Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm lựa chọn vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 kháng CD20 và xác định khả năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với CD20. Bài viết nghiên cứu nghiên cứu sử dụng phương pháp cắt, gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN plasmid và phương pháp biểu hiện protein (kháng thể) được tiến hành theo Sambrook và CS (2001), phương pháp ELISA và Western blot.
Trang 1150
SÀNG LỌC HỆ VECTOR BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ
Trần Minh Đạo*; Phạm Thu Thùy*; Lê Quang Huấn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: lựa chọn được vector biểu hiện kháng thể scFv-CH 2 và kháng thể tạo ra có khả
năng liên kết với kháng nguyên CD20 Phương pháp: nghiên cứu sử dụng phương pháp cắt,
gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN
plasmid và phương pháp biểu hiện protein (kháng thể) được tiến hành theo Sambrook và CS
(2001), phương pháp ELISA và Western blot Kết quả: gen anti-CD20Fa đã gắn vào 3 vector và
3 vector đều có khả năng biểu hiện scFv-C H 2 Tuy nhiên, vector pET28a biểu hiện kháng thể
scFv-CH2 và kháng thể có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector
pET28a và pET30GB1 Kháng thể scFv-C H 2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên
CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji Kết luận: cả 3 vector
pET28a, pET30GB1 và MPB có khả năng biểu hiện scFv-C H 2 Tuy nhiên, vector pET28a được
lựa chọn làm vector biểu hiện scFv-C H 2 Kháng thể scFv-C H 2 tạo ra có khả năng liên kết với
kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji
* Tõ khãa: Sàng lọc vector; Kháng thể scFv-CH 2; Kháng CD20
Screening Vector System Expressed Anti-CD20 scFv-CH2 Antibody
Summary
Objectives: To screen vector expressing anti- CD20 scFv-C H 2 antibody and this antibody can
associate with anti-CD20 the best Methods: Using the methods of cutting, ligating anti-CD20Fa
gene to 3 expression vector pET28a, pET30GB1, MPB; transformation, plasmid DNA extraction
and protein expression methods (antibody) were carried out according to Sambrook et al (2001)
and ELISA, Western blot method Results: The anti-CD20Fa gene attached to three vectors and
3 vectors have the ability to express CH2 However, the vector pET28a expressed
scFv-C H 2 antibody the best compared to the 2 vector MPB and pET30GB1 scFv-C H 2 antibody can
associate with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B lymphocytes (Raji)
Conclusions: 3 vectors pET28a, pET30GB1 and MPB have the ability to express scFv-C H 2
However, pET28a vector is selected as the expression vector scFv-C H 2 This antibody
potentially associated with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B
lymphocytes (Raji)
* Key words: Vector screening; scFv-C H 2 antibody; Anti-CD20
* Bệnh viện 19.8
** Viện Công nghệ Sinh học
Người phản hồi (Corresponding): Trần Minh Đạo (daohuy2003@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 26/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/01/2015
Ngày bài báo được đăng: 02/03/2015
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng thể scFv đã khắc phục được một số
nhược điểm của kháng thể đơn dòng, như
hạn chế tối đa hiện tượng HAMA (mAb có
nguồn gốc từ chuột khi vào cơ thể do không
tương hợp với hệ miễn dịch của người, khiến
cơ thể sinh ra kháng thể chống lại nó) và kích
thước nhỏ của scFv thuận lợi khi thâm nhập
vào các mô đích [5, 6] Tuy nhiên, scFv lại có
hạn chế như khả năng liên kết với kháng
nguyên và tính nhạy yếu trong phản ứng hóa
miễn dịch (ELISA) [8] scFv có gắn thêm vùng
hằng định kháng thể Fc (CH1, CH2, CH3) đã
khắc phục được hạn chế này, tăng độ bền
của kháng thể và Fc có vai trò quan trọng
trong việc giết chết tế bào trực tiếp thông qua
cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể
(CDC), hoạt hóa tế bào miễn dịch, giết chết tế
bào thông qua cơ chế ADCC và gây chết tế
bào theo chương trình [10]
CD20 là kháng nguyên xuất hiện trên 90%
tế bào lympho B ác tính và xuất hiện khoảng
85 - 90% ở bệnh nhân lympho bào
non-Hodgkin không dễ dàng bị đồng hóa hay biến
dạng khi gắn với kháng thể [3] CD20 là đích
tiềm năng trong liệu pháp điều trị các bệnh liên
quan đến tế bào lympho B ác tính [2, 7]
Hiện nay có một số hệ vector biểu hiện
protein (hay kháng thể) ở E coli như: hệ
vector pET, pDEST, pASK-IBA… Tuy nhiên, phụ
thuộc vào protein đích để lựa chọn hệ vector,
trong đó hệ pET được sử dụng phổ biến nhất
trong biểu hiện protein ở E coli và với cùng
một gen đích thì mỗi vector cũng biểu hiện ở
mức độ khác nhau Vì vậy, nghiên cứu này
được tiến hành nhằm:
- Xác định khả năng liên kết của kháng thể
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
1 Vật liệu nghiờn cứu
- Chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3),
vector biểu hiện pET28a, pET30GB1 (Novagen) và vector MPB do Phòng Công nghệ Tế bào động vật cung cấp Các mồi Fa
và CHR được thiết kế để khuếch đại đoạn gen
chứa trình tự nhận biết của enzym giới hạn
Fa: ATGGGAGCCTGGATCCGTATTATCTC
BamHI
CHR: CAATAGGTGCCTCGAGTGCTTTATAG
XhoI
Enzym BamHI, XhoI và T4-ligase (New England Biolabs) Môi trường nuôi cấy E coli
LB (tryptone, NaCl, cao nấm men và agar đối với môi trường thạch) và các hóa chất khác
sử dụng trong sinh học phân tử và công nghệ gen
2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp cắt, gắn sản phẩm PCR vào vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN plasmid phương pháp biểu hiện protein được tiến hành theo Sambrook và CS (2001) [9] Phản ứng Western blot xác định hoạt tính liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidine Phản ứng ELISA xác định hoạt tính liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20 thương mại (SB) và
Trang 3152
CD20 trên dòng tế bào lympho B ác tính dòng
Raji do Học viện Quân y cung cấp
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Nhân dòng các vector biểu hiện
scFv-C H 2
3 vector (pET28a, pET30GB1; MBP) biểu
hiện được lựa chọn để gắn gen anti-CD20Fa
mã hóa kháng thể scFv-CH2, 3 vector này đã
có sẵn 2 đoạn trình tự gen mã hóa cho 6
histidine ở hai đầu của gen đích sau khi gắn
vào, rất thuận tiện cho việc thu nhận, tinh
sạch và nhận biết kháng thể scFv-CH2
Gen anti-CD20Fa được tinh sạch và thôi gel
theo kit (Hãng QIAGEN), sau đó cắt bằng
BamHI và XhoI Các vector pET28a,
pET30GB1 và MBP cũng được cắt bằng
cách đem gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector
cùng xử lý với BamHI và XhoI Các vector này
được biến nạp vào chủng DH5α nhân lên
lượng lớn
Sử dụng PCR để chọn dòng từ các khuẩn
lạc, chọn 6 khuẩn lạc (mỗi vector tái tổ hợp
lấy 2 khuẩn lạc) để PCR với các cặp mồi
tương ứng (pET28a: T7F/R; pET30GB1:
T7F/R; MBP: Fa/CHR) Khuẩn lạc nào chứa
plasmid tái tổ hợp (pET28a/anti-CD20Fa) và
pET30GB1/anti-CD20Fa), sản phẩm PCR từ
khuẩn lạc đó cho kích thước gần 200 bp của
mồi T7 cộng với kích thước gen anti-CD20Fa
khoảng 1.000 bp xấp xỉ 1.200 bp Khuẩn lạc
chứa plasmid tái tổ hợp (MBP/anti-CD20Fa),
sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đó cho kích
thước bằng với kích thước gen anti-CD20Fa
khoảng 1.000 bp
M: marker ADN; 1, 2: 2 khuẩn lạc chứa
vector MBP; 3, 4: 2 khuẩn lạc chứa vector
pET30GB1; 5, 6: 2 khuẩn lạc chứa vector pET28a
Hai khuẩn lạc chứa vector MBP (đường chạy số 1, 2) có băng kích thước khoảng 1.000 bp, 2 khuẩn lạc chứa vector pET30GB1 (đường chạy số 3, 4) và 2 khuẩn lạc chứa vector pET28a (đường chạy số 5, 6) cùng có băng kích thước ~ 1.200 bp Kết quả này phù hợp với tính toán trên lý thuyết Như vậy, gen
(pET28a, pET30GB1 và MBP)
2 Biểu hiện kháng thể scFv-C H 2 trong hệ vector
3 plasmid tái tổ hợp (pET28a/anti-CD20Fa, pET30GB1/anti-CD20Fa và MBP/anti-CD20Fa) được biến nạp vào tế
bào E coli BL21, nuôi biểu hiện ở 37oC trong
4 giờ có bổ sung Ka (50 µg/ml) và chất cảm ứng IPTG (0,5 mM)
Các mẫu cảm ứng IPTG (đường chạy số 2; 4; 6) xuất hiện một băng protein mới có kích thước tương ứng (pET28a: ~ 43 kDa; pET30GB1: ~ 50 kDa; MBP: ~ 85 kDa), còn ở mẫu không cảm ứng (đường chạy số 1; 3; 5) không thấy xuất hiện các băng này Các băng protein xuất hiện mới này khả năng là protein tái tổ hợp đích cần biểu hiện Như vậy, các vector tái tổ hợp đều có khả năng biểu hiện kháng thể tái tổ hợp đích
Trang 4Hình 2: Ảnh điện di biểu hiện gen mã hóa
scFv-CH2 trong 3 vector
M: marker; pET28a (1: Trước cảm ứng; 2:
Sau cảm ứng) pET30GB1 (3: Trước cảm ứng;
4 : Sau cảm ứng) MBP (5: Trước cảm ứng; 6:
Sau cảm ứng)
2 Chọn vector biểu hiện scFv-C H 2
Các vector đều có khả năng biểu hiện
protein tái tổ hợp Tuy nhiên, để lựa chọn
vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 có hàm
lượng cao nhất, cần tiến hành phản ứng
Western blot
kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector biểu hiện
M: Marker protein; 1: pET28a; 2:
pET30GB1; 3, 4: MBP
Theo thiết kế, scFv-CH2 tái tổ hợp gắn thêm 6 histidine ở 2 đầu Dựa vào đặc điểm này, có thể xác định hoạt tính liên kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng hợp kháng đuôi histidie
Vector pET28a (đường số 1) và vector pET30GB1 (đường số 2) xuất hiện băng kích thước nằm trong khoảng 40 - 55 kDa Tuy nhiên, kích thước protein của đường số 1 (~
43 kDa) thấp hơn và xuất hiện đậm hơn đường số 2 (~ 50 kDa), vector MBP (đường
số 3, 4) không xuất hiện băng kích thước ~ 85 kDa theo tính toán lý thuyết
Như vậy, kháng thể tái tổ hợp từ vector pET28a có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector MBP, pET30GB1 Mặt khác, kháng thể tạo ra từ pET28a không gắn đoạn protein dung hợp nên sau khi tinh sạch protein này không phải loại bỏ phần protein dung hợp mà vẫn tiến hành ngay nghiên cứu về chẩn đoán bệnh Sau khi sơ bộ kiểm tra khả năng biểu hiện
và xác định hoạt tính của kháng thể bằng phản ứng Western blot, chúng tôi thấy vector tái tổ hợp pET28a/anti-CD20Fa biểu hiện tốt
và có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector pET30GB1/anti-CD20Fa và MBP/anti-pET30GB1/anti-CD20Fa Vì vậy, pET28a được lựa chọn làm vector biểu hiện
gen anti-CD20Fa
với CD20:
Một số nhà khoa học đã sử dụng phương pháp ELISA để xác định khả năng liên kết của kháng thể kháng CD20 tạo ra với CD20 trên
tế bào lympho B ác tính dòng Raji hay dòng Daudi như Anna [1], Geng [4] và Fang [2]
Trang 5154
Tương tự, chúng tôi xác định khả năng liên
kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20
bằng ELISA cạnh tranh Phản ứng ELISA
gồm scFv-CH2, kháng nguyên CD20 tái tổ
hợp thương mại (SB) và tế bào ung thư máu
dòng lympho B có biểu hiện CD20 (Raji) do
Học viện Quân y cung cấp
A
B
quả ELISA xác định khả năng liên kết của
kháng thể scFv-CH2 với CD20
A: Hình ảnh các tế bào lympho B biểu hiện
CD20 ác tính dưới kính hiển vi điện tử (độ
phóng đại 400 lần)
B: Biểu đồ kết quả ELISA xác định khả
năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với
kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 trên
tế bào lympho B (Raji) TN1 - TN6: Thí nghiệm 1 - thí nghiệm 6
Kết quả ELISA cạnh tranh cho thấy, thí nghiệm 2 và 6 không có kháng thể scFv-CH2 xuất hiện màu và có giá trị OD450nm tương ứng là 0,185 và 0,165 Các thí nghiệm 1, 5 (TN1, TN5)
có kháng thể scFv-CH2 không xuất hiện màu
nghiệm đối chứng (TN3 và TN4) cũng không xuất hiện màu (OD450nm tương ứng là 0,056 và 0,061) thấp hơn nhiều thí nghiệm 2 và 6 Như vậy, qua phản ứng ELISA có thể khẳng định kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 trên tế bào lympho B ác tính dòng Raji
Kết quả của chúng tôi tương tự nghiên cứu của Anna, Geng và Fang đã tạo được kháng thể tái tổ hợp dạng scFv-Fc và scFv-LDP kháng CD20, kháng thể này có hoạt tính liên kết với CD20 Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, gen mã hóa scFv được tách dòng từ ARN của tủy gà đã gây miễn dịch với CD20, gen mã hóa scFv-CH2 được gắn vào vector biểu hiện pET28a ScFv-CH2 có khối lượng ~ 43 kDa
được biểu hiện ở E coli (BL21), tinh sạch trên
cột sắc ký ái lực Ni2+, có khả năng liên kết với CD20 thương mại (SB) và CD20 trên dòng tế bào Raji
KẾT LUẬN
Gen anti-CD20Fa mã hóa cho kháng thể scFv-CH2 đã gắn vào 3 vector biểu hiện Cả
3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1 và MBP có khả năng biểu hiện kháng thể
scFv-CH2 Vector pET28a được lựa chọn làm vector biểu hiện scFv-CH2
Giá trị OD
Trang 6Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng
liên kết đặc hiệu với kháng nguyên CD20
thương mại và CD20 trên tế bào lympho B ác
tính dòng Raji
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Anna M.W, Giselle J.T, Mark A.S Clarke P,
Olafsen T, Stephen J.F, and Andrew A.R
Multimerzation of a chimeric anti-CD20
single-chain Fv-Fc fusion protein is mediated through
variable domain exchange Protein Engineering
2001, 14(12), pp.1025-1033
2 Fang Hong, Miao Qing Fang, Zhang
ShengHua, Cheng Xin, Xiong DongSheng, Zhen
YongSu Antitumor effects of an engineered
and energized fusion protein consisting of an
anti-CD20 scFv fragment and lidamycin Life
Sciences China 2011, 54 (3), pp.255-262
3 Fisher R.I Overview of non-Hodgkin's
lymphoma: biology, staging, and treatment
Seminars in Oncology 2003, 30 (2 - 4), pp.3-9
4 Geng S, Feng J, Li Y, Sun Y, Gu X, Huang Y,
Wang Y, Kang X, Chang H, and Shen B Binding
activity difference of anti-CD20 scFv-Fc fusion
protein derived from variable domain exchange
Cellular and Molecular Immunology 2006, 3 (6),
pp.439-443
5 Hagemeyer C.E, Muhlen C.V, Elverfeldt D.V, Peter K Single-chain antibodies as diagnostic
tools and therapeutic agents Thrombosis and Haemostasis 2009, 101, pp.1012-1019
6 Kipriyanov S.M, Moldenhauer G, Schuhmacher J, Cochlovius B , Vonder Lieth C.W ,
Matys E.R , Little M Bispecific tandem diabody for
tumor therapy with improved antigen binding and pharmacokinetics Molecular Biology 1999,
293 (1), pp.41-56
7 Lim SH, Beers SA, French RR, Johnson PWM, GlennieMJ and Cragg MS Anti-CD20 monoclonal antibodies: historical and future perspectives Haematologica 2010, 95, pp.135-143
8 Reff M.E, Heard C A review of modifications
to recombinant antibodies: attempt to increase efficacy in oncology applications Critical Reviews
in Oncology Hematology 2001, 40, pp.25-35
9 Sambrook J, Russell D.W Molecular cloning
A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 2001
10 Scott A.M, Allison J.P and Wolchok J.D
Monoclonal antibodies in cancer therapy Cancer Immunity 2012, 12, pp.1-8