Mối liên quan giữa mức độ sao chép gen activation induced cytidine deaminase và tỷ lệ đột biến gen P53 ở mô ung thư gan

Bài viết trình bày nghiên cứu đánh giá mức độ sao chép của AID mô ung thư gan và xác định tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan; so sánh mức độ sao chép của AID và tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô ung thư gan.

MỐI LIÊN QUAN GIỮA MỨC ĐỘ SAO CHÉP GEN ACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE VÀ TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN P53

Ở MÔ UNG THƯ GAN

Lê Thị Thúy 1

, Trần Huy Thịnh 1

, Ôn Quang Phóng 2 , Trần Vân Khánh 1

, Tạ Thành Văn 1

1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2 Bệnh viện Xanh Pôn Activation Induced cytidine Deaminase (AID) là một trong những tác nhân gây đột biến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng Các nghiên cứu gần đây cho thấy gen p53 liên quan đến

sự ổn định của bộ gen tế bào kiểm soát sự phát sinh và phát triển của khối u Nghiên cứu này tiến hành phân tích mối liên quan giữa mức độ phiên mã gen AID và tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô ung thư gan Kết quả nghiên cứu cho thấy: (1) Tỷ lệ mức độ sao chép gen AID/ß actin trên mô ung thư gan là 11,09 ± 4,7; trên mô xơ gan là 7,87 ± 1,97 và trên mô gan viêm là 2,18 ± 0,75 (2) Tỷ lệ đột biến gen p53 cao nhất tại mô ung thư gan (17,8%), tại xơ gan là 2,2% và không phát hiện đột biến gen p53 tại mô gan viêm (3) Tỷ lệ mức

độ sao chép gen AID/ß actin tại mô gan có đột biến gen p53 là 9,36 ± 3,13 và tại mô gan không có đột biến gen p53 là 9,39 ± 5,30 Kết quả trên cho thấy mức độ sao chép gen AID trên mô ung thư gan cao hơn trên

mô xơ gan và cao hơn rõ rệt so với mô gan viêm Tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô gan ung thư cao hơn so với

mô gan không ung thư Tuy nhiên chưa thấy sự khác biệt về mức độ sao chép gen AID trên mô gan có và không có đột biến gen p53

Từ khóa: activation Induced cytidine deaminase (AID), gen p53, ung thư gan

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Quá trình phát sinh ung thư là quá trình liên quan đến sự tích lũy đột biến trên những gen chi phối sự tăng sinh và chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Mặc dù những bằng chứng phân tử liên quan trực tiếp đến quá trình phát sinh và phát triển ung thư tế bào gan chưa được rõ ràng, nhưng các nhà khoa học cho rằng sự biến đổi liên tục của hệ gen là nguyên nhân của quá trình phát sinh ung thư gan Theo nghiên cứu của dịch tể học thì hầu hết ung thư gan khởi phát trên bệnh lý viêm gan mạn tính và xơ gan

AID là enzym xúc tác sự loại bỏ gốc amin của cytidin (C) để tạo uracil (U) Gen AID là một gen then chốt quy định tính đa dạng của kháng thể thông qua hai quá trình: siêu đột biến (somatic hypermutation) và tái tổ hợp gen kháng thể (class switch recombination) Khi gen AID bị đột biến gây ra hội chứng suy giảm

miễn dịch, tăng IgM2 bẩm sinh ở người [8] Mặt khác, ở tế bào không có thẩm quyền miễn dịch, sự tăng cường tổng hợp enzym AID gây nên hiện tượng chuyển đoạn nhiễm sắc thể, tích lũy đột biến khởi đầu cho quá trình ung thư hóa tế bào lành Với vai trò quyết định trong quá trình siêu đột biến, AID được xem như một tác nhân gây đột biến nội sinh khi quá trình kiểm soát sự biểu hiện AID bị mất cân bằng Khi đó dưới tác động của các yếu

tố hoạt hoá, AID sẽ tác động trực tiếp lên các gen kháng ung thư, từng bước làm bất hoạt

và mất chức năng kháng ung thư của các gen

đó và tích lũy đột biến [7; 9; 10]

Gen ức chế ung thư p53 là một gen tiêu

cho quá trình ngăn chặn sự phát triển tế bào bất thường nhằm duy trì sự ổn định của bộ gen sau những tổn thương di truyền của tế bào Nghiên cứu gần đây đã cho thấy sự biểu hiện bất thường AID ở tế bào gan có thể tạo

ra đột biến DNA, dẫn đến sự tích lũy đột biến

làm biến đổi gen p53 góp phần vào quá trình

phát sinh khối u [7, 9]

Để chứng minh vai trò của AID trong quá

trình phát sinh và phát triển ung thư tế bào

gan ở người, nghiên cứu này được thực hiện

với mục tiêu: (1) Đánh giá mức độ sao chép

của AID ở mô ung thư gan, (2) Xác định tỷ lệ

đột biến gen p53 ở mô ung thư gan, (3) So

sánh mức độ sao chép của AID và tỷ lệ đột

biến gen p53 ở mô ung thư gan

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng

- Mẫu nghiên cứu: 5 mẫu mô gan viêm, 10

mẫu mô xơ gan và 30 mẫu mô ung thư gan

- Mẫu chứng: các mẫu mô lành được lấy

tại vị trí cách khối u, tổ chức xơ hoặc viêm

5cm với số lượng tương đương với mẫu

nghiên cứu

Toàn bộ các mẫu nghiên cứu được chẩn

đoán mô bệnh học tại bệnh viện Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh

2 Phương pháp

2.1 Xác định mức độ sao chép gen AID

ở mô gan

- Real time- PCR khuếch đại gen mã hóa AID và ß actin ở mô gan: RNA tổng số được

tách chiết, mức độ sao chép của gen AID ở

mô gan được định lượng đối chiếu với gen nội chuẩn ß actin

Real time - PCR xác định chu kỳ ngưỡng của gen AID và chu kỳ ngưỡng của gen ß

định lượng tương đối mức độ sao chép các gen tại mô bệnh (mô tại vị trí khối u) và mô lành (mô cách vị trí khối u 5cm) [4]

Tỷ lệ sao chép gen AID ở mô ung thư dạ dày so với mô lành cách vị trí khối u là R =

Kỹ thuật Real time - PCR định lượng với cặp mồi và đầu dò đặc hiệu như sau:

Thành phần của phản ứng PCR: 1 x Ex-Taq buffer: 2µl; 2,5 mM dNTP: 2µl; Ex Taq

poly-merase: 0,2µl; 10 pmol Primer: 1µl; 10 pmol Taqman probe: 1µl; cDNA 150 ng/ml: 2µl; nước cất:

11,8µl.Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

940C - 5 phút

940C - 50 giây

580C - 50 giây

720C - 50 giây

150C - 5 phút Thí nghiệm được tiến hành 3 lần cho mỗi mẫu

25 chu kỳ

Quy trình được thực hiện trên hệ thống Realtime PCR của hãng Eppendorf

2.2 Xác định đột biến gen p53

- Tách chiết DNA và xác định đột biến:

exon 7 của gen p53 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu có trình

tự như sau:

P53-F: 5’- CTTGCCACAGGTCTCCCCAA - 3’;

P53-R: 5’- AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA - 3’

Sản phẩm PCR của exon 7 được cắt bằng enzym HaeIII Những trường hợp phát hiện có đột biến bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn sẽ được kiểm tra kết quả bằng kỹ thuật giải trình

tự gen trên hệ thống máy ABI của Hoa Kỳ

2.3 Xử lý số liệu: Xử lý số liệu theo phần

mềm SPSS 16.0

III KẾT QUẢ

1 Đặc điểm bệnh nhân

- Tu ổi: tuổi trung bình của nhóm nghiên

cứu là 54,3 ± 13,0 Tuổi ít nhất là 23, tuổi cao nhất là 80 Tuổi trung bình của nhóm viêm gan

là 50,4 ± 8,3, của nhóm xơ gan là 58,7 ± 12,2

và của nhóm ung thư gan là 58,7 ± 12,2 Tuổi

ở các nhóm không có sự khác biệt (p > 0,05)

- Giới tính: nam chiếm 71,1% và nữ chiếm 28,9%

2 Mức độ sao chép của gen AID ở mô gan

Bảng 1 Sao chép gen AID ở mô gan viêm, xơ gan và ung thư gan

p 1-3 < 0,05

p 2-3 < 0,05

p 1-2 < 0,05

p1-3: gan viêm – ung thư gan p2-3: xơ gan – ung thư gan p1-2: gan viêm – xơ gan

- Tỷ lệ sao chép gen AID/ß actin ở mô ung thư gan so với mô lành (cách khối u 5cm) là 11,09

± 4,73, trên mô gan viêm so với mô lành (cách khối viêm 5cm) là 2,18 ± 0,75 và trên mô xơ gan

so với mô lành (cách khối xơ 5cm) là 7,87 ± 1,97

- Tỷ lệ sao chép gen AID/ß actin ở mô ung thư gan, mô xơ gan cao hơn rõ so với mô gan viêm (p < 0,05)

3 Tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô gan

Bảng 2 Tỷ lệ gen p53 đột biến trên mô gan

(n = 5)

Xơ gan (n = 10)

Ung thư gan (n = 30)

p > 0,05

Bảng 3 Tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô ung thư gan và không ung thư gan

- Không phát hiện được đột biến gen p53 ở 5 mô gan viêm; một trường hợp đột biến gen p53

ở nhóm mô xơ gan, nhiều nhất là 8 trường hợp đột biến gen p53 ở nhóm mô ung thư gan

(p > 0,05)

- Khi so sánh giữa 2 nhóm ung thư gan và không ung thư (bao gồm gan viêm và xơ gan) cho

thấy tỷ lệ đột biến gen p53 trên mô ung thư cao hơn so với mô không ung thư Sự khác biệt này

có ý nghĩa thống kê với p < 0,05

4 Mức độ sao chép AID tại mô gan có đột biến gen p53 so với mô gan không có đột

biến gen p53

Bảng 4 Mức độ sao chép gen AID ở mô gan có và không có đột biến gen p53

p > 0,05

Tỷ lệ sao chép gen AID/ß actin trên mô gan có đột biến gen p53 là 9,36 ± 3,13, trên mô gan

không có đột biến gen p53 là 9,39 ± 5,3 Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với

p > 0,05

(n 1 = 15)

Ung thư gan (n 2 = 30)

p < 0,05

IV BÀN LUẬN

Ung thư gan nguyên phát là một trong 5

loại ung thư thường gặp Việt Nam là quốc gia

có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan đứng

hàng thứ 3 trên thế giới [1] Đặc biệt, tỷ lệ nam

mắc bệnh nhiều hơn nữ Theo “ghi nhận ung

thư quần thể” tại thành phố Hồ Chí Minh 2006,

ung thư gan đứng hàng thứ 1 ở nam giới với

tần suất là 24,2/100.000 dân và đứng hàng

thứ 5 ở nữ giới với tần suất là 6,2/100.000

dân Tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM, mỗi

năm tiếp nhận khoảng 500 ca ung thư gan

mới Trong những năm gần đây, mỗi năm,

Việt Nam có đến 10.000 ca mắc bệnh mới, và

trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu thế giới [1]

Nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan ở nam giới là 71,1% và ở nữ giới là 28,9%, tỷ lệ mắc bệnh ở nam gấp khoảng 2.5 lần ở nữ với p > 0,05 Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê có thể là do số lượng bệnh nhân nghiên cứu ít nên chưa thể kết luận được mối liên quan giữa giới tính và ung thư gan Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Chen C.J và cộng sự phát hiện tỷ lệ mắc ung thư gan của nam gấp 2,4 lần của nữ [2]

Tuổi trung bình của nhóm nghiên cứu là 54,3 ± 13,0, tuổi thấp nhất là 23 và cao nhất là

80 Tuổi trung bình của nhóm viêm gan là 50,4

± 8,3, nhóm xơ gan là 58,7 ± 12,2 và nhóm ung thư gan là 58,7 ± 12,2 Tuổi ở các nhóm không có sự khác biệt (p > 0,05), kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu khác (tuổi thường gặp của ung thư gan là từ 40 ÷ 60) [2]

Gen p53 là một gen có kích thước lớn và các nghiên cứu trên thế giới cho thấy đột biến hay gặp nhất của gen p53 ở exon 7, vị trí 249 [8] Do vậy, nghiên cứu này chỉ khảo sát đột biến gen p53 tại exon 7, đặc biệt là đột biến điểm tại vị trí 249 (AGG → AGT,), đột biến này gây ra biến đổi acid amin serin thành arginin (249ser) Kết quả nghiên cứu cho thấy: không

có đột biến gen p53 được phát hiện ở nhóm

mô viêm gan; ở nhóm mô xơ gan phát hiện được một trường hợp đột biến (2,2%) và ở nhóm mô ung thư gan phát hiện được 8 trường hợp đột biến gen p53 (17,8%) Khi so sánh giữa 2 nhóm mô ung thư gan và nhóm

mô không ung thư gan (mô viêm gan và mô

xơ gan) cho thấy tỷ lệ đột biến gen p53 trên

mô gan ung thư cao hơn so với mô gan không ung thư, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Theo Kirk và cộng sự, tần suất xuất hiện đột biến gen p53 là 26,7% và tương đương với kết quả thu được trong nghiên cứu này là 26,0%) Như vậy, từ các kết quả nghiên cứu thấy rằng đột biến gen p53 có thể đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ung thư gan [3]

Hiện nay việc chẩn đoán sớm ung thư gan vẫn đang là một thách thức đối với ngành y tế

Chẩn đoán ung thư gan hầu hết được thực hiện trên những bệnh nhân đã ở giai đoạn muộn làm hạn chế khả năng điều trị Do vậy, việc tìm ra các dấu ấn phân tử nhằm chẩn đoán sớm và chẩn đoán xác định đang là hướng đi được các nhà khoa học quan tâm

Trong đó AID được coi là một trong những dấu ấn nhiều triển vọng

Kết quả nghiên cứu cho thấy: mức độ sao chép gen AID trên mô ung thư gan so với mô lành (cách khối u 5cm) là 11,09 ± 4,73 và trên

mô gan viêm so với mô lành (cách khối viêm 5cm) là 2,18 ± 0,75 (p < 0,05) Trong khi đó mức độ sao chép gen AID trên mô xơ gan so với mô lành (cách khối xơ 5cm) là 7,87 ± 1,97 (p > 0,05) Tadayuki Kou và cộng sự nghiên cứu in vitro sử dụng dòng tế bào gan người nuôi cấy cũng cho thấy sự gia tăng biểu hiện AID ở mức độ mRNA ở tế bào gan viêm mạn

là 38,7 ± 10,0 và tế bào ung thư gan là 78,1 ± 21,0 [10]

Nghiên cứu này cũng cho thấy không có

sự khác biệt giữa mức độ sao chép gen AID/ß actin ở mô gan có đột biến gen p53 là 9,36 ±

9,39 ± 5,3 Kết quả này khác với các kết quả

thu được từ nghiên cứu in vitro sử dụng dòng

tế bào nuôi cấy của các tác giả khác Điều này

có thể được lý giải do sự không đồng nhất của các mô nghiên cứu và mức độ phong phú của các dòng tế bào và tỷ lệ khác nhau về số lượng các tế bào ung thư/các tế bào lành Thêm vào đó, sự khác biệt nàycũng có thể do nghiên cứu này chỉ khảo sát đột biến gen p53 tại điểm hospot (điểm 249 của exon 7)

Thành công của can thiệp điều trị ung thư gan nguyên phát phụ thuộc rất nhiều vào thời gian phát hiện bệnh sớm hay muộn Tại Việt Nam, các kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng ngày càng nhiều vào chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh lý gây ra do

vi sinh vật, tổn thương di truyền đặc biệt là các bệnh lý do HBV, HCV, HIV Tuy nhiên, trong lĩnh vực ung thư, chưa có nghiên cứu

áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh được công bố Bởi vậy, nghiên cứu này bước đầu cung cấp những bằng chứng khoa học giá trị nhằm góp phần làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh

trong ung thư gan nguyên phát, mở ra triển

vọng trong nghiên cứu chẩn đoán và điều trị

trúng đích bệnh lý nan giải này

V KẾT LUẬN

Mức đô sao chép gen AID ở mô ung thư

gan, mô xơ gan cao hơn rõ so với mô gan

viêm (p < 0,05) và mức độ sao chép gen AID

ở mô ung thư gan cao hơn mô xơ gan

Tỷ lệ đột biến gen p53 ở mô gan ung thư

cao hơn so với mô gan không ung thư

(p < 0,05)

Chưa phát hiện thấy sự khác biệt giữa

mức độ sao chép gen AID ở mô gan có đột

biến gen p53 và mô gan không có đột biến

gen p53 (p > 0,05)

Kết quả nghiên cứu này gợi ý về vai trò

của sự tăng biểu hiện AID làm tăng nhạy cảm

của tế bào đối với đột biến gen, dẫn đến sự

phát triển của quá trình ung thư hóa tế bào

gan trên nền tảng bệnh lý tế bào gan mạn tính

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Bá Đức,

Nguyễn Mạnh Quốc (2001) Một số đặc điểm

dịch tễ học bệnh ung thư dạ dày ở Việt nam

Tài liệu Hội thảo lần 2 – Trung tâm hợp tác

nghiên cứu của Tổ chức y tế thế giới về ung thư

dạ dày, Bộ Y tế - Tổ chức Y tế Thế giới, 1 – 6

2 Chen C.J., Yu M.W., Liaw Y.F (1997)

factors of hepatocellular carcinoma Biological

Sciences, 294 – 308

3 Kirk GD, Lesi OA, Mendy M, et al

(2005) 249(ser) TP53 mutation in plasma

DNA, hepatitis B viral infection, and risk of

hepatocellular carcinoma Oncogene; 24 (38):

5858 - 5867

4 Livak KJ, Schmittgen TD (2001)

Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) method Method ; 25: 402-8

5 Muramatsu, M., V.S Sankaranand, S

Anant et al (1999) Specific expression of

ac-tivation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells The Journal

of biological chemistry 274: 18470-18476

6 Muto, T., I.M Okazaki, S Yamada, Y

Tanaka, et al (2006) Negative regulation of

activation-induced cytidine deaminase in B cells Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103:

2752 - 2757

7 Okazaki, I.M., A Kotani, and T Honjo (2007) Role of AID in tumorigenesis

Ad-vances in immunology 94: 245 - 273

8 Revy, P., T Muto, Levy, F

Geissmann, et al (2000) Activation-induced

cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2) Cell: 102, 565-575

9 Ta, Van Thanh., H Nagaoka, N Cata-lan, et al (2003) AID mutant analyses indicate

requirement for class-switch-specific cofac-tors Nature immunology 4: 843 - 848

10 Tadayuki Kou 1, Hiroyuki Marusawa, Kazuo Kinoshita, et al (2006) Expression of

activation-induced cytidine deaminase in hu-man hepatocytes during hepatocarcinogene-sis Cancer: 120, 469 - 476

Summary RELATIONSHIP BETWEEN LEVEL OF ACTIVATION INDUCED CYTIDINE DEAMINASE TRANSCRIPTION AND P53 MUTATION

IN LIVER CARCINOMA TISSUES

Activation Induced cytidine Deaminase (AID) has been shown as an endogenous mutator

when its expression was not controlled AID acts directly on the tumor suppressor genes by accu-mulating mutations gradually resulted in inactivation and loss of their function p53 is a frequent target for genetic alteration in various human malignancies The aim of this study was to examine

the involvement of AID in the development of human HCC The results indicated that: (1) AID/ß

actin transcriptional ratio in the liver cancer tissues and in the liver cirrhosis tissue were 11.09 ± 4.73 and 7.87 ± 1.97, while and AID/ß actin ratio in the chronic hepatitis tissue was 2.18 ± 0.75, respectively (2) Subsequently, mutation frequency in p53 gene from liver cancer tissue, liver cir-rhosis tissue were 17.8%, and 2.2% and no detected in the chronic hepatitis tissues (3) AID tran-criptional ratio with p53 gene mutation in the liver tissue is 9.36 ± 3.13, AID trantran-criptional ratio with

no p53 gene mutation in the liver tissue is 9.39 ± 5.3 ( p < 0.05) Taken together, our results

indi-cated that AID upregulation in the enhancement of genetic susceptibility to mutagenesis, leading

to the development of HCC in the setting of chronic liver Howerver, no significant difference was found in AID transcripts in mutated and non-mutated p53 gene

Key words: Activation Induced cytidine Deaminase (AID), p53, liver cancer

PHÂN TÍCH NHIỄM SẮC THỂ Ở BA GIA ĐÌNH SINH CON DOWN

LIÊN TIẾP VỚI KIỂU GEN NGƯỜI MẸ THỂ KHẢM

Nguyễn Văn Rực

Trường Đại học Y Hà Nội Hội chứng Down (trisomi 21) hay gặp nhất trong các hội chứng có liên quan đến rối loạn nhiễm sắc thể

và chiếm tỷ lệ 1/600-1/800 ở trẻ sơ sinh còn sống Mục tiêu của nghiên cứu nhằm phân tích nhiễm sắc thể (NST) của trẻ Down và nhiễm sắc thể của bố mẹ và tư vấn về nguy cơ sinh sản ở những cặp bố mẹ này Kết quả nghiên cứu cho thấy 3 người bố có karyotyp bình thường (46, XY), 2 người mẹ thể khảm: 47,XX,+21 [3%]/46,XX[97%], 1 người mẹ thể khảm: 47,XX,+21[4%]/46,XX[96%] Các con Down có karyotyp: 47,XY,+21 Từ kết quả trên có thể thấy, các cặp bố mẹ này cần được tư vấn về nguy cơ sinh sản

Từ khóa: hội chứng Down, thể khảm

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay với phương pháp nuôi cấy mô và

kỹ thuật nhuộm tiêu bản, đặc biệt là kỹ thuật nhuộm băng G ngày càng phát triển và cải tiến không ngừng đã cho phép các nhà di

truyền học phát hiện được các rối loạn nhiễm sắc thể (NST) về số lượng và cấu trúc Hội chứng Down (trisomi 21) hay gặp nhất trong các hội chứng có liên quan đến rối loạn NST

và chiếm tỷ lệ 1/600-1/800 ở trẻ sơ sinh còn sống [4, 6] Một trong những nguyên nhân gây