Bài viết khảo sát chất lượng và có chế tác dụng của kháng thể IgY kháng độc tố tả được phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên độc tố tả. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
Trang 1ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA GLOBULIN MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU NGUỒN GỐC TỪ TRỨNG GÀ KHÁNG ĐỘC TỐ TẢ (CHOLERA TOXIN)
Hoàng Trung Kiên*; Nguyễn Đặng Dũng*
TÓM TẮT
Theo một số nghiên cứu gần đây trên động vật thực nghiệm, kháng thể kháng độc tố tả (ĐTT)
(cholera toxin) hoặc kháng tiểu phần B của ĐTT (CT-B subunit) có thể được sử dụng như là một
biện pháp tạo miễn dịch thụ động đặc hiệu nhằm điều trị và/hoặc dự phòng trường hợp nhiễm vi khuẩn (VK) tả đường tiêu hóa Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát chất lượng và có chế tác dụng của kháng thể IgY kháng ĐTT được phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên ĐTT Kết quả cho thấy kháng thể IgY kháng độc tố VK tả phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch thể hiện hoạt tính đặc hiệu với độc tố VK tả trên in vitro, ngăn không cho độc tố gắn vào thụ thể GM1
* Từ khóa: Độc tố tả; Kháng thể IgY
Study on quality and mechanism of action of yolk
immunoglobulin (IgY) specific to cholera toxin
Summary
Recently, several papers revealed that antibodies against cholera toxin (CT) or CT-B subunit showed protective effect when used as preventive or therapeutic method on animal models orally infected with V.cholerae In the present study, we investigated the purity and tested the reactivity
of IgY isolated from eggs laid of previously immunized hens The results showed that the IgY preparation isolated from eggs laid of immunized hens was relatively pure and could inhibit binding of CTB with GM1 in vitro
* Key words: Cholera toxin; Immunoglobulin Y (IgY)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên
nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu,
chủ yếu ở trẻ em, đặc biệt các quốc gia đang
phát triển Một trong những tác nhân gây tiêu
chảy cấp là nhiễm K tả (Vibrio cholerae)
theo đường tiêu hóa Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công bố năm
2013, trong năm 2012 đã ghi nhận 245.393 trường hợp mắc bệnh tả tại tất cả các châu lục trên toàn thế giới, với 3.034 trường hợp
tử vong [7] Cơ chế bệnh sinh của bệnh có
sự tham gia của ĐTT (cholera toxin - CT),
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Đặng Dũng (dzungmd@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 30/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/12/2013
Ngày bài báo được đăng: 16/12/2013
Trang 2do VK tả tiết ra sau khi nhiễm vào ruột bệnh
nhân; ĐTT gây tổn thương tế bào niêm mạc
ruột, làm tăng tiết dịch tại ruột, dẫn đến ỉa
chảy cấp Một số nghiên cứu gần đây cho
thấy, bên cạnh các biện pháp dự phòng và
điều trị kinh điển khi nhiễm VK tả (như sử
dụng vắcxin, bổ sung nước, điện giải; sử
dụng kháng sinh), việc sử dụng kháng thể
đặc hiệu với VK tả hoặc với ĐTT có thể là
một biện pháp dự phòng và/hoặc điều trị
đặc hiệu có tác dụng bảo vệ rõ rệt trên mô
hình động vật thực nghiệm nhiễm VK tả
đường tiêu hóa [4, 6]
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo
sát độ tinh sạch, đồng thời đánh giá hoạt
tính kháng thể IgY phân lập từ trứng gà
được gây miễn dịch với ĐTT trên in vitro
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu
- Độc tố VK tả (cholera toxin- CT) (Sigma,
Hoa Kỳ)
- Hoá chất, sinh phẩm chủ yếu: hóa chất
chạy điện di SDS-PAGE; GM1, cộng hợp CTB
(cholera toxin-B subunit)- HRP (horse radish
peroxidase) (Bio-Rad, Hoa Kỳ; Sanofi, Pháp)
2 Phương pháp nghiên cứu
* Gây miễn dịch cho gà mái với kháng
nguyên ĐTT và phân lập IgY:
- Tạo kháng nguyên ĐTT: trộn huyền
dịch ĐTT với tá chất freund hoàn chỉnh
hoặc không hoàn chỉnh (tỷ lệ 1:1 về thể
tích); nồng độ ĐTT trong huyền dịch kháng
nguyên là 0,1 mg/ml, sau đó gây miễn dịch cho gà mái, thu hoạch trứng và tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng theo các quy trình đã được mô tả trong nghiên cứu trước của chúng tôi [1]
* Kiểm tra khả năng gắn kết của CT-B với GM1 in vitro:
- Gắn GM1 lên phiến ELISA: ủ 50 µl GM1 (100 pmol/ml) trong mỗi giếng của phiến ELISA, thời gian 2 giờ ở nhiệt độ phòng
- Tiến hành phản ứng: bổ sung vào mỗi giếng 50 µl cộng hợp HRP-CTB ở những nồng độ khác nhau, sao cho lượng CTB trong mỗi giếng lần lượt là 1,25; 2,5 và 5 ng; rửa giếng bằng PBS-T, sau đó bổ sung vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi
50 ml OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2 ngay trước khi sử dụng); ủ phiến ELISA ở nhiệt
độ phòng 15 phút trong bóng tối; ngừng phản ứng bằng cách bổ sung 50 ul HCl 2N
- Đo mật độ quang (OD) của các giếng tại bước sóng 492 nm
* Ph¶n øng ELISA đánh giá hoạt tính của kháng thể IgY kháng CT-B:
- Ủ 50 µl GM1 (100 pmol/ml) trong mỗi giếng của phiến ELISA trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng
- Bổ sung cộng hợp HRP-CTB cùng với kháng thể IgY phân lập từ lòng đỏ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên CT Giếng đối chứng âm, sử dụng BSA thay cho IgY Bên cạnh đó, I Ig (intravenous immunoglobulin) được
sử dụng như đối chứng dương trong thí nghiệm
- Rửa phiến ELISA bằng PBS-T Bổ sung vào mỗi giếng 50 µl OPD (0,5 mg/ml, mỗi 50 ml
Trang 3OPD bổ sung thêm 20 µl H2O2) Ủ phiến
ELISA trong bóng tối 15 phút ở nhiệt độ
phòng; ngừng phản ứng bằng cách bổ sung
50 ul HCl 2N Đo OD của các giếng tại bước
sóng 492 nm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau
phân lập
Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgY
sau thẩm tích loại muối bằng kỹ thuật điện
di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính protein
Hình 1: Kết quả điện di SDS-PAGE trong
điều kiện biến tính IgY
Kết quả cho thấy, sản phẩm IgY thu
được sau thẩm tích loại bỏ muối amoni
sulfate có độ tinh sạch cao, với 2 băng trên
điện di SDS-PAGE có trọng lượng lần lượt
khoảng 70 kDa và 35 kDa, tương ứng với chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY
2 Khả năng gắn kết của CTB với GM1
in vitro
Hình 2: Khả năng gắn kết của CTB với
GM1 in vitro
Kết quả thí nghiệm cho thấy ở các nồng
độ khác nhau, CTB đều thể hiện khả năng gắn kết đặc hiệu với GM1 in vitro
3 Tác dụng của IgY ức chế gắn kết của CTB với GM1
Hình 3: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết
CTB- GM1 in vitro
(GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 5 ng/giếng)
CT-B concentration (ng/well
Trang 4Hình 4: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết
CTB- GM1 in vitro
(GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 1 ng/giếng)
Hình 5: Tác dụng của IgY ức chế gắn kết
CTB- GM1 in vitro
(GM1: 5 pmol/giếng; CTB: 0,2 ng/giếng)
Kết quả phản ứng ELISA cho thấy: kháng
thể IgY thu được từ lòng đỏ trứng gà gây
miễn dịch bằng độc tố VK tả phản ứng đặc
hiệu với CTB, đồng thời thể hiện tác dụng
ức chế sự gắn kết của CTB với GM1, trong
khi BSA (đối chứng âm) không thể hiện tác
dụng này I Ig chỉ thể hiện tác dụng ức chế
gắn kết của CTB với GM1 khi nồng độ CTB
là 1,0 và 0,2 ng/giếng (hình 4, 5), không thể
hiện tác dụng này ở nồng độ CTB 5 ng/giếng
(hình 3) Việc sử dụng I Ig như đối chứng
dương trong thí nghiệm này dựa vào kết
quả nghiên cứu của Yuki N và CS (1996)
công bố, trong đó, nhóm nghiên cứu nhận
thấy I Ig có tác dụng ngăn cản sự gắn kết
của ĐTT với GM1 in vitro [5] Kết quả nghiên
cứu cho thấy chế phẩm IgY do chúng tôi
tạo ra thể hiện hoạt tính ức chế gắn kết của CTB với GM1 mạnh hơn rõ rệt so với hoạt tính của IVIg: ở tất cả các nồng độ CTB được khảo sát, IgY đều thể hiện tác dụng
ức chế Lý do có được kết quả này là do IgY sử dụng trong thí nghiệm là sản phẩm thu được sau gây miễn dịch đặc hiệu với
CT Do đó, IgY có khả năng gắn kết đặc hiệu với CTB, dẫn đến ức chế gắn kết của CTB với GM1 Hoạt tính này của IgY kháng ĐTT có thể là một cơ chế tác dụng của IgY đặc hiệu với CT tạo ra hiệu quả bảo vệ: IgY
ức chế gắn của CTB với thụ thể GM1 trên
tế bào niêm mạc ruột, do đó ngăn chặn ĐTT bám lên màng tế bào niêm mạc ruột, cuối cùng, giảm tác động gây tổn thương tế bào niêm mạc ruột của ĐTT
Bằng phương pháp gây miễn dịch trên
gà mái và thu thập kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng của gà gây miễn dịch, Hoàng Trung Kiên và CS đã thu được IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng K E ictaluri (gây bệnh mủ gan cá tra) [1], hoặc kháng thể đặc hiệu với
VK tả [2] Tim Sunnary và CS với phương pháp tương tự đã thu được kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh, có tác dụng ức chế trực khuẩn mủ xanh trên mô hình vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh [3]
Trong nghiên cứu này, gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên là ĐTT tự nhiên (CT), cho phép phân lập được kháng thể IgY từ trứng của gà được gây miễn dịch, có phản ứng đặc hiệu với CTB Theo một số nghiên cứu gần đây, kháng thể IgY đặc hiệu với kháng nguyên CT-B, thể hiện tác dụng bảo vệ trên mô hình động vật thí nghiệm nhiễm VK tả theo đường tiêu hóa [4] Kết quả thu được trong nghiên cứu này gợi ý: IgY đặc hiệu với kháng nguyên ĐTT (CT) và/hoặc CTB thể hiện tác dụng bảo vệ
Trang 5trên mô hình động vật nhiễm VK tả đường
tiêu hóa thông qua cơ chế ức chế gắn kết
của CTB với GM1
KẾT LUẬN
Chế phẩm kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng
gà được gây miễn dịch với kháng nguyên
CT tương đối tinh khiết, có tác dụng ức chế
sự gắn kết của CTB với GM1 in vitro
KẾT LUẬN
1 Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại, Nguyễn
Ngọc Tuấn Nghiên cứu chế tạo kháng thể
kháng Edwardsiella ictaluri gây bệnh mủ gan ở
cá tra bằng công nghệ tạo kháng thể IgY gà
Tạp chí Thông tin y dược 2010, số 3, tr.71-76
2 Hoàng Trung Kiên, Lê Thu Hồng, Lê Thu
Hà, Nguyễn Đặng Dũng Nghiên cứu quy trình
gây miễn dịch tạo kháng thể IgY kháng K tả
(Vibrio cholerae) trên gà mái Tạp chí Y - Dược
học quân sự 2013, tập 38, số 1,tr 46-51
3 Tim Sunnary, Đỗ Minh Trung, Lê Thu
Hồng, Lê Văn Đông Tác dụng in vivo của kháng
thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh trên vết thương bỏng thực nghiệm nhiễm trực khuẩn mủ xanh Tạp chí Y - Dược học quân sự 2011, tập
36, số 8, tr.44-49
4 Hirai K, Arimitsu H, Umeda K Passive oral
immunization by egg yolk immunoglobulin (IgY)
to Vibrio cholerae effectively prevents cholera ActaMedica Okayama 2010, 64 (3), pp.163-170
5 Nobuhiro Yuki, Fuminori Myiagi Possible
mechanism of intravenous immunoglobulin treatment
on anti-GM1 antibody-mediated neuropathies Journal of the Neurological Sciences 1996, Vol
139, Issue 1, pp.160-162
6 Osek J, Jonson G, Svennerholm AM, Holmgren J Role of antibodies against biotype-specific Vibrio cholerae pili in protection against
experimental classical and El Tor cholera Infect
Immun 1994, 62 (7), pp.2901-2907
7 World Health Organization Cholera, 2012
Weekly Epidemiological Record 2013, Vol 88,
No 31, pp.321-336