ số trong phương trình tuyến tính của chất chuẩn y = ax + b h: độ ẩm của dược liệu
* Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thông qua khả năng loại gốc tự
do (GTD) DPPH:
Tiến hành thực nghiệm theo phương pháp của Yuvaraj và CS (2013) [10] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Mẫu thử là cắn của phân đoạn dịch chiết được pha trong DMSO thành dải nồng độ: 90, 45, 9, 1 mg/ml DPPH pha trong methanol (100%) ở nồng
độ 0,25 µM Hút 1 ml mẫu nghiên cứu
đã pha ở các nồng độ vào ống thủy tinh Mỗi nồng độ thử chất lặp lại 2 lần Thêm
1 ml dung dịch DPPH đã chuẩn bị ở trên vào các ống đã có sẵn mẫu nghiên cứu Ống không có mẫu thử, chỉ có 1 ml nước
và 1 ml DPPH làm đối chứng âm Ủ ở
37oC trong 30 phút Xác định độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng tại bước sóng
517 nm trên máy đọc ELISA Khả năng trung hòa GTD (Scavenging Activities - SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:
Trang 4(ODđối chứng - ODmẫu thử)
% SA =
ODđối chứng
× 100 Trong đó:
ODđối chứng: độ hấp thụ tại giếng không
chứa chất thử
ODmẫu thử: độ hấp thụ tại giếng chứa
chất thử
Lập phương trình biểu thị mối tương quan giữa khả năng chống oxy hóa và nồng độ chất thử, xác định nồng độ có khả năng chống oxy hóa bằng 50% Điểm nồng độ đó là SC50, giá trị SC50 được xác định dựa vào phương trình y = ax + b, trong đó y là khả năng loại bỏ GTD, a và b
là các hệ số trong phương trình y = ax + b
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ từ phần trên mặt đất cây Hạ khô
thảo nam
1
Alcaloid
Có
2
Glycosid tim
Không
4
Flavonoid
Có
5
Coumarin
7
Tanin
Có
Trang 5Phần trên mặt đất cây Hạ khô thảo nam có chứa các hợp chất thuộc nhóm alcaloid, flavonoid, tanin, saponin, sterol, axít hữu cơ, carotenoid, polysaccharid và đường khử Kết quả nghiên cứu phù hợp với các tác giả khác về định tính nhóm hợp chất hữu cơ trong cây Hạ khô thảo nam Ahmed và CS (2014) nghiên cứu định tính các nhóm hoạt chất cho thấy Hạ khô thảo nam có chứa nhóm hợp chất carbohydrat, flavonoid, alcaloid, terpenoid và steroids ở phân đoạn dịch chiết phân cực [11] Nghiên cứu của Pattewar và CS (2012) cũng chứng minh sự có mặt của tanin, alcaloid, saponin, anthraquinone glycosid, steroid, flavonoid, phenolic và terpenoid từ dịch chiết nước của Hạ khô thảo nam [12] Ngoài ra, Tiwari và CS (2012) cũng báo cáo sự có mặt của các hợp chất steroid, terpenoid, alcaloid, saponin, nhưng không có mặt của nhóm hợp chất tanin và phenolic [13]
2 Định lượng flavonoid toàn phần
* Kết quả xây dựng đường chuẩn:
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn quercetin (75 - 150 µg/ml) Thực hiện phản ứng tạo màu với các thuốc thử Sau khi ổn định màu, đo quang phổ UV-VIS ở bước sóng 425 nm, đánh giá sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang với nồng độ dung dịch
Bảng 2: Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chuẩn
Đường chuẩn Y = 0,0033X - 0,0138
Hình 1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ dung dịch quercetin chuẩn
Trang 6Có mối tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ quercetin tại bước sóng 425 nm theo phương trình y = 0,0033x - 0,0138 với hệ số tương quan r2 = 0,9929 Như vậy, có thể sử dụng phương trình đường chuẩn để tính hàm lượng flavonoid toàn phần trong dịch chiết Hạ khô thảo nam
* Kết quả định lượng flavonoid toàn phần:
Tiến hành định lượng flavonoid toàn phần trong các mẫu Hạ khô thảo nam thu hái tại Sa Pa
Bảng 3: Kết quả định lượng flavonoid toàn phần từ phần trên mặt đất của cây Hạ
khô thảo nam
Hàm lượng flavonoid toàn phần của phần trên mặt đất cây Hạ khô thảo nam là 13,08 ± 1,23 mg/g tính theo quercetin Chứng tỏ Hạ khô thảo nam có chứa hàm lượng khá lớn flavonoid Đây là nhóm hợp chất thể hiện nhiều hoạt tính sinh học tốt Do đó, kết quả nghiên cứu này có thể định hướng trong nghiên cứu tác dụng sinh học tiếp
theo như chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, giải độc…
3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam thông qua khả năng loại GTD DPPH
Bảng 4: Hoạt tính loại GTD của phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam
Trang 7Hình 2: Hoạt tính dọn GTD của các phân đoạn dịch chiết Hạ khô thảo nam
Hoạt tính loại bỏ GTD có sự khác biệt
giữa các phân đoạn dịch chiết ở nồng độ
1,0; 9; 45 và 90 mg/ml So sánh giá trị
SC50 của các phân đoạn dịch chiết cho
thấy ở Hạ khô thảo nam, phân đoạn dịch
chiết có tác dụng dọn GTD theo thứ tự
BLH < BLD < BLW < BLE Điều này được
giải thích là do trong phân đoạn dịch chiết
ethyl acetat có thành phần hóa học chủ
yếu là flavonoid và phenolic, là những
hợp chất có khả năng chống oxy hóa tốt,
do trong công thức cấu tạo của những
hợp chất này có nhiều nhóm hydroxyl (-OH)
phenol Số lượng và vị trí của các nhóm
hydroxyl (hydroxyl thế ở vị trí ortho) là
những đặc điểm cấu trúc quan trọng ảnh
hưởng đến khả năng chống oxy hóa của
hợp chất phenolic Do vậy, các hợp chất
thuộc những nhóm trên có khả năng nhường
một nguyên tử hydrogen từ gốc hydroxyl
của chúng cho GTD để hình thành gốc
phenoxyl bền vững
Thử nghiệm DPPH là phương pháp
thường được sử dụng để đánh giá tác
dụng chống oxy hóa do có nhiều ưu điểm
như tiến hành nhanh, dễ thực hiện, có độ tin cậy cao và không đòi hỏi thiết bị cũng như hóa chất đặc biệt Ngoài ra, DPPH có
độ ổn định cao, tổng hợp ra GTD không
bị phân hủy trong nước, methanol hoặc ethanol Khả năng dọn GTD của phân đoạn dịch chiết phụ thuộc vào khả năng chống oxy hóa các chất có trong thành phần dịch chiết làm mất hydrogen
và hình dạng cấu trúc của những thành phần đó
KẾT LUẬN
Đã đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ phần trên mặt đất của cây Hạ khô thảo nam thông qua khả năng dọn GTD DPPH Kết quả cho thấy, phân đoạn dịch chiết ethyl acetat có thành phần chủ yếu là các hợp chất flavonoid và phenolic có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn so với những phân đoạn còn lại Nghiên cứu cũng xác định Hạ khô thảo nam là nguồn hợp chất chống oxy hóa tự nhiên tiềm năng với nhiều hợp chất tự nhiên như alcaloid,
Trang 8flavonoid, tanin, saponin, sterol, terpenoid,
polysaccharid, carotenoid Đặc biệt, bộ
phận trên mặt đất Hạ khô thảo nam có
hàm lượng flavonoid đạt 13,08 mg/g
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Võ Văn Chi Từ điển Cây thuốc Việt Nam
Nhà xuất bản Y học 1997, tr.170
2 Ngô Vân Thu, Trần Hùng Dược liệu
học, tập 1 Nhà xuất bản Y học Hà Nội 2013,
tr.223-227
3 Uddin S.J, Grice I.D, Tiralongo Cytotoxic
effects of Bangladeshi Medicinal Plant Extracts
Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine 2011, pp.578-1092
4 Chiang L.C, Cheng H.Y, Chen C.C, Lin
C.C In vitro anti-leukemic and antiviral activities
of traditionally used medicinal plants in
Taiwan American Journal of Chinese Medicine
2004, 32 (5), pp.695-704
5 Shahwar D, Ullah S, Ahmad N, Ullah S,
Khan M.A Antibacterial and antioxidant
activities of two Asteracious species growing
in Pakistan Asian Journal of Chemistry 2010,
22 (4), pp.3246-3254
6 Shahwar D, Ullah S, Ahmad N, Ullah S,
Ahmad N Anti-diabetic activity of the
methanolic extract of Blumea lacera DC
(Asteraceae) in alloxan-induced diabetic rats
Asian Journal of Chemistry 2011, 23 (12),
pp.5403-5406
7 Ragasa C.Y, Wong J, Rideout J.A
Monoterpene glycoside and flavonoids from
Blumea lacera Journal of Natural Medicines
2007, 61 (4), pp.474-475
8 Akter R, Uddin S.J, Tiralongo J, Grice I.D, Tiralongo E A new cytotoxic steroidal
glycoalkaloid from the methanol extract of
Blumea lacera leaves Journal of Pharmacy &
Pharmaceutical Sciences 2015, 18 (4), pp.616-633
9 Meda A, Lamien C.E, Romito M, Millogo
J, Nacoulma O.G Determination of the total
phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity Food Chemistry 2005, 91 (3), pp.571-577
10 Yuvaraj P, Subramoniam A, Louis T, Madhavachandran V, Narasu M.L Attenuation
of expression of cytokines, oxidative stress and inflammation by hepatoprotective phenolic
acids from Thespesia populnea Soland ex
Correa stem bark Annals of Phytomedicine
2013, 2, pp.47-56
11 Ahmed F.A, Rahman A, Mubassara S
Phytochemical composition, antioxidant
activity and cytotoxicity of Blumea lacera Linn
from two different habitats Jahangirnagar University Journal of Biological Sciences
2014, 3 (1), pp.37-45
12 Pattewar A.M, Dawalbajea A.B, Gundalea D.M, Pawarb P.B, Kavtikwara P.G, Yerawara P.P, Pandharkara T.M, Patawara V.A Phytochemistryical & anthelmintic studies
on Blumea lacera Indo Global Journal of
Pharmaceutical Sciences 2012, 2 (4), pp.390-396
13 Tiwari P, Saluja G, Pandey A.S, Sharma N Isolation and biological evaluation
of some novel phytoconstituents from Blumea
lacera (Burn F.) D.C International Journal of
Pharmacy and Pharmaceutical Sciences
2012, 4 (4), pp.148-150