Để tìm hiểu một cách có khoa học và đầy đủ về tính an toàn của thuốc HA-02 làm cơ sở cho điều trị, bài viết nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu: Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của thuốc HA-02.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP, ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA BÀI THUỐC HA-02 TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
Bùi Thanh Hà*; Trần Quốc Bảo*; Hoàng Trung Vinh* Đoàn Chí Cường*; Nguyễn Văn Chinh**
TÓM TẮT
Mục tiêu: nghiên cứu tính an toàn của thuốc HA-02 trên động vật thực nghiệm Phương pháp nghiên cứu: xác định độc tính cấp của thuốc bằng phương pháp Litchfield - Wilcoxon và xác định độc tính bán trường diễn của thuốc trên chuột nhắt trắng dòng Swiss Kết quả: chuột uống
liều 75 g/kg cân nặng không xác định được LD 50 của thuốc Với liều 5 g/kg/ngày và 60 g/ngày uống liên tục trong 15 - 30 ngày, thuốc không gây các thay đổi có ý nghĩa thống kê về số lượng hồng cầu, bạch cầu, hàm lượng hemoglobin, hoạt độ enzym SGOT, SGPT, hàm lượng ure và creatinin so với lô chứng, thuốc cũng không gây biến đổi về tổ chức học của tế bào gan, thận trên chuột nghiên cứu Kết luận: thuốc HA-02 không gây độc tính cấp cho chuột nhắt trắng và không làm thay đổi chức năng tạo máu, chức năng gan, thận của chuột thí nghiệm
* Từ khoá: Y học Cổ truyền; Thuốc thảo mộc; Bệnh tăng huyết áp; Bµi thuèc HA-02
Studying the Acute Toxicity and Semi-Chronic Toxicity of Herbal Medicines HA-02 on Experimental Animals
Summary
Objective: The research examines the safety of HA-02 drug on experimental animals Subjects and methods: The acute and semi-chronic toxicities of the HA-02 drug were evaluated on 120 mice by the Litchfield - Wilcoxon’s method on hematopoietic function, liver function and kidney Results: With doses of 75 g/kg bw, HA-02 drug LD 50 was not identified With the doses of 5 g/kg and 60 g/kg per day for 15 - 30 consecutive days drinking, HA-02 drug was not significantly changed in number of erythrocytes, leukocytes, hemoglobin concentration, activity of SGOT, SGPT, urea and creatinine levels In addition, the HA-02 drug did not cause any change in histology of liver and kidney of experimental mice Conclusion: The HA-02 drug is not toxic for mice and mice hematopoietic function, liver function and kidney function were not changed
* Key words: Traditional medicine; Herbal medicine; Hypertension; HA-02
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tăng huyết áp (THA) là bệnh nguy hiểm cã
tỷ lệ tử vong cao và để lại những di chứng
nặng nề như tai biến mạch máu não, nhồi
máu cơ tim ảnh hưởng đến cuộc sống của người bệnh và trở thành gánh nặng kinh tế cho gia đình người bệnh và xã hội
* Bệnh viện Quân y 103
** Bệnh viện Quân y 105
Người phản hồi (Corresponding): Bùi Thanh Hà (buitha103@gmail.com)
Ngày nhận bài: 05/02/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2015
Ngày bài báo được đăng: 31/03/2015
Trang 2Nghiên cứu tìm hiểu cơ chế bệnh sinh
và phát triển các loại thuốc có hiệu quả
trong điều trị THA và các biến chứng của
THA được nhiều nhà khoa học trong nước
và trên thế giới quan tâm từ lâu và hiện
vẫn là vấn đề vô cùng cấp thiết
Thực hiện phương châm kết hợp hai
nền y học, Bộ môn - Khoa Y học Cổ truyền,
Bệnh viện Quân y 103 trên cơ sở biện chứng
luận trị theo lý luận của Y học Cổ truyền
(YHCT) về nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh
của bệnh THA, đồng thời vận dụng kết
quả nghiên cứu theo y học hiện đại về tác
dụng dược lý của từng vị thuốc đã xây
dựng bài thuốc “HA-02” gồm 15 vị thuốc
đông dược để điều trị bệnh THA Bài thuốc
có tác dụng bình can tiềm dương, tư bổ can
thận âm, hoạt huyết, trừ đàm và lợi thủy
Để tìm hiểu một cách có khoa học và đầy
đủ về tính an toàn của thuốc HA-02 làm cơ
sở cho điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài
này với mục tiêu: Xác định độc tính cấp và
độc tính bán trường diễn của thuốc HA-02
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu, phương tiện và đối
tượng nghiên cứu
* Nguyên liệu nghiên cứu:
- Công thức bài thuốc HA-02:
Thạch quyết minh (Concha haliotidis)
20 g, Câu đằng (Ramulus cum uncariae uncis)
20 g, Thiên ma (Rhizoma gastrodiae) 15 g,
Bạch thược (Radix paconiae alba) 15 g,
Đương quy (Radix angelicae sinensis)
15 g, Xuyên khung (Rhizoma chuanxiong)
12 g, Ngưu tất (Radix achyranthis bidentatae)
12 g, Đại hoàng (Rhizoma rhei) 6 g, Trạch tả
(Rhizoma alismatis) 12 g, Ích m ẫu (Herba
leonuri) 20 g, Bình vôi (Stephania glabra)
12 g, Đỗ trọng (Cortex eucommiae) 15 g,
Chỉ xác (Fructus citri aurantii) 15 g, Tang ký
sinh (Ramulus lorantoran parasiticus) 15 g, Đan sâm (Radix salviae militiorrhizae) 20 g
- Dạng thuốc sử dụng: cao đặc tỷ lệ 2/1
- Thuốc được bào chế tại Xí nghiệp
viện Quân y 103 cung cấp
* Phương tiện và trang thiết bị dùng trong nghiên cứu:
Máy xét nghiệm huyết học tự động Coulter LH 780, máy xét nghiệm sinh hóa
tự động AU5800 (Hãng Beckman Coulter), kính hiển vi
* Đối tượng nghiên cứu:
Chuột nhắt trắng dòng Swiss, trọng lượng
20 ± 5 g/con: 120 con do Ban Cung cÊp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y cung cấp, được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm của Khoa Sinh lý, Học viện Quân y,
ăn theo tiêu chuẩn động vật nghiên cứu, uống nước (đun sôi để nguội) tự do
2 Phương pháp nghiên cứu
* Thử độc tính cấp:
Thực hiện tại Khoa Sinh lý, Học viện Quân y theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon, quy định của WHO và Quy chế Đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc
Trước khi cho uống thuốc, chuột bị bỏ đói trong 18 giờ Chia ngẫu nhiên chuột thành 6 lô, mỗi lô 10 con Lô chứng uống nước cất, các lô thử uống thuốc với mức liều 15 g, 30 g, 45 g, 60 g, 75 g/kg thể trọng Mỗi chuột uống 3 giờ/lần x 3 lần/24 giờ Nước cất và thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù với cùng thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng chuột/lần
Trang 3Theo dõi tình trạng chung và số lượng
chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ Tìm liều
cao nhất chuột không chết và liều thấp
nhất gây chết 100% Tiếp tục theo dõi
tình trạng chung của chuột đến hết ngày
thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu
* Thử độc tính bán trường diễn:
Thực hiện tại Khoa Sinh lý, Học viện
Quân y theo phương pháp Abraham, quy
định của WHO và Quy chế Đánh giá tính
an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền của
Bộ Y tế [1, 3, 4]
Chia 60 chuột làm 3 lô, mỗi lô 20 con:
lô chứng: uống nước cất; lô thử 1: uống
thuốc HA-02, liều 5 g/kg/ngày (tương đương
với liều dùng trên người); lô thử 2: uống
thuốc HA-02, liều 60 g/kg/ngày (gấp 12
lần liều dùng trên người) Nước cất và
thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày
chuột bằng kim cong đầu tù vào các buổi
sáng từ 8 - 10 giờ, 1 lần/ngày với cùng
thể tích 0,2 ml/10 g thể trọng, uống liên
tục trong 30 ngày
Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu: tình trạng chung, thể trạng chuột Đánh giá chức năng tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng một số enzym: SGOT, SGPT Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng ure, creatinin trong huyết tương chuột bằng phương pháp quang động học đo hoạt tính enzym theo khuyến cáo của Hội Hóa sinh lâm sàng Quốc tế Các thông số theo dõi được kiểm tra trước khi uống thuốc, sau 15 ngày và 30 ngày uống thuốc
- Mô bệnh học: sau 30 ngày uống thuốc, mổ chuột quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan Kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan thận của 50% chuột ở mỗi
lô Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Bộ môn - Khoa Giải phẫu bệnh và Pháp y, Bệnh viện Quân y 103
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Thử độc tính cấp (LD 50 ) của thuốc HA-02
Bảng 1: Độc tính cấp của thuốc HA-02
THỂ TÍCH CHO UỐNG
SỐ CHUỘT SỐNG/CHẾT SAU
72 GIỜ
Sau 72 giờ uống thuốc, ở lô chứng và lô thử với liều tõ 15 - 45 g/kg cân nặng, chuột hoạt động và ăn uống bình thường, không bị khó thở, đi ngoài phân khô Ở liều cao
60 - 75 g/kg cân nặng, hoạt động của chuột giảm, nhưng không có hiện tượng bỏ ăn
Trang 4hoặc khó thở Không có chuột nào chết trong thời gian theo dõi, do đó chưa xác định
2 Thử độc tính bán trường diễn của thuốc HA-02
* Tình trạng chuột:
Trong 30 ngày thí nghiệm, chuột ở các nhóm đều hoạt động bình thường, nhanh nhẹn,
ăn uống tốt, phân khô, lông mượt, không có chuột bị chết hoặc có biểu hiện bất thường
* Ảnh hưởng của thuốc đến phát triển trọng lượng chuột:
Bảng 2: Trọng lượng chuột trước và sau uống thuốc
p 1-2 > 0,05
p 1-3 > 0,05
p 2-3 > 0,05
So sánh trọng lượng cơ thể chuột ở 2 lô dùng thuốc HA-02 với lô đối chứng sinh học tại các thời điểm thấy thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) So sánh giữa các thời điểm sau so với trước thấy trọng lượng cơ thể chuột ở 3 lô đều tăng, sự thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Chứng tỏ thuốc HA-02 ở cả 2 mức liều không ảnh hưởng đến phát triển cân nặng bình thường của chuột
* Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng tạo máu chuột:
Bảng 3: Chỉ số huyết học của chuột sau thí nghiệm
KẾT QUẢ (n = 10)
Hồng cầu (T/l)
N 30 (b) 6,9 ± 2,4 5,6 ± 1,5 6,44 ± 1,65
p a-b > 0,05
Bạch cầu (G/l)
p a-b > 0,05
Hemoglobin (g/l)
N 15 (a) 11,6 ± 1,0 11,4 ± 1,34 10,7 ± 1,14
N 30 (b) 12,3 ± 0,5 12,5 ± 0,8 10,9 ± 1,13
p a-b > 0,05
Trang 5Tiểu cầu
(G/l)
p a-b > 0,05
So sánh trong từng lô giữa các thời điểm và giữa các lô ở cùng một thời điểm thấy,
số lượng hồng cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin thay đổi không có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05) giữa nhóm chứng và nhóm nghiên cứu
Như vậy, thuốc HA-02 cho chuột uống liên tục trong thời gian 15 ngày và 30 ngày ở
cả 2 mức liều không ảnh hưởng tới số lượng hồng cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin Chứng tỏ thuốc an toàn với chức năng tạo máu khi dùng kéo dài
* Ảnh hưởng của thuốc đến chức năng gan, thận chuột:
Bảng 4: Các chỉ số sinh hóa máu của chuột sau thí nghiệm
Ure (mmol/l)
N 15 (a) 6,1 ± 1,1 6,1 ± 1,44 4,9 ± 1,11
p a-b > 0,05
Creatinin (mmol/l)
N 15 (a) 32,7 ± 13,0 27,6 ± 6,63 32 ± 7,4
p a-b > 0,05
SGOT (u/l)
N 15 (a) 27,3 ± 5,65 25,2 ± 7,04 28,8 ± 7,2
p a-b > 0,05
SGPT (u/l)
N 15 (a) 4,9 ± 1,7 4,88 ± 1,35 4,4 ± 1,3
p a-b > 0,05
So sánh trong từng lô giữa các thời điểm và giữa các lô ở cùng một thời điểm thấy, nồng độ ure, creatinin, SGOT, SGPT thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Như vậy, thuốc HA-02 cho chuột uống liên tục trong thời gian 15 ngày và 30 ngày ở
cả 2 mức liều không ảnh hưởng tới nồng độ ure, creatinin, SGOT, SGPT trong máu chuột Chứng tỏ thuốc an toàn đối với chức năng gan, thận khi dùng kéo dài
* Ảnh hưởng của thuốc đến mô bệnh học gan, thận chuột:
- Quan sát đại thể: sau khi mổ chuột, quan sát thấy các tổ chức gan, thận, tim, phổi,
hệ thống tiêu hóa của chuột ở lô chứng và 2 lô dùng thuốc đều bình thường, không có biểu hiện xung huyết hay dấu hiệu bị tổn thương
Trang 6- Quan sát mô bệnh học:
Chứng (chuột 01CH-G) Thuốc 1 (chuột 01Th 1 -G) Thuốc 2 (chuột 01Th 2 -G)
Hình 1: Hình ảnh mô bệnh học gan chuột
Chứng (chuột 01Ch-T) Thuốc 1 (chuột 02Th 1 -T) Thuốc 2 (chuột 01Th 2 -T)
Hình 2: Hình ảnh mô bệnh học thận chuột
+ Mẫu chứng: các bè gan và tiểu thùy
gan không thay đổi về cấu trúc Tế bào
gan không bị tổn thương thoái hóa, không
có xâm nhập viêm Cuộn mạch của tiểu
cầu thận có cấu trúc bình thường, các tế
bào nội mô của cuộn mạch nhỏ và đều
nhau Khoang Bowman rõ Các tế bào ống
thận đều nhau, rõ cấu trúc, tế bào biểu mô
ống thận bình thường Khe thận hẹp Mao
mạch máu thành mỏng, tế bào nội mô rõ
Không phát hiện thấy hình ảnh bệnh lý
+ Mẫu thử (liều 1 và liều 2): các thùy gan và bè gan không thay đổi về cấu trúc
Tế bào gan không có tổn thương thoái hóa Tĩnh mạch trung tâm không giãn, không xung huyết, khoảng cửa không có xâm nhập viêm Cấu trúc vùng vỏ, vùng tủy cầu thận bình thường, không thấy hình ảnh tổn thương
Như vậy, thuốc HA-02 dùng đường uống liên tục trong 30 ngày không gây tổn thương trên gan, thận của chuột
Trang 7KẾT LUẬN
- Độc tính cấp: với liều 75 g/kg cân nặng,
không thấy có biểu hiện độc cấp tính của
thuốc HA-02 trên chuột nhắt trắng Chưa
bằng đường uống theo phương pháp
Litchfield - Wilcoxon
- Độc tính bán trường diễn: với liều
5 g/kg/ngày và 60 g/kg/ngày (gấp 12 lần
liều dùng trên người) uống liên tục trong
30 ngày, thuốc HA-02 không ảnh hưởng
đến sự phát triển trọng lượng chuột, không
biến đổi các chỉ số huyết học như hồng
cầu, tiểu cầu và hàm lượng hemoglobin,
chỉ số chức năng gan (SGOT, SGPT), chức
năng thận (ure, creatinin) trong giới hạn
bình thường Thuốc HA-02 cũng không gây biến đổi về tổ chức học của mô gan, thận trên chuột nghiên cứu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y tế Quy chế Đánh giá tính an toàn
và hiệu lực thuốc Cổ truyền Quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 1996
2 Đỗ Trung Đàm Phương pháp xác định
độc tính cấp của thuốc NXB Y học 2006
3 Abrham WB Techniques of animal and
clinical toxicology Med Pub Chicago 1978, pp.55-68
4 Turner A Screeningmethodsinpharmacology
Academic Press New York and London 1965, pp.60-68.