Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase

Bài viết Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase trình bày Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2,... Mời các bạn cùng tham khảo.

patients of Mediterranean descent with Wilson

disease, identification of 19 novel mutations , J

Med Genet, 36(11), 833 - 836

12 Rossi E, Olynyk JK, Cullen DJ et al

(2000) Compound heterozygous

hemochro-matosis genotype predicts increased iron and

erythrocyte indices in women, Clinical

Chemis-try, 46 (2), 162 - 166

Summary MUTATION ANALYSIS OF ATP7B GENE IN

WILSON DISEASE FAMILY

Wilson disease an autosomal recessive disorder of copper metabolism caused by mutations in the ATP7B gene that encodes a P-type copper transporting ATPase The aim of this study was to screen and detect mutations of the ATP7B gene in a Wilson disease famlily (n = 6) Mutations were screened and detected by DNA sequencing in 21 exon of ATP7B gene The results showed that 6/6 patients had 2 different heterozygous mutations including: ins47_48CGGCG in exon 1 and p.V456L in exon 3 of ATP7B gene

Keywords:

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN VÀ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH

THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE

Ngô Thị Thu Hương 1 , Trần Vân Khánh 1 , Nguyễn Viết Tiến 2 ,

Nguyễn Phú Đạt 1 , Tạ Thành Văn 1

1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2 Bệnh viện Phụ sản Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2 Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: (1) xác định đột biến gen trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh nhân Nghiên cứu được tiến hành trên 33 bệnh nhân và 78 thành viên thuộc 33 gia đình của những bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh; Kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA được sử dụng để xác định đột biến và người lành mang gen bệnh Kết quả cho thấy đối với nhóm bệnh nhân, 33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến với 7 dạng đột biến khác nhau, trong đó đột biến 656 A/C > G (IVS2-13A/C > G) chiếm tỉ lệ cao nhất 13/33 (39,5%), tiếp theo là đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ 7/33 (21,2%); đối với nhóm người lành mang gen bệnh, 32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12 thành viên gia đình khác (anh, chị, em) được xác định là người lành mang gen bệnh Kết quả thu được là cơ sở di truyền quan trọng cho chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh và có phác đồ điều trị sớm cho các thai nhi ngay từ những tuần đầu

Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến gen CYP21A2, người lành mang gen bệnh

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Tăng sản thượng thận bẩm sinh

(congenital adrenal hyperplasia - TSTTBS) thể

thiếu enzym 21 - hydroxylase là bệnh di truyền

lặn trên nhiễm sắc thể số 6 Bệnh gây nên do

đột biến gen CYP21A2 làm rối loạn quá trình

sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận, gây

bệnh cảnh lâm sàng là cơn suy thượng thận

cấp hoặc nam hóa ở trẻ gái, dậy thì sớm giả ở

trẻ trai [1, 2]

Cho đến nay, rất nhiều dạng đột biến đã

được phát hiện như đột biến mất đoạn, đột

biến chuyển đoạn, đột biến lặp đoạn, đột biến

điểm; trong đó đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao

nhất [3] Bệnh có thể dự phòng bằng phương

pháp tư vấn di truyền như phát hiện người

lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước sinh

Nghiên cứu của Lee và cộng sự ước tính tỷ lệ

người lành mang gen bệnh tăng sản thượng

thận bẩm sinh là 1/83 đối với quần thể người

Trung Quốc [3] Các báo cáo khác trên thế

giới cho thấy tỷ lệ chung người lành mang gen

bệnh là 1/55 [4, 5] Ở Việt Nam, khoa Nội tiết

- Chuyển hóa - Di truyền, bệnh viện Nhi Trung

ương là một trong những nơi đang quản lí số

lượng lớn nhất bệnh nhân mắc tăng sản

thượng thận bẩm sinh với khoảng trên 600

bệnh nhân Tuy nhiên, chưa có một nghiên

cứu nào toàn diện về phát hiện đột biến gen

trên bệnh nhân và phát hiện người lành mang

gen bệnh Việc phát hiện đột biến và phát hiện

người lành mang gen bệnh sẽ giúp khẳng

định chẩn đoán và cho phép điều trị sớm,

phòng tránh cơn suy thượng thận cấp trong

các trường hợp xét nghiệm về hormon không

rõ rang; tư vấn tiền hôn nhân nhằm giảm trẻ sinh ra bị mắc bệnh và chẩn đoán và điều trị trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng

và làm giảm nam hóa chuyển giới gây mơ hồ giới tính sau sinh Xuất phát từ ý nghĩa thực

tiễn trên, đề tài được thực hiện với mục tiêu:

(1) xác định đột biến gen trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt en-zym 21- hydroxylase, (2) phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình

có quan hệ huyết thống với bệnh nhân

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng

33 bệnh nhân và 78 thành viên thuộc 33

gia đình của những bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase bao gồm: bố, mẹ và anh, chị, em ruột của bệnh nhân Các bệnh nhân đang được theo dõi và điều trị tại khoa Nội tiết - Chuyển hóa

- Di truyền bệnh viện Nhi Trung ương

2 Phương pháp

2.1 Kỹ thuật tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform Tất

cả mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng độ và

độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị OD 260/280 1.8 - 2 được sử dụng để phân tích gen [6]

2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen

Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuyếch đại gen CYP21A2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 900 - 10 giây, [980 - 10 giây,

550 - 15 giây, 720 - 2 phút] x 30 chu kỳ

Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự trên máy ABI - 3100 tại trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y

Hà Nội Kết quả được phân tích bằng phần mềm CLC và so sánh kết quả phân tích gen

Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn - Trường Đại học Y Hà Nội

Số 1 Tôn Thất Tùng, Đống Đa, Hà Nội

Email: tathanhvan@hmu.edu.vn

Ngày nhận: 04/03/2013

Ngày được chấp thuận: 26/4/2013

của bệnh nhân với kết quả phân tích gen của các thành viên gia đình

2.3 Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification)

Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland)

để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh nhân và người lành mang gen bệnh Thành phần của kit gồm các probe để khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi probe tương ứng với một vùng gen, ngoài ra còn có các probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng

để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính Sản phẩm khuếch đại được điện di mao quản trên máy giải trình tự Số lượng sản phẩm khuếch đại

của mỗi probe tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó

thực hiện theo đúng yêu cầu đạo đức trong nghiên cứu

III KẾT QUẢ

Bằng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA, 33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện

có đột biến gen CYP21A2, với 7 dạng đột biến khác nhau Đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/

C > G) chiếm tỷ lệ cao nhất là 13/33 (39,5%), tiếp theo là đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33 (21,2%), các dạng đột biến còn lại dao động

3 - 15,3%

Bảng 1 Các dạng đột biến gen đã được phát hiện trên bệnh nhân

2 I172N/I172N & 656 A/C > G (IVS2

- Kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA cũng được sử dụng để phát hiện người lành mang gen bệnh, kết quả cho thấy 32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12 thành viên gia đình (anh, chị, em) được xác định có đột biến

- Phân tích phả hệ của 33 gia đình cho thấy cả 33 gia đình đều có con bị bệnh ở cùng 1 thế

hệ, trong đó 28 gia đình có 1 con bị bệnh, 5 gia đình có hai có 2 con bị bệnh (bảng 2)

Bảng 2 Kết quả phát hiện đột biến gen của các thành viên gia đình bệnh nhân

Thành viên gia đình khác

Hình ảnh minh họa một số dạng đột biến điển hình

Phả hệ của gia đình mang gen đột biến IVS2 - 13A/C > G

II

I

III

Hình 1 Kết quả đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) trên gen CYP21A2

Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid Hình ảnh giải

trình tự gen theo chiều ngược

Bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G), mẹ bệnh nhân có đột

biến dị hợp tử nên là người lành mang gen bệnh, bố bệnh nhân có hình ảnh phân tích gen giống

người bình thường nên không mang gen bệnh

Phả hệ của gia đình mang đột biến xóa đoạn

I

II

III

Hình 2 Kết quả đột biến xóa đoạn từ gen C4B đến exon 8 của gen CYP21A2

Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8, của gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron 2, và exon 10 của gen CYP21A1P; C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B; Y là đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính

Kết quả MLPA cho thấy ở bệnh nhân không thấy xuất hiện các đỉnh tương ứng với

gen C4B và các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2, vì vậy bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ gen C4B đến exon 8 của gen CYP21A2 Chiều cao đỉnh của gen C4B và các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2 ở người bố và người mẹ bệnh nhân chỉ bằng 1/2 so với chiều cao đỉnh của mẫu đối chứng;

vì vậy bố và mẹ bệnh nhân là người lành mang gen bệnh

IV BÀN LUẬN

Bằng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen,

33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện

đột biến với 7 dạng đột biến khác nhau, trong

đó đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G)

chiếm tỉ lệ cao nhất 13/33 (39,5%), tiếp theo là

đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33 (21,2%),

các dạng đột biến còn lại dao động từ 3

-15,3% Trên cơ sở các đột biến gen của

những bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng

thận bẩm sinh đã được phát hiện, nghiên cứu

tiến hành xác định trạng thái dị hợp tử cho các

thành viên gia đình bệnh nhân Kết quả cho

thấy 32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12

thành viên gia đình khác (anh, chị và em)

được xác định có đột biến Đột biến của gen

CYP21A2 đã được nghiên cứu rộng rãi ở

nhiều nước trên thế giới, cho đến nay đã có

hơn 150 đột biến khác nhau đã được báo cáo

[2, 7] Các đột biến hay gặp của gen

CYP21A2 bao gồm 656 A/C > G (IVS2 - 13A/

C > G), I172N, R356W và đột biến xóa đoạn

với các tỷ lệ khác nhau tùy từng chủng tộc

Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các

nghiên cứu trên thế giới, đột biến 656 A/C > G

(IVS2 - 13A/C > G) là dạng đột biến rất hay

gặp với tỷ lệ dao động (12 - 56%) tùy thuộc

vào từng chủng tộc [8], trong đó, tỷ lệ gặp đột

biến này ở các nước châu Á như Trung Quốc

(27%), Hồng Kong (34%), Singapor (32,7%)

[1] Nghiên cứu này phát hiện tỷ lệ đột biến

xóa đoạn cao hơn so với một số nước Một

nghiên cứu ở Brazil tiến hành xét nghiệm gen

cho 41 gia đình có người bị bệnh tăng sản

thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 -

OH nhận thấy dạng đột biến xóa đoạn là 8,1%

[9], trong đó đột biến xóa đoạn 30kb được tìm

thấy với tỷ lệ thấp ở những bệnh nhân thể mất

muối (4,5%), trong khi tỷ lệ này trong các

nghiên cứu khác tại châu Âu và châu Mỹ là

20% ở thể mất muối [3] Tần số gặp các đột

biến xóa đoạn với tần số thấp đã được báo cáo là ở Nhật (11,8%), Trung Hoa – Đài Loan (9,5%) Singapo (gốc Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia) (3,9%) [1, 10] Đột biến xóa đoạn lớn dẫn đến mất toàn bộ hoạt tính enzym do

đó sẽ dẫn đến thể lâm sàng nặng - thể cổ điển mất muối [11] Điều này hoàn toàn phù hợp với các bệnh nhân trong nghiên cứu này

Giải trình tự gen cho các thành viên gia đình số 6 của bệnh nhân mang đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) dạng đồng hợp

tử, kết quả xét nghiệm cho thấy người mẹ là người lành mang gen dị hợp tử, có cùng kiểu đột biến với bệnh nhân nhưng người bố có kết quả bình thường Bệnh nhân mang hai allen bị bệnh, trong đó một allen gây bệnh nhận từ người mẹ và một allen gây bệnh phải được nhận từ người bố, nhưng phương pháp giải trình tự gen không phát hiện được đột biến điểm ở người bố, do vậy có khả năng bệnh nhân bị đột biến xóa đoạn mới trong quá trình giảm phân hoặc người bố có mang đột biến xóa đoạn mà chưa được phát hiện

Theo tác giả White P.C chuyển đoạn gen mới thường liên quan đến đột biến Ig2, trao đổi chéo không tương xứng gây mất đoạn gen

Tần số chuyển đoạn gen theo cách thức này (1/104) phù hợp với tỷ suất chuyển đoạn gen mới ở bệnh nhân thiếu enzym 21 - OH [7]

Khả năng người bố mang đột biến xóa đoạn cần phải sử dụng phương pháp MLPA để xác định chính xác

Phát hiện đột biến gen trên bệnh nhân không những đóng vai trò quan trọng để chẩn đoán xác định bệnh, điều trị sớm tránh biến chứng cho bệnh nhân mà còn là cơ sở quan trọng để phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên trong gia đình, đặc biệt những gia đình có một con đang bị bệnh nếu

họ có kế hoạch tiếp tục sinh con thứ 2 [12]

Đây là cơ sở khoa học quan trong để chẩn

đoán trước sinh cho các mẹ, hoặc chị, em gái bệnh nhân khi mang thai, tránh sinh ra một đứa trẻ bị bệnh và có phác đồ điều trị sớm cho thai nhi khi được chẩn đoán sớm từ thời

kỳ bào thai

V KẾT LUẬN

33/33 (100%) bệnh nhân đã được phát hiện đột biến với 7 dạng đột biến khác nhau, trong đó đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C >

G) chiếm tỷ lệ cao nhất 13/33 (39,5%), tiếp theo là đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33 (21,2%)

32/33 người bố, 33/33 người mẹ và 5/12 thành viên gia đình (anh, chị, em) được xác định là người lành mang gen bệnh

Lời cảm ơn

Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu quy trình phát hiện người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

1 Angel.O.K Chan, But.M.W (2011)

Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency

in Hong Kong Chinese patients, Steroids 76,

1057 - 1062

2 Saroj N, New M I (2011) Congenital

adrenal hyperplasia due to 21 – hydroxylase

deficiency, Annals of the new york academy of

sciences, 1192, 5 - 11

3 Lee H H (2004) The chimeric CYP21P/

CYP21 gene and 21-hydroxylase deficiency,

Journal Hum Genet, 49, 65 - 72

4 Anastasovska.V, Kocova M (2010)

Detected heterozygouts during the molecular analysis of the common CYP21A2 point mutations in Macedonian patients with

con-genital adrenal hyperplasia and their relatives,

Contributions, Sec, Biol.Med.Sci, MASA,

XXXI, 2, 71 - 82

5 Baumgartner Parzer S.M, Nowotny P

et al (2004) Carrier frequency of congenital

adrenal hyperplasia (21-hydroxylase

defi-ciency) in a Middle European population, The journal of clinical Endocrinology & Metabolism,

90(2), 775 - 778

6 Tạ Thành Văn (2010) PCR và một số

kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học, 28 - 32

7 White P.C, Speiser P W (2000)

Con-genital adrenal hyperplasia due to 21-

hy-droxylase deficiency, Endocrine reviews, 21

(3), 245 - 291

8 Wilson RC, Nimkarn S, Dumic M et al, (2007), Ethnic specific distribution of mutations

in 716 patients with congenital adrenal hyper-plasia owing to 21- Hydroxylase deficiency,

Mol Genet Meta, 90(4), 414 - 421

9 Fernanda B Coeli., Fernanda C Soardi., et al (2010) Novel deletion alleles

carrying CYP21A1P/A2 chimeric genes in Bra-zilian patients with 21-hydroxylase deficiency,

BMC medical Genetics, 11, 104 - 124

10 Satomi.K, Takio.T et al (2002)

Ge-netic Analysis of Japanese Patients with 21- hydroxylase deficiency: Identification of a pa-tient with a new mutation of a homozygous deletion of adenine at codon 246 and patients without demonstrable mutation within the

structural gene for CYP21, The Journal of

clinical Endocrinology & Metabolism, 87(6),

2668 - 2673

11 Finkielstain GP, Chen W, Mehta SP, Fujimura FK et al (2011) Comprehensive

genetic analysis of 182 unrelated families with congenital adrenal hyperplasia due to

21-hydroxylase deficiency, J Clin Endocrinol

Metab, 96 (1), 161 - 172

12 Juan Tian., Guohua Yang et al

(2011) Molecular diagnosis of two families

Summary MUTATION AND CARRIER DETECTION OF CONGENITAL ADRENAL

HYPERPLASIA CAUSED BY 21 - HYDROXYLASE DEFICIENCY

Congenital adrenal hyperplasia causes by 21- hydroxylase deficiency (CAH - 21OH) is an

autosomal recessive genetic disorder due to mutation in the CYP21A2 gene The aim of this study

was to identify mutations of CYP21A2 gene in patients with CAH - 21OH and detect the carrier in

family members of CAH - 21OH patients 33 CAH - 21OH patients and 78 family members were

selected for this study; direct DNA sequencing and MLPA were used to identify the mutation and

carriers in CYP21A2 The result showed that, in the patient group, 33/33 (100%) patients were

found to have mutation in CYP21A2 gene with 7 different types of mutation and 656 A/C > G

(IVS2 - 13A/C > G) was the most common mutation with 13/33 (39.5%) and following is the

deletion mutation with 7/33 (21.2%) In the carrier group, 32/33 fathers, 33/33 mother and 5/12

siblings were identified as carrier Our results are important for prenatal diagnosis and genetic

counseling to reduce the ratio of disease and have suitable treatment for mother in initial weeks of

gestation

Keywords: congenital adrenal hyperplasia, CYP21A2 mutation, carrier

with classic congenital adrenal hyperplasia,

Gene, 05.019, 368 - 389

CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN

BẨM SINH THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE

Ngô Thị Thu Hương 1 , Trần Vân Khánh 1 , Nguyễn Phú Đạt 1 ,

Nguyễn Viết Tiến 2 , Tạ Thành Văn 1

1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2 Bệnh viện Phụ sản Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, khoảng

trên 90% gây nên do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase Việc đưa ra một phác đồ điều trị thích hợp với các bà

mẹ mang thai sẽ là giải pháp hiệu quả để để tránh được hiện tượng nam hóa đối với trẻ gái bị bệnh Nghiên

cứu này được tiến hành với mục tiêu chẩn đoán trước sinh cho các thai phụ mang gen đột biến dị hợp tử

bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA để xác

định đột biến gen ở thai nhi tuần thứ 16 của 04 thai phụ thuộc 04 gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận

bẩm sinh Kết quả cho thấy, 1 thai nhi mang đột biến dị hợp tử 656A/C > G/1763insT, 1 thai nhi mang đột

biến đồng hợp tử 2110C > T (R356W) và 2 thai nhi không mang gen đột biến gen

Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, chẩn đoán trước sinh, đột biến gen CYP21A2