Độc tính bán trường diễn của acid gambogic trên động vật thực nghiệm

Nhằm xác định tính an toàn của acid gambogic, bài viết nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu đánh giá độc tính bán trường diễn của acid gambogic đường uống trên động vật thực nghiệm.

Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Thị Thanh Loan, Bộ môn Dược lý,

Trường Đại học Y Hà Nội

Email: thanhloanfr89@gmail.com

Ngày nhận: 12/4/2018

Ngày được chấp thuận: 28/5/2018

ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA ACID GAMBOGIC TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

Trần Thanh Tùng 1 , Trần Thị Thu Thủy 2, Nguyễn Thị Thanh Loan 1

1 Trường Đại học Y Hà Nội

2 Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Nghiên cứu được thực hiện nhằm đánh giá độc tính bán trường diễn của acid gambogic đường uống trên

thực nghiệm Nghiên cứu tiến hành theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới Chuột cống trắng được uống

acid gambogic liều 20mg/kg/ngày và 30mg/kg/ngày trong 60 ngày liên tục và theo dõi chuột sau 15 ngày

ngừng uống thuốc thử Kết quả nghiên cứu cho thấy, acid gambogic gây giảm hàm lượng huyết sắc tố,

hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu so với lô chứng và tăng hoạt độ AST và ALT trong máu chuột Sau

15 ngày ngừng thuốc thử, các chỉ số huyết học và sinh hóa của lô uống thuốc thử không có sự khác biệt so

với lô chứng Ngoài ra, acid gambogic không ảnh hưởng đến các chỉ số đánh giá chức năng gan và chức

năng thận

Từ khóa: Acid gambogic, độc tính bán trường diễn, động vật thực nghiệm

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Acid gambogic là thành phần chính trong

nhựa cây Đằng Hoàng (Garcinia hanburyi

Hook f., thuộc họ Guttiferae), một cây thuốc

đông y phân bố đặc hữu ở vùng Đông Nam Á

trong đó có Việt Nam [1] Các nghiên cứu in

vitro và in vivo đã chỉ ra acid gambogic có tác

dụng trên nhiều loại ung thư như ung thư gan,

ung thư dạ dày, ung thư phổi và ung thư vú [2

- 7] Cơ chế tác dụng của acid gambogic có

liên quan đến gây độc tế bào, ức chế tăng

sinh, thúc đẩy quá trình tự chết của tế bào

bằng cách hoạt hóa enzym caspase 3, ức chế

sự gắn kết của protein anti - apoptotic với

peptid [7 - 9] Hiện trên thế giới chưa có công

trình nào công bố về công nghệ phân lập acid

gambogic ở qui mô công nghiệp mà chỉ có

một số phương pháp chiết xuất ở qui mô

phòng thí nghiệm Trong nghiên cứu này, acid gambogic được phân lập từ nhựa cây Đằng Hoàng trồng ở Phú Quốc, Kiên Giang tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Đến nay, chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam xác định độc tính của acid gambogic được chiết xuất từ nhựa cây Đằng Hoàng

Nhằm xác định tính an toàn của acid

gambo-gic, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu đánh giá độc tính bán trường diễn của acid

gambogic đường uống trên động vật thực nghiệm

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu nghiên cứu

Thuốc nghiên cứu

Acid gambogic được phân lập từ nhựa cây Đằng Hoàng ở Phú Quốc, Kiên Giang vào tháng 12/2015, với hiệu suất là 5% tại Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Acid

gambogic được chiết xuất từ nhựa cây bằng

dung môi methanol với độ tinh khiết là 92%

Thuốc thử được hòa tan trong nước để cho

chuột uống

Hoá chất và máy móc phục vụ nghiên

cứu

Kit định lượng các enzym và chất chuyển

hoá trong máu: ALT (alanin

aminotrans-ferase); AST (aspartat aminotransaminotrans-ferase);

bilirubin toàn phần; albumin; cholesterol toàn

phần; và creatinin của hãng Hospitex

Diag-nostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo),

định lượng trên máy sinh hóa bán tự động

Erba của Ấn Độ Các dung dịch xét nghiệm

máu của hãng Exigo, định lượng trên máy

Exigo - Boule Medical AB của Thụy Điển

Các hoá chất làm tiêu bản mô bệnh học

Động vật thực nghiệm

Chuột cống trắng chủng Wistar, cả hai

giống, trọng lượng 180g ± 20g, do Trung tâm

cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng -

Hà Tây cung cấp Động vật thí nghiệm được

nuôi 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong

suốt thời gian nghiên cứu trong điều kiện

phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn và nước

uống

2 Phương pháp

Nghiên cứu thực hiện theo hướng dẫn của

Tổ chức Y tế Thế giới [10; 11]

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên

làm 3 lô:

- Lô chứng (n = 10): Uống nước cất 1

ml/100g/ngày

- Lô trị 1 (n = 10): Uống thuốc thử acid

Chuột được uống nước cất/thuốc thử 60 ngày liên tục, mỗi ngày một lần vào buổi sáng Sau đó, chuột được theo dõi 15 ngày sau khi ngừng uống thuốc thử

Các chỉ tiêu theo dõi: Tình trạng chung; Sự thay đổi thể trọng chuột; Đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglo-bin, hematocrit, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu; Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số chất chuyển hoá trong máu: Bilirubin toàn phần, albumin và cholesterol toàn phần; Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: ALT, AST; Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh

Các thông số được đánh giá trước, sau 30 ngày, sau 60 ngày uống nước cất/thuốc thử

và sau 15 ngày ngừng uống thuốc thử Mô bệnh học: Sau 60 ngày uống thuốc thử, chuột được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột ở mỗi lô Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát hiện sớm ung thư

3 Xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống

kê theo phương pháp t-test Student và test trước - sau (Avant-après) Số liệu được biểu diễn dưới dạng: ± SD

*: Khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng sinh học với p < 0,05;

∆: Khác biệt có ý nghĩa so với trước nghiên cứu với p < 0,05

4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

X

III KẾT QUẢ

1 Tình trạng chung và sự thay đổi thể

trọng chuột

Trong thời gian thí nghiệm, chuột ở lô

chứng sinh học hoạt động bình thường, nhanh

nhẹn, mắt sáng, phân khô Trọng lượng chuột

ở lô chứng sinh học tăng có ý nghĩa thống kê

so với trước nghiên cứu Lô uống thuốc thử acid gambogic cả 2 liều giảm vận động hơn so với lô chứng Acid gambogic không gây co giật, không gây tiêu chảy trên động vật thực nghiệm

Sau 60 ngày uống thuốc thử, trọng lượng 2 lô trị không tăng so với trước nghiên cứu

2 Đánh giá chức năng tạo máu

Bảng 1 Ảnh hưởng của acid gambogic đến số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố,

hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu

Số lượng

hồng cầu

(T/l)

Sau 15 ngày

Hàm lượng

huyết sắc tố

(g/dl)

Hematocrit

(%)

Thể tích

trung bình

hồng cầu (fl)

Kết quả ở bảng 1 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc thử và sau 15 ngày ngừng uống, số lượng hồng cầu ở 2 lô trị đều không có sự khác biệt so với lô chứng Sau 30 ngày uống thuốc thử, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu ở 2 lô trị không có sự khác biệt so với lô chứng, sau 60 ngày, giảm có ý nghĩa thống kê và so với lô chứng Sau 15 ngày ngừng uống thuốc thử, các chỉ số trên ở 2 lô trị không có sự khác biệt so với lô chứng

Biểu đồ 1 Ảnh hưởng của acid gambogic

đến số lượng bạch cầu

Biểu đồ 2 Ảnh hưởng của acid gambogic

đến số lượng tiểu cầu

Kết quả ở biểu đồ 1 và 2 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc thử và sau 15 ngày ngừng uống, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu ở cả 2 lô trị đều không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng

3 Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan và chức năng gan

Bảng 2 Ảnh hưởng của acid gambogic đến hoạt độ AST (GOT)

và ALT (GPT) trong máu chuột

Hoạt độ

AST (UI/l)

Hoạt độ

ALT (UI/l)

Kết quả ở bảng 2 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc thử và sau 15 ngày ngừng

uống, hoạt độ AST và ALT trong máu chuột ở lô trị 1 không có sự khác biệt so với lô chứng Sau

30 ngày, hoạt độ AST trong máu chuột ở lô trị 2 không có sự khác biệt so với lô chứng, tuy nhiên,

hoạt độ ALT tăng có ý nghĩa thống kê Sau 60 ngày, hoạt độ AST và ALT trong máu chuột của lô

trị 2 tăng có ý nghĩa thống kê Sau 15 ngày ngừng uống thuốc thử, hoạt độ 2 enzym này trong

máu chuột của lô trị 2 không có sự khác biệt so với lô chứng

Bảng 3 Ảnh hưởng của acid gambogic đến nồng độ bilirubin toàn phần, nồng độ albumin,

nồng độ cholesterol toàn phần trong máu chuột

Bilirubin toàn

phần (mmol/l)

p2-1 > 0,05, p3-1 > 0,05, pb-a > 0,05, pc-a > 0,05, pd-a > 0,05

Albumin (g/dl)

p2-1 > 0,05, p3-1 > 0,05, pb-a > 0,05, pc-a > 0,05, pd-a > 0,05

Cholesterol

toàn phần

(mmol/l)

p2-1 > 0,05, p3-1 > 0,05, pb-a > 0,05, pc-a > 0,05, pd-a > 0,05 Kết quả ở bảng 3 cho thấy: Tại tất cả các thời điểm nghiên cứu, nồng độ bilirubin toàn phần,

albumin, cholesterol toàn phần ở cả 2 lô trị đều không có sự khác biệt so với lô chứng

Biểu đồ 3 Ảnh hưởng của acid gambogic đến nồng độ creatinin

Kết quả ở biểu đồ 3 cho thấy: Sau 30 ngày, 60 ngày uống thuốc thử và sau 15 ngày ngừng uống thuốc thử, ở cả 2 lô trị, nồng độ creatinin trong máu chuột không có sự thay đổi khác biệt có

ý nghĩa thống kê so với lô chứng

5 Hình ảnh giải phẫu vi thể

Hình ảnh vi thể gan và thận sau 60 ngày uống thuốc thử acid gambogic

Giải phẫu vi thể gan (HE x 400)

Lô chứng: Tế bào gan

bình thường

Lô trị 1: Tế bào gan thoái hóa nhẹ

Lô trị 2: Tế bào gan thoái hóa vừa Giải phẫu vi thể thận (HE x 400)

4 Đánh giá chức năng thận

IV BÀN LUẬN

Tình trạng chung và thể trọng chuột phản

ánh bộ mặt chung của cơ thể và là những chỉ

số bắt buộc phải được đánh giá trong nghiên

cứu độc tính bán trường diễn [10] Sau 60

ngày uống thuốc thử, trọng lượng của 2 lô trị

không tăng so với trước nghiên cứu với trước

nghiên cứu Sự giảm trọng lượng so với lô

chứng sinh học được giải thích một phần qua

độc tính trên máu và trên gan của acid

gambogic

Máu là một tổ chức rất quan trọng vì có

liên quan với mọi bộ phận, cơ quan trong cơ

thể Theo Tổ chức Y tế Thế giới, đánh giá

được càng nhiều thông số của máu càng có

khả năng đánh giá chính xác độc tính của

thuốc thử [11] Kết quả nghiên cứu cho thấy,

acid gambogic không làm thay đổi số lượng

hồng cầu, tuy nhiên, hàm lượng huyết sắc tố,

hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu giảm

có ý nghĩa thống kê so với lô chứng Tuy

nhiên, mức độ giảm so với lô chứng sinh học

không nhiều Theo nghiên cứu của Qi Qi và

cộng sự, acid gambogic liều 30mg/kg/ngày, 60

mg/kg/ngày và 120 mg/kg/ngày dùng cách

ngày không ảnh hưởng đến số lượng hồng

cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit trên

chuột cống trắng [12] Kết quả này có thể

được giải thích do sự khác nhau về nguồn

dược liệu và quy trình chiết xuất acid

gambogic Tuy nhiên, sau 15 ngày ngừng

uống thuốc thử, các chỉ số trên ở 2 lô trị không

có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng

Như vậy, độc tính trên hệ tạo máu của acid

gambogic có sự phục hồi Ngoài ra, kết quả

nghiên cứu cũng chỉ ra rằng không có sự khác

biệt có ý nghĩa thống kê về số lượng bạch cầu

và tiểu cầu trên động vật thực nghiệm giữa lô

uống thuốc thử và lô chứng

Gan là cơ quan có vai trò rất quan trọng trong cơ thể, đảm nhận nhiều chức năng phức tạp, đặc biệt là các quá trình chuyển hóa Khi đưa thuốc vào cơ thể có thể gây độc với gan, làm ảnh hưởng đến chức năng gan Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, hoạt độ các enzym có nguồn gốc tại gan trong huyết thanh được định lượng Sự tăng hoạt độ các enzym này thường gắn liền với độc tính của thuốc do sự hủy hoại tế bào gan [14] Kết quả cho thấy sau 60 ngày uống thuốc thử, hoạt độ AST và ALT trong máu chuột ở lô uống acid gambogic liều 20mg/kg/ngày không có sự khác biệt so với lô chứng Acid gambogic liều 30mg/kg/ngày làm tăng hoạt độ AST và ALT

có ý nghĩa Qi Qi và cộng sự cũng đã chỉ ra độc tính hủy hoại tế bào gan của acid gambogic Acid gambogic liều 120mg/kg/ngày dùng cách ngày làm tăng có ý nghĩa hoạt độ ALT, liều 60mg/kg/ngày và 30mg/kg/ngày dùng cách ngày có xu hướng làm tăng hoạt

độ ALT [12]

Mức tăng hoạt độ enzym của lô dùng thuốc thử so với lô chứng ở cả hai nghiên cứu khoảng 1,3 lần Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả giải phẫu bệnh Các lô uống acid gambogic xuất hiện các tổn thương tế bào gan là các hốc sáng nhỏ, tế bào gan thoái hóa mức độ nhẹ và vừa Tại thời điểm sau 15 ngày ngừng uống thuốc thử, hoạt độ AST trong máu chuột của lô trị 2 không có sự khác biệt so với trước khi uống thuốc thử Như vậy, độc tính trên gan được phục hồi sau khi ngừng thuốc thử

Gan có một hệ thống các enzym chuyển hoá rất phong phú cho quá trình tổng hợp và thoái hoá protein, lipid Gan là cơ quan chính tạo ra albumin, một số globulin và một

số yếu tố đông máu Nguyên nhân chính gây

thay đổi albumin huyết thanh thường do tổn

thương tế bào gan [14] Trong nghiên cứu

này, hàm lượng albumin trong máu của chuột

cống ở 2 lô trị không khác biệt so với lô

chứng, chứng tỏ acid gambogic ở cả hai liều

không làm ảnh hưởng tới khả năng tổng hợp

protein của gan Mặt khác gan còn tham gia

vào quá trình tổng hợp và chuyển hoá lipid

Cholesterol là một thành phần của mật, được

gan tổng hợp, ester hoá và thải ra ngoài Định

lượng cholesterol để đánh giá chức năng

chuyển hoá lipid của gan Nồng độ cholesterol

trong máu của chuột cống ở lô uống thuốc thử

không khác biệt so với lô chứng Gan tạo ra

mật, bài tiết mật vào tá tràng, tham gia vào

quá trình tiêu hoá Xét nghiệm bilirubin trong

máu để thăm dò chức năng bài tiết và chuyển

hoá mật của gan thường chính xác và dễ thực

hiện [13] Trong nghiên cứu, nồng độ bilirubin

toàn phần ở cả hai lô chuột đều không có sự

khác biệt so với lô chứng tại cả hai thời điểm

sau 60 ngày uống thuốc liên tục Điều này cho

thấy acid gambogic không ảnh hưởng đến

chức năng bài tiết và chuyển hoá mật của

gan Kết quả các xét nghiệm đánh giá chức

năng gan trong nghiên cứu tương tự với thử

nghiệm độc tính bán trường diễn của acid

gambogic được tiến hành bởi Qi Qi và cộng

sự [12]

Thận là cơ quan bài tiết của cơ thể Nhu

mô thận rất dễ bị tổn thương bởi các chất nội

sinh và ngoại sinh [13; 14] Khi đưa thuốc vào

cơ thể, phần lớn thuốc được đào thải qua

thận, thuốc có thể gây độc, làm tổn thương

thận, từ đó ảnh hưởng đến chức năng thận

Đánh giá chức năng thận sau khi dùng thuốc,

thường dùng xét nghiệm định lượng creatinin

phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận [14] Kết quả nghiên cứu cho thấy, creatinin trong máu chuột không có sự khác biệt so với

lô chứng Như vậy, acid gambogic không ảnh hưởng đến chức năng lọc của cầu thận Kết quả này tương đồng với kết quả giải phẫu bệnh vi thể thận khi tất cả các mẫu vi thể thận đều bình thường Nghiên cứu của Qi Qi và cộng sự cũng đưa ra kết quả tương tự [12]

V KẾT LUẬN

Thuốc thử acid gambogic liều 20mg/kg/ ngày và 30mg/kg/ngày gây giảm hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu so với lô chứng và làm tăng hoạt độ ALT và AST trong máu chuột sau 60 ngày uống acid gambogic Độc tính trên phục hồi sau 15 ngày ngừng thuốc thử Các chỉ số đánh giá chức năng gan và chức năng thận không có sự khác biệt so với lô chứng

Lời cám ơn

Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ Công thương đã tài trợ kinh phí cho đề tài mã

số CNHD.ĐT 061/15-17

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 D W Ollis, M V J Ramsay, I O Sutherland (1965) The constitution of

gam-bogic acid Tetrahedron, 21(6), 1453 - 1470

2 E.C.Van Meir, C.G.Hadjipanayis, A.D.Norden et al (2010) Exciting New

Ad-vances in Neuro-Oncology: The Avenue to a

Cure for Malignat Glioma A Cancer Journal

for Clinicians, 60, 166 - 193

3 D.Duan, B.Zhang, J.Yao et al (2014)

Gambogic acid induces apoptosis in

hepato-4 L.H.Wang, Y.Li, S.N.Yang et al (2014)

Gambogic acid synergistically potentiates

cis-platin-induced apoptosis in non-small-cell lung

cancer through suppressing NF-κB and

MAPK/HO-1 signalling British Journal of

Can-cer, 110, 341

5 J.Chen, H.Y.Gu, N.Lu et al (2008)

Mi-crotubule depolymerization and

phosphoryla-tion of c-Jun N-terminal kinase-1 and p38

we-re involved in gambogic acid induced cell

cy-cle arrest and apoptosis in human breast

car-cinoma MCF-7 cells Life Sciences, 83, 103

6 M.Thida, D.W.Kim, T.T.T.Tran et al

(2016) Gambogic acid induces apoptotic cell

death in T98G glioma cells Medicinal

Chemis-try Letters, 26, 1097 - 1101

7 H.Z.Zhang, S.Kasibhatla, Y.Wang et al

(2004) Discovery, characterization and SAR

of gambogic acid as a potent apoptosis

in-ducer by a HTS assay Bioorganic & Medicinal

Chemistry, 12, 309 - 317

8 Zhai D., Jin.C., Shiau C et al (2008)

Gambogic acid is an antagonist of

anti-apoptotic Bcl-2-family proteins Molecular

Cancer Therapeutics, 7(6), 1639 - 1646

9 Zhao.L., Guo.Q., You.Q et al (2004)

Gambogic acid induces apoptosis and regu-lates expressions of Bax and Bcl-2 protein in human gastric carcinoma MGC-803 cells

Bio-logical and Pharmaceutical Bulletin, 27(7), 998

-1003

10 Organisation for Economic Co-operation and Development (2008)

Guide-lines for the testing of chemicals repeated dose oral toxicity study in rodents Environ-mental Health and Safety Monograph Series

on Testing and Assesment No 407

11 World Health Organisation (2000)

Working group on the safety and efficacy of herbal medicine, Report of regional office for the western pacific of the World Health Or-ganization

12 Qi Qi, Qidong You, Hongyan Gu et

al (2008) Studies on the toxicity of gambogic

acid in rats Journal of ethnopharmacology,

117, 433 - 438

13 Vũ Đình Vinh (2001) Hướng dẫn sử

dụng các xét nghiệm sinh hoá Nhà xuất bản

Y học, 115 - 287

14 Bộ môn Hoá sinh, Trường Đại học Y

Hà Nội (2001) Hoá sinh Nhà xuất bản Y học,

646 - 685

Summary EVALUATION OF SUBCHRONIC TOXICITY OF GAMBOGIC ACID

IN EXPERIMENTAL ANIMALS

The study investigated to evaluate the subchronic toxixity of gambogic acid in experimental

animals The subchronic toxicity was studied base on guidance of World Health Organization

Gambogic acid was administered orally at dosages of 20 et 30 mg/kg per day in 60 consecutive

days The rats were monitored 15 days after stopping gambogic acid The results from studies

demonstrated that gambogic acid could lead to decrease in levels of hemoglobin, hematocrit,

mean cell volume compared with the controls The AST, ALT values of rats in group treated were

significantly increased compared to that of the animals in the control group After 15 days

with-drawal of gambogic acid, no significant differences were observed for hematological and

bio-chemical parameters between the experimental groups and the control group In addition,

gambo-gic acid did not cause any change in renal and hepatic function tests of experimental rats

Keywords: Gambogic acid, subchronic toxicity, experimental animals